Protocol
1. Planting
- Fyll plug skuffer (128 celle, 28 x 54 cm med celler 3 cm kvadrat og 5 cm dype) med plugg jord blanding. Til hjelp i uniform fylling av celler komprimere jord i hver skuff ved hjelp av en tom pluggbrett.
- Plante salat frø ¼ tomme i dybden 2-3 frø per celle. Plant alle eksperimentelle linjer i replikert skuffer for å gi både en tørke stresset og kontroll skuffer for tørken rettssaken.
- Plassere plug skuffer inn en base skuffen uten hull.
- Vannmagasiner og dekselet med invertert skuff eller plast kuppel. Spiring skjer normalt i 48-72 timer. Etter spiring ta av dekselet og flytte skuffer i drivhus.
NB: Denne protokoll kan også utføres i vekstkamre.
2. Vekst og Plant Care
- Vannmagasiner som trengs fra 1-4 uker etter spiring, normalt er dette 2-3 ganger ukentlig, ved å fylle nedre skuffen og la jord å bli mettet (~ 1 time) stråler for å sitte for lengre periodes i vann som dette kan innvirke negativt plantehelse og rot utvikling og kan påvirke tørke skjermen.
- Gjødsle skuffer gang i uken med en kommersiell løselig 20-20-20 gjødsel blandet med en hastighet på 1,5 ts / gal.
- Tynne skuffer til ett anlegg per celle 1-2 uker etter spiring.
3. Starte tørkestress
- Når plantene er fire uker gamle separate magasiner i to grupper. Lagt én gruppe til alvorlig vannstress. Bruk de andre skuffene så vel vannes kontroller. Vann kontrollgruppen som i trinn 2.1 i løpet av eksperimentet. Ved oppstart av tørkestress suspendere gjødsling alle skuffer for resten av forsøket.
- Den eksperimentelle tørkeperiode skjer over en uke. På den første dagen av tørkestress rettssaken (dag 0) fylle alle lavere skuffer med vann og la jorda i plug skuffer å bli helt mettet deretter tappe vann fra magasinene. Mette jorden umiddelbart før initieringen av than stressperiode vil bidra til å minimere eventuelle variasjoner i jordfuktighet mellom enkeltceller i pluggbrett.
4. Gjennomføring Basic Tørke Stress Screen med Parametere som skal Målt
MERK: Følgende fremgangsmåte beskriver hvordan å samle de tre fysiologiske målinger som vil bli spilt inn i løpet av tørken skjermen mens Tabell 1 gir en oversikt over de målinger tatt på hver dag av tørken-stress-prøveperiode.
- Mål Leaf Relativ Vanninnhold (RWC) på dag 0, 2, 4 av rettssaken.
- Klipp en salat plante fra skuffen og fjerne to blader.
- Punch 3 plater fra hvert blad ved hjelp av en # 9 korkbor (~ 1,6 cm diameter). Kombiner blad slag som én prøve.
- Veie blad plater, er dette den ferskvekt (FW) verdien som brukes for RWC beregningen, deretter plassere skivene i en petriskål.
- Legg akkurat nok Destillert vann til plate til alleow alle blad plater for å flyte. Dette er å fullt hydrat bladet plater for å samle turgid vekter for RWC analyse. Tillate bladplater til å flyte i 24 timer ved romtemperatur.
- Fjern de nå fullt hydrerte blad plater fra platene og forsiktig tørke utsiden av bladet plater med tørkepapir før veiing av plater. Spill disse vektene som pompøst vekt (TW) for RWC beregningen.
- Sted blad plater på et papir lab tørker eller filterpapirskive i en åpen petriskål og tørk i inkubator ved 55 ° C i 24 timer.
MERK: Papiret hindrer bladet plater fra å følge petriskålen under tørking. - Veie tørre blad plater og plate som tørre vekter (DW) for RWC beregning.
- Beregne RWC hjelp Weatherley formel som beskrevet av Smart og Bingham 11,12.
RWC = (FW-DW / TW-DW) * 100
FW = fersk vekt, TW = pompøst vekt, DW = tørrvekt - Gjenta trinn 4.1 for hver genmateriale og behandling i rettssaken.
- Spill anlegget vil! En gang daglig på dag 1 begynnelsen av tørkestress prøving og slutter når 100% av plantene visnet, normalt dag 4 eller 5.
- Restitusjonsfasen og vekst differensial
- På dag 6, konkluderer tørken-stresset periode og stresset plantene inn restitusjonsfasen av rettssaken. Fyll nedre skuffer med vann og la de tørke-stresset skuffer å suge i 24 timer før du gjenopptar standard vanning tidsplan, trinn 2.1, som kontroll skuffer.
- Tillate alle planter å gjenopprette i 10 dager.
- På 10 dager etter tørke stresse høste hele over bakken del av hver plante og spille inn den friske vekt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Når det utføres en stor skjerm for å skille en populasjon av den ønskede forsøks egenskap, i tilfelle av denne protokollen tørke-stressrespons, de data som genereres, vil tilsvarende varieres fra meget reke utsatt for sannsynlig tørke-tolerant, og alle punktene i mellom. Figur 1 viser kurver som representerer typen av resultater som kan forventes fra denne protokollen. Representative sortar av tre forskjellige typer salat (romersk (cos), crisphead, og butter) er inkludert i dataene som vises. Mens data som representerer bare tre salattyper er vist her denne protokollen ble utviklet i løpet av screening av tusenvis av salat og spinat genmateriale tvers av de fleste typer. I tillegg til de tre typer salat tidligere nevnt denne protokoll ble med hell anvendt for å screene rødt og grønt blad og stilk typen salat sammen med genmateriale fra nær beslektede Lactuca serriola arter så vel som urelatert leafy grønne grønnsaker spinat. Forfatterne brukte data generert ved hjelp av denne protokollen til å begrense en salat samling på over 4000 til en kandidat pool av 200 salatsorter for feltforsøk.
Figur 1. Representative Resultater Viste data er representative for de tre fysiologiske målinger som inngår i denne protokollen for tre salattyper, inkludert romano (cos, ROM), crisphead (CRSP), og butter (MEN). (A) Andelen av planter som er visnet på hver dag av tørken-stressperiode på rettssaken, som starter på dag 1, blir registrert før alle plantene nå 100% visnet. (B) Leaf relative vanninnholdet måles på dag 0, 2, og 4. -D : tørke-stress, -C:. kontroll (C) Vekt av planter etter tørke-stresset periode og 10 dagers utvinning som viser vekst differensial grunntørke-stress. Feilfelt representerer standardavvik. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Representative skuffer og eksempel planting diagrammer (A og B) Eksempel skuffer viser tørke-stressrespons på dag 3 av en rettssak bruke denne protokollen i forhold til kontroll skuffer. (C og D) Disse brettdiagrammer representerer de 128 plug skuffer som brukes viser to planting metoder benyttes i denne protokollen. De ytre kanter av brettene (grå skraverte celler) skal plantes, men ikke anvendt for eksperimentelle prøver, på grunn av tilbøyeligheten av cellene kant å tørke raskere enn innvendige celler.
| Dag | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| RWC-FW | X | X | X | ||||
| Wilt | X | X | X | X | (X) | (X) | |
| Holde tilbake vann | X | ||||||
| Gjenoppta vanning | X |
Tabell 1. Tidsplan av tørke-stressperiode. Vann er unndratt fra den eksperimentelleskuffer begynner på dag 0 av rettssaken og vanning CVer på dag 6. Ferske prøver for blad relative vanninnhold målinger er tatt på dag 0, 2, 4, og andelen av planter visnet registreres daglig med start på dag 1 og fortsetter inntil 100 % av planter er visnet, vanligvis dag 4, men kan utvides til dag 5 eller 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Betraktninger av prøvenummer for skjermen.
Antall prøver som trengs bør være basert på ønsket bruk av data fra denne skjermen. Hvis publisering kvalitet resultater er ønsket, anbefales det å høste tre individuelle planter (3 biologiske replikat) fra hver linje og utføre et minimum av to eksperimentelle replikater for å gi tilstrekkelig poeng for kvalitet statistisk analyse. Hvis det ønskede resultatet er ganske enkelt å raskt å begrense en stor pool av kandidat genmateriale for å utføre strengere eller komplekse vann-stress eksperimenter, mindre prøver og eller gjentak kan være nødvendig. Antall prøver som kreves må avgjøres på tidspunktet for planting.
Planting layout og hensynet til jord tørking i skuffene.
En svært viktig faktor er at jorda i cellene på kanten av pluggen brettet vil tørke raskere enn interiør celler og omsorgbør tas for å unngå skjevhet i resultatene etter bare høste planter fra skuffen interiør (figur 2). Bare høste planter fra de indre cellene vil sannsynligvis påvirke planting layout av skuffen. Under skjermen der denne protokollen ble utviklet mellom 3 og 6 unike genmateriale ble plantet per plugg brett sammen med en kontroll salat sorten. En av utfordringene ved screening for tørke toleranse i en spesialitet avling er ofte det finnes ingen vet stresstoleranse eller utsatt genmateriale å bruke som positive eller negative kontroller. Når ingen positiv eller negativ kontroll er tilgjengelig som i utviklingen av denne fremgangsmåte ved bruk av en standard genmateriale i alle forsøkene gir en grunnleggende nivå av intern kontroll for variasjon av forhold gjennom hver skjerm. Antallet forskjellige genmateriale som kan plantes vil direkte bidra til hastigheten ved hvilken en genmateriale samling kan screenes, men er begrenset av antall planter som er nødvendig for each måling tatt i løpet av rettssaken. Ved å begrense antall unike genmateriale i hver skuff til mellom 3 og 6 alle salat kan plantes i to steder i hver skuff sikre at ingen salat er plantet i bare utvendige celler. Et annet hensyn er at variasjon i vekst og plantestørrelse blant genmateriale kan føre til reduserte priser av jord tørking i celler som inneholder små varianter. Dette kan potensielt skjevhet resultater i retning av små varianter være overrepresentert blant potensielle tørke-tolerant genmateriale trukket fra denne skjermen, men dette synes ikke å være tilfelle basert på de observerte resultatene. Videre bør bruk av strenge sekundære metoder for å studere kandidaten genmateriale fra denne protokollen enten bekrefte eller avkrefte disse resultatene.
Viktigheten av konsistens på observasjon av wilt.
Overvåkingen av planter for wilt bør utføres på sammegang daglig for å unngå små variasjoner i utseendet av plante stress, observert som vil, sannsynligvis forårsaket av temperatur- og fuktighetsvariasjoner som foreligger i et drivhus, så vel som regulering av døgnrytmen stomata. Sørg også for å være konsekvent når scoring planter som visnet eller ikke. Etablering av et sett med retningslinjer i scoring wilt er spesielt viktig hvis flere personer skal opptre på skjermen for å oppnå best mulig resultat. Terskelen brukes for denne protokollen er alle bladene på planten må være visnet å score anlegget som blir visnet.
Valg av parametere målt.
Parametrene som måles i denne protokollen ble valgt på grunnlag av deres nytte i å identifisere vannstress sammen med tilpasning av målingene til en semi-høy gjennomstrømming system utnytte minimal tilgjengelig arbeidskraft. Mange andre målinger kan være svært nyttig for å identifisere tørke-stress (f.eks., Fotosynteseaktivitet, Rotvekst, stomatal konduktans ...), og basert på arten av den skjerm som skal utføres (dvs. antall genmateriale benyttes, antall replikater, frekvensen av gjennomstrømning ønskede ...) andre parametre kan lett bli inkorporert i dette skjermbildet.
Innspill om bruk av protokoll resultater.
USDA samlinger inneholder over 4000 individuelle salat genmateriale som er et tall som gjør feltforsøk som omfatter alle genmateriale upraktisk. Denne protokollen ble utviklet med lone formål at et svært lite antall forskere (1-2 personer) for å skjerme USDA samlinger for potensiell tørke toleranse. Gjennom bruk av disse metodene USDA samlingen ble redusert til 200 varianter som så ble brukt i feltforsøk som kan nærmere replikere tørke-stress forhold. Denne protokollen ble også brukt til å begrense en befolkning på over 400 spinat genmateriale til 40 for bruk i felt trials. Denne protokollen alene bør ikke anses tilstrekkelig til å identifisere seg med en høy grad av sikkerhet genmateriale som inneholder holdbar tørke-toleranse under felt vann-stress forhold, men kan rett og slett være et verktøy for å raskt screene for potensielle stresstoleranse under vann underskudd forhold i en rask og effektiv skjerm utnytte et stort antall genmateriale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| plug tray 128 | T.O. Plastics Hummert International |
11-8595-1 | Any brand plug tray will work, but use the same style of trays for all trials. |
| lower tray (Display tray) | T.O. Plastics Hummert International |
11-3305-1 | |
| plug/planting mix (Sunshine Mix #5) | Sunshine Hummert International |
10-0467-1 | A different mix may need to be substituted if adapting this protocol to a different crop. Sunshine mix #4 was used in spinach trials. |
| fertilizer (20-20-20) | Jack's: Professional water-soluble fertilizer Hummert International |
07-5915-1 | Any fertilizer can be used, adjust type as needed for adapting this protocol to specific crop needs. |
References
- Dijk, A. I. J. M., et al. The Millennium Drought in southeast Australia (2001–2009): Natural and human causes and implications for water resources, ecosystems, economy, and society. Water Resour. Res. 49, (2013).
- Aghakouchak, A., Feldman, D., Stewardson, M. J., Saphores, J., Grant, S., Sanders, B. Australia’s Drought: Lessons for California. Science. 343, 1430 (2014).
- Tolomeo, V. California Agricultural Statistics 2012 Crop Year. USDA National Agricultural Statistics Service Pacific Regional Office-California. , http://www.nass.usda.gov/Statistics_by_State/California/Publications/California_Ag_Statistics/Reports/2012cas-all.pdf (2013).
- Cavagnaro, T., et al. Climate Change: Challenges and Solutions for California Agricultural Landscapes. White paper CEC-500-2005-189-SF. California Climate Change Center. , Available from: http://www.energy.ca.gov/2005publications/CEC-500-2005-189/CEC-500-2005-189-SF.PDF (2005).
- Lobell, D. B., Gourdji, S. M. The Influence of Climate Change on Global Crop Productivity. Plant Physiol. 160, 1686-1697 (2012).
- Jackson, L. E., Stivers, L. J. Root distribution of lettuce under commercial production: implications for crop uptake of nitrogen. Biological Agriculture and Horticulture. 9, 273-293 (1993).
- Jackson, L. E. Root architecture in cultivated and wild lettuce (Lactuca spp). Plant. Cell and Environment. 18, 885-897 (1995).
- Malcom, S., Marshall, E., Aillery, M., Heisey, P., Livingston, M., Day-Rubenstein, K. Agricultural Adaptation to a Changing Climate: Economic and Environmental Implications Vary by U.S Region. USDA Economic Research Service. Economic Research Report Number. 136, Available from: http://www.ers.usda.gov/media/848748/err136.pdf (2012).
- Chaves, M. M., Maroco, J. P., Pereira, J. S. Understanding plant responses to drought- from genes to the whole plant. Funct. Plant Biol. 30, 239-264 (2003).
- Ingram, J., Bartels, D. The Molecular Basis of Dehydration Tolerance in Plants. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 47, 377-403 (1996).
- Weatherley, P. E. Studies in the water relations of the cotton plant. I. The field measurement of water deficits in leaves. New Phlytol. 49, 81-97 (1950).
- Smart, R. E., Bingham, G. E. Rapid Estimates of Relative Water Content. Plant Physiol. 53, 258-260 (1974).
