Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

ترنسفكأيشن، اختيار، ومستعمرة قطف من صنع الإنسان المحفزة الخلايا الجذعية TALEN المستهدفة مع جين GFP في AAVS1 الملاذ الآمن

Published: February 1, 2015 doi: 10.3791/52504
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1National Institute of Arthritis, Musculoskeletal and Skin Diseases, National Institutes of Health, 2Q Therapeutics

Introduction

اكتشفت القدرة على إعادة برمجة الخلايا الجسدية الإنسان في الجذعية الجنينية التي يسببها الخلايا الجذعية المحفزة تشبه الخلايا (iPSCs) أول من تاكاهاشي آخرون في عام 2007 1. الليفية الجلدية الإنسان transduced مع الفيروسات القهقرية معربا عن أربعة عوامل النسخ (وياماناكا ذلك يطلق عليها اسم العوامل Oct3 / 4، Sox2، عرضت ج. Myc على، وKlf4) لتكون مشابهة إلى حد كبير للخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) على أساس التشكل، والانتشار، والتعبير الجيني، وحالة جينية. بشكل حاسم، iPSCs هي أيضا قادرة على التفريق في الخلايا من جميع الطبقات الجرثومية الثلاث 1. القدرة التكاثري المحتملة والتفريق بين iPSCs يجعلها أدوات جذابة للغاية. عن طريق إعادة برمجة الخلايا من المرضى الذين يعانون من أمراض معينة، يمكن استخدام iPSCs على حد سواء كما نظم في المختبر نموذج المرض والعلاجات كما المحتملة.

لغرض الأخير، يجب أن تعالج العديد من القضايا قبل الإمكانات الكاملة للiPSCsفي عملية إعداد سريرية يمكن أن تتحقق. إمكانيات مكون للأورام في المختبر hESCs مثقف وiPSCs، واستخدام المشتقات xenogenic خلال إعادة برمجة وصيانة الخلايا، والحاجة لتتبع الخلايا المزروعة في الجسم الحي كلها عقبات حاسمة إلى التطبيق السريري من الخلايا الجذعية المحفزة (التعليق بواسطة Hentze آخرون في. 2). سيكون حلا مثاليا للحاجة لتتبع خلايا متمايزة في مرحلة ما بعد زرع ينطوي على علامة للكشف بصريا أن يقاوم إسكات وتلون بغض النظر عن التطبيق. التعبير القوي والمستدام من الجينات المحورة المتكاملة هو الأكثر بسهولة يمكن تحقيقه عندما يتم إدخال الحمض النووي الخارجية إلى ميناء آمن مواضع. وهذا هو، مواقع الجينومية التي تمكن النسخ كاف من متجه متكامل، وفي الوقت نفسه تخفيف الاضطرابات التعبير في الجينات المجاورة 3. واحد موقع من هذه المواقع التي تميزت بشكل جيد جدا منذ اكتشافه هو integr فيروس الغدة المرتبطةالموقع أوجه 1 (AAVS1)، في إنترون الأول من بروتين الفوسفاتيز 1 التنظيمي فرعية 12C (PPP1R12C) الجين. وقد تبين هذا الموضع ليس فقط أن يسمح لحقت والتعبير القوي من الجينات المحورة المتكاملة من خلال تمديد الوقت في الثقافة والتمايز في المختبر 3، ولكن أيضا لحماية المحيطة الجينات من اضطراب النسخي 4؛ ويعتقد أن كل من الميزات أن ذلك يعود إلى وجود عناصر داخلية عازل لونين المرافقة الموقع AAVS1 5.

التقدم في الأدوات الهندسية الجينوم ما يزيد قليلا على مدى العقد الماضي قد سهلت كثيرا من السهولة والكفاءة التي يمكن تحقيقها التلاعب الجيني في أي نوع من الخلايا. بينما اعتمدت التجارب الناجحة الأولى على مستويات منخفضة جدا من إعادة التركيب مثلي الذاتية (HR) مع الجهات المانحة التي أدخلت على تحقيق استهداف الجينات في المجالس الاقتصادية والاجتماعية 6،7، واستخدام nucleases في مواقع محددة، مثل nucleases إصبع الزنك (ZFNs)، أن significantly لحث على إعادة التركيب مثلي من خلال توليد استراحة DNA المزدوج تقطعت بهم السبل وزيادة كبيرة في كفاءة مثل هذه التجارب 8،9. جعلت تطويعها لأغراض أخرى كل النسخ مثل المنشط المستجيبات (حكايات) من النباتات المسببة للأمراض زانثوموناس جنسا وبدائية النواة تتجمع interspaced بانتظام يكرر المتناوب قصيرة (كريسبر) / نظام Cas9 إلى كفاءة مصمم nucleases في مواقع محددة استهداف الجينات في الخلايا الجذعية المحفزة على الوصول إليها و منهجية العملية 10-13.

ووصفت ورقة الأخيرة وسيلة فعالة لتحقيق التكامل مستقر من الأخضر الفلورسنت مراسل الكاسيت في AAVS1 آمن الميناء مكان في iPSCs الإنسان باستخدام nucleases حكاية (TALENs) 14. حافظت هذه iPSCs استهدفت مضان حتى بعد التمايز الموجهة إلى العضلية وزرع في نموذج الفأر من احتشاء عضلة القلب (MI)، وتوفير أدلة قوية لفائدة مثلثابت المحفزة الفلورسنت الخلايا الجذعية 14. للحصول على المستعمرات المستهدفة، تم استخدام طريقة الجينات فخ فيه على الربط-متقبل (SA)، 2A-الشق الذاتي تسلسل الببتيد يضع بوروميسين N-أسيتيل ترانسفيراز (PAC) الجينات تحت سيطرة PPP1R12C المروج الذاتية. وبالتالي، iPSCs فقط التي أدرجت المتبرع DNA في موضع AAVS1 تعبر عن PAC، مما يجعلها اختيار على أساس بوروميسين المقاومة. (الشكل 1، 15). تفاصيل هذا البروتوكول إجراءات لتوليد AAVS1-GFP iPSCs ذكرت في الورقة الأخيرة 14، بما في ذلك عملية transfecting iPSCs مع TALENs والجهات المانحة 9.8 كيلوبايت لدمج جزء DNA 4.2kb في موضع AAVS1 آمن الميناء، واختيار iPSCs على أساس بوروميسين المقاومة، واختيار المستعمرات للتوسع نسيلي. التقنيات الموضحة في هذه الوثيقة يمكن تطبيقها على العديد من التجارب الهندسة الجينوم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد مصفوفة الغشاء القاعدي وطلاء بلستيكور

  1. وضع الغشاء القاعدي الأسهم مصفوفة المجمدة من -20 ° C على الجليد وذوبان الجليد بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  2. بعد ذوبان الجليد، مأخوذة ماصة 2 ملغ من الطابق السفلي مصفوفة الغشاء في أنابيب إيبندورف قبل المبردة. تخزين هذه في -20 ° C لحين الحاجة إليها.
  3. لإعداد الغشاء القاعدي لوحات المغلفة المصفوفة، ذوبان الجليد قسامة واحد على الجليد حتى آخر قطعة من الجليد في يختفي أنبوب إيبندورف (عادة في غضون ~ 2 ساعة).
  4. بعد ذوبان الجليد، إضافة مصفوفة الغشاء القاعدي إلى 12 مل من البرد (4 ° C) DMEM / F12 لجعل الغشاء القاعدي حل مصفوفة الطلاء.
  5. إضافة الغشاء القاعدي حل مصفوفة لسفينة الثقافة المناسبة. لوحة 6 جيدا، الاستغناء 1 مل لكل بئر. دوامة لوحة للتأكد من حل مصفوفة الغشاء القاعدي يغطي تماما كل بئر.
  6. بارافيلم ختم الغشاء القاعدي المغلفة مصفوفة لوحة / طبق، واحتضان عند رودرجة حرارة م لمدة 1 ساعة قبل الاستخدام. بدلا من ذلك، متجر الغشاء القاعدي لوحات المغلفة مصفوفة / أطباق في 4 درجات مئوية، وتستخدم في حدود 2 أسابيع من الطلاء.
    ملاحظة: إضافة DMEM إضافية / F12 إلى الغشاء القاعدي المغلفة مصفوفة لوحة / طبق لمنع جفاف. قبل استخدام 4 ° C الغشاء القاعدي المخزنة المغلفة مصفوفة لوحة / طبق، وضعه في خزانة السلامة البيولوجية والسماح لها أن تأتي إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل.
  7. نضح مصفوفة الغشاء القاعدي تماما قبل إضافة المتوسطة والخلايا.

2. إعداد E8 المتوسطة

  1. إعداد E8 مستنبت من قبل ذوبان E8 تكملة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  2. إزالة 10 مل من E8 المتوسطة القاعدية من الأسهم 500 مل وتجاهل.
  3. ماصة كامل 10 مل قارورة من E8 تكملة مباشرة في 490 مل من E8 المتوسطة القاعدية. لا الدافئ الكامل المتوسطة E8 في حمام مائي 37 ° C، والتقلبات في درجات الحرارة المتكررة يمكن أن تتحلل في bFGF في مجمعاتالشركة المصرية للاتصالات E8 المتوسطة.
  4. استخدام كامل المتوسطة E8 حدود 2 أسابيع من إضافة الملحق.

3. ذوبان iPSCs

  1. إزالة قارورة من iPSCs المجمدة من النيتروجين السائل ومكان على الثلج الجاف.
  2. ذوبان الجليد بسرعة القارورة في حمام مائي 37 ° C. دوامة القارورة في حمام مائي حتى سوى جزء صغير من بقايا الجليد.
  3. رش القارورة مع الايثانول 70٪ ونقل إلى خزانة السلامة البيولوجية.
  4. إضافة 1 مل من درجة حرارة الغرفة E8 قطرة قطرة المتوسط ​​مباشرة إلى القارورة.
  5. باستخدام ماصة 2 مل، ونقل قطرة قطرة تعليق خلية في 9 مل من E8 المتوسطة في 15 مل أنبوب مخروطي الشكل. دوامة أنبوب في كثير من الأحيان للتأكد من أن الخلايا والمتوسطة تخلط جيدا بسرعة.
  6. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 200 x ج لمدة 5 دقائق.
  7. نضح طاف، و resuspend بيليه الخلية في حجم مناسب من E8 تستكمل مع 10 ميكرومتر Y-27632.
  8. إضافة الخلايا لعدد مناسب من الطابق السفلي MEMBRANه-مصفوفة المغلفة الآبار، ومكان في 37 ° C، 5٪ CO 2 حاضنة بين عشية وضحاها. فمن المستحسن أن لوحة 0.2 على الأقل × 10 6 IPSC لكل بئر من لوحة 6 جيدا لتمكين الانتعاش السريع بعد الذوبان.

4. صيانة والركض الروتيني لiPSCs

  1. تحديث E8 المتوسط ​​يوميا.
  2. مراقبة التشكل وconfluency من الخلايا مع مجهر مقلوب. iPSCs ذات جودة عالية تنمو في مستعمرات مسطحة ذات حدود واضحة. المستعمرات الفردية تمتلك مظهر "مثل حصاة كبيرة".
  3. مرور الخلايا iPSCs عندما تصل ~ 70٪ confluency.
  4. تحضير محلول EDTA الركض من خلال إضافة 0.9 غرام كلوريد الصوديوم و 500 ميكرولتر 0.5 M EDTA إلى 500 مل DPBS. تخلط جيدا لإذابة كلوريد الصوديوم، وفلتر فراغ لتعقيم. تدفئة قسامة من الحل الركض في 37 ° C حمام الماء قبل الركض.
  5. إلى مرور، نضح قضى مستنبت وغسل خلايا مرة واحدة مع حجم مساو من با الحارةsaging الحل. نضح، وماصة ما يكفي من EDTA حل الركض إلى معطف الخلايا (1 مل لكل بئر من لوحة 6 جيدا).
  6. وضع الخلايا تحت مجهر مقلوب ومراقبة المستعمرات IPSC. وينبغي أن تصبح ظهور ثقوب داخل المستعمرات والحدود أثار على ما يبدو في حدود 2 إلى 5 دقائق.
  7. نضح بعناية الحل EDTA الركض.
  8. باستخدام ماصة 10 مل، الاستغناء 4 مل من E8 المتوسطة (في حالة استخدام لوحة 6 جيدا) تحت ضغط عال بشكل مباشر في كل بئر إلى أن passaged.
  9. جمع كتل IPSC، وتنقسم إلى عدد مناسب من الآبار اعتمادا على نسبة الانقسام من 1: 8 إلى 1:12. لا الإفراط في ماصة، وتجزئة كتل الخلايا سوف يؤدي ذلك إلى ضعف قدرتها على البقاء.
  10. وضع لوحة في حاضنة، والصخور لوحة ذهابا وإيابا، وجنبا إلى جنب عدة مرات لتفريق الخلايا.

5. إعداد MEFS وiPSCs لTansfection

  1. 48 ساعة قبل transfectioن، iPSCs مرور في ~ 1: 6 إلى أربعة أو المزيد من الآبار من الغشاء القاعدي المغلفة مصفوفة لوحة 6 جيدا، بحيث سيكون 70٪ متموجة يومين من الآن.
  2. في اليوم التالي، ذوبان الجليد DR4 MEFS في المتوسط ​​MEF تتألف من DMEM (الجلوكوز عالية) تستكمل مع 10٪ FBS و1X MEM-NEAA.
  3. لوحة DR4 MEFS إلى طبقين 10 سم في ~ 2 × 10 4 خلية / سم 2 واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
  4. في يوم ترنسفكأيشن، تغيير المتوسطة MEF إلى E8 تستكمل مع 10 ميكرومتر Y-27632 30 دقيقة قبل تنفيذ ترنسفكأيشن على iPSCs.
  5. اختياري: إذا كان المطلوب تحليل تدفق cytometric من iPSCs بعد ترنسفكأيشن، وإزالة لوحة المغلفة مصفوفة الغشاء القاعدي من 4 ° C ومكان في درجة حرارة الغرفة.
  6. اختياري: 4 ساعة قبل ترنسفكأيشن، تكملة ما قبل ترنسفكأيشن الثقافة IPSC مع Y-27632 في تركيز النهائي من 10 ميكرومتر.

6. لطيف خلية التفكك الكاشف علاج لالثانية ترنسفكأيشن من iPSCs باستخدام نظام Electroporation لل

  1. إزالة P3 الحل ترنسفكأيشن الخلية الأولية من 4 ° C والسماح لها أن تأتي إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة ~. إضافة ملحق كامل 100 ميكرولتر إلى حل ترنسفكأيشن قبل استخدامها.
  2. دافئ خلية لطيف-التفكك كاشف في 37 ° C حمام الماء.
  3. الحصول AAVS1 TALENs (PZT-AAVS1-L1 وPZT-AAVS1-R1) وAAVS1-CAG-EGFP المانحة من -20 ° C.
  4. إزالة iPSCs من الحاضنة ويغسل مرة واحدة مع DPBS.
  5. إضافة 1 مل من خلية لطيف-التفكك كاشف لكل بئر، واحتضان iPSCs عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، أو حتى فصل أكثر من 50٪ من الخلايا من سفينة الثقافة.
  6. ماصة الخلايا صعودا وهبوطا عدة مرات باستخدام ماصة P1000 لفصل أي الخلايا المتبقية من سفينة الثقافة، وتفتيت كتل IPSC.
  7. إضافة 2 مل من E8 المتوسطة إلى كل بئر، وماصة صعودا وهبوطا عدة مرات باستخدام ماصة 10 مل لفورثإيه تفصيل كتل الخلايا إلى خلايا واحدة
    ملاحظة: الكفاءة ترنسفكأيشن تنخفض بشكل كبير إذا كتل الخلايا يست مفصلة بما فيه الكفاية.
  8. جمع iPSCs في أنبوب مخروطي 15 مل، والطرد المركزي في 100 x ج لمدة 3 دقائق.
  9. نضح طاف، وخلايا resuspend في الحد الأدنى من E8 المتوسطة.
  10. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات بعد تطبيق وصمة عار الحيوية مثل 0.4٪ التريبان الأزرق. تأكد من أن الخلايا نأت بما فيه الكفاية في حين عد (1-3 خلايا في "أجمة").
  11. الاستغناء 3 × 10 6 خلايا في كل من اثنين من أنابيب مخروطية 15 مل، وتدور باستمرار مرة أخرى في 100 x ج لمدة 3 دقائق.
    ملاحظة: انخفاض سرعة الطرد المركزي يقلل من الإجهاد الخلية ويتيح سهولة اعادة تعليق من iPSCs قبل Electroporation لل.
  12. ضبط نظام Electroporation لللبرنامج الخلية من نوع محدد لالجنينية خط الخلايا الجذعية البشرية H9 (برنامج CB-150).
  13. بعد الطرد المركزي، ونضح طاف من سلالكريات لتر. لبيليه واحد، إضافة 10 ميكروغرام من المتبرع HR كما عينة السيطرة. لبيليه آخرين إضافة 10 ميكروغرام من المتبرع HR، جنبا إلى جنب مع 5 ميكروغرام لكل TALEN (PZT-AAVS1-L1 وPZT-AAVS1-R1) كما عينة التجريبية.
  14. و resuspend كل بيليه الخلية في 100 ميكرولتر من محلول ترنسفكأيشن الخلية الأولية P3، ونقل إلى كوفيت.
  15. أداء ترنسفكأيشن وإضافة على الفور 500 ميكرولتر من درجة حرارة الغرفة E8 المتوسط ​​إلى كل كفيت.
  16. نقل iPSCs قطرة قطرة transfected لواحد 10 سم صحن يحتوي MEFS DR4 أعدت في الخطوة 5.4.
  17. اختياري: اضافة عدة قطرات من كل تجربة في بئر واحدة من الغشاء القاعدي المغلفة مصفوفة لوحة 6 جيدا إذا كان المطلوب التدفق الخلوي anaylsis الكفاءة ترنسفكأيشن.
  18. كرر الخطوات 6،15-6،17 لإنهاء كل من العينات. في اليوم التالي، وغسل الخلايا مع DPBS مرتين والتبديل مستنبت لNutriStem، الذي يظهر لدعم الثقافة IPSC على مغذيات أفضل من E8.
  19. TRansient قمم EGFP التعبير في 48 إلى 72 ساعة بعد ترنسفكأيشن. تقييم كفاءة ترنسفكأيشن كما تريد.

7. بوروميسين اختيار iPSCs المستهدفة

  1. بدء اختيار بوروميسين 72 ساعة بعد ترنسفكأيشن عندما تصل iPSCs 70٪ confluency.
  2. لNCRM5 iPSCs، تبدأ اختيار بوروميسين عند 0.5 ميكروغرام / مل بوروميسين (1/2 الجرعة الكاملة) المخفف في NutriStem مستنبت. قد تختلف تركيز بوروميسين الأمثل ،25-1 ميكروغرام / MLL لبعض الخطوط التوجيهية.
  3. iPSCs الثقافة في NutriStem + 0.5 ميكروغرام / مل بوروميسين لمدة 3 أيام، ومنعش المتوسط ​​يوميا.
  4. بعد 3 أيام، وزيادة تركيز بوروميسين إلى 1 ميكروغرام / مل.
  5. iPSCs ثقافة أقل من 1 ميكروغرام / مل اختيار بوروميسين لمدة 7 إلى 8 أيام أخرى، أو حتى تظهر المستعمرات متميزة كبيرة بما يكفي لمستعمرة قطف.

8. مستعمرة الإلتقاط والتوسع من iPSCs المستهدفة

  1. استخدام الغشاء القاعديمصفوفة لمعطف لوحة 96-جيدا من قبل الاستغناء 50 ميكرولتر من الغشاء القاعدي حل مصفوفة طلاء (2 ملغ مصفوفة الغشاء القاعدي المخفف إلى 12 مل DMEM / F12) في كل بئر. تخزين لوحة عند 4 درجات مئوية خلال الليل قبل الاستخدام.
  2. بعد السماح لوحة المغلفة مصفوفة الغشاء القاعدي أن يأتي إلى درجة حرارة الغرفة، ونضح الطابق السفلي مصفوفة الغشاء والاستغناء 100 ميكرولتر E8 تستكمل مع 10 ميكرومتر Y-27632 في كل بئر.
  3. وضع مجهر مقلوب في خزانة السلامة البيولوجية، ورذاذ بخفة مع 70٪ ETOH لتعقيم.
  4. سحب ماصة باستير الزجاج على موقد بنسن للحصول على أداة مستعمرة قطف المثالية التي لديها "هوك" صغيرة على الحافة. تعقيم مع ETOH 70٪، وتضع في غطاء محرك السيارة لتجف.
  5. إزالة صحن يحتوي على المستعمرات IPSC المستهدفة من الحاضنة، ومكان في غطاء محرك السيارة تحت المجهر.
  6. اختيار iPSCs عن طريق تتبع دائرة حول الحدود مستعمرة مع أداة قطف مستعمرة.
  7. استخدام "هوك" من أداة مستعمرة قطف لكشط بلطف وإزالة مستعمرة IPSC من سطح اللوحة. للمستعمرات أكبر مما أثار X مع أداة قطف مستعمرة إلى الربع فإن مستعمرة تسهل نمو الخلايا بعد إعادة الطلاء.
  8. مرة واحدة يتم فصل كتل الخلايا وعائمة بحرية، واستخدام تشكيلة ماصة P200 ل~ 30 ميكرولتر لجمع iPSCs. لوحة الخلايا مباشرة في لوحة 96-جيدا.
  9. اختياري: استخدام ماصة P20 المقرر أن ~ 5 ميكرولتر لجمع iPSCs في أنبوب إيبندورف، ثم إضافة 50 ميكرولتر خلية لطيف-التفكك كاشف لهضم لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. بعد الهضم، وإضافة 500 ميكرولتر E8 المتوسطة في أنبوب إيبندورف لتمييع الخلية لطيف-التفكك كاشف وتدور أسفل الخلايا في 200 x ج في القياسية فوق المنضدة ميكروسنتريفوج لمدة 5 دقائق. ثم نضح معظم المتوسطة وترك ~ 30 ميكرولتر ل resuspend ونقل الخلايا إلى لوحة 96-جيدا.
    ملاحظة: هذاسوف نهج تسهيل تفكك أجمة الخلية والتوسع السريع للمستعمرة التقطت.
  10. مواصلة مستعمرة قطف حتى تم جمع عدد كاف من المستعمرات IPSC (حوالي 20-30 المستعمرات في التجربة هو مستحسن).
  11. بعد قطف مستعمرة، وضع لوحة 96-جيدا في حاضنة بين عشية وضحاها. تحديث مع كامل المتوسطة E8 في اليوم التالي، والثقافة حتى ~ 70٪ متموجة.
  12. خلايا مرور من جيدا 96 إلى 24 جيدا، ثم إلى 6 جيدا، كما هو موضح في الخطوات 4،5-4،10.
    ملاحظة: كميات EDTA الحل وE8 المتوسطة ينبغي خفض بشكل متناسب عند استخدام الآبار أصغر من لوحة 6 جيدا.
  13. تقييم استهداف النجاح من خلال تقاطع PCR وتحليل لطخة الجنوبي لتأكيد التكامل كاسيت المستهدفة وغياب ناقلات إدراجها بشكل عشوائي 16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويرد التصور للبروتوكول في الشكل 2، مع الفترات التي iPSCs هي المستزرعة في مختلف المتوسطة التي أبرزها إما أخضر أو أزرق لE8 لNutriStem. من المهم أن بالنقل فقط iPSCs ذات جودة عالية؛ دراسة أطباق الثقافة في جميع أنحاء الصيانة الروتينية والتحقق من أن الثقافات IPSC تحتوي على المستعمرات متميزة أساسا تحمل التشكل مثل الحصوه (الشكل 3A)؛ خلايا متباينة لا ينبغي أن تشغل أكثر من 10٪ من الثقافة. ويتم تقييم Transfectability من iPSCs والأمثل باستخدام ناقلات صغيرة pMax-GFP (الشكل 4A-B)، كما ترنسفكأيشن مع pMax-GFP يمثل عادة أقصى قدر من الكفاءة قابلة للتحقيق نظرا لصغر حجمها. على سبيل المثال، حققنا 68.6٪ كفاءة ترنسفكأيشن مع pMax-GFP (الشكل 4B). لاستهداف AAVS1 آمن الميناء، و passaged iPSCs باستخدام طيف التفكك وحيدة الخلية كاشف وtransfected مع AAVS1-TALENs وAAVS1-CAG-EGFP (البلازميدات مبين في الشكل 1A). ثم يتم مطلي iPSCs Transfected على كثافة مناسبة من DR4 ​​MEFS (الشكل 3B). التعبير عابرة من قمم AAVS1-CAG-EGFP في 48 إلى 72 ساعة بعد ترنسفكأيشن (الشكل 3C)؛ إذا رغبت في ذلك، وجزء صغير من iPSCs transfected يمكن FACS تحليلها. NCRM5 iPSCs يمكن transfected مع كفاءة 60.9٪ باستخدام AAVS1-CAG-EGFP المانحة (الشكل 4C). كفاءة ترنسفكأيشن يمكن أن تختلف إلى حد كبير؛ لإجراء التجارب فيه وGFP + جزء، بل هو ما يصل الى 10٪، والاستمرار في اختيار بوروميسين. بعد أداء اختيار بوروميسين، يجب أن الحيوانات المستنسخة الفردية التي تظهر مضان موحدة تكون كبيرة بما يكفي لمستعمرة قطف (الشكل 3D). لاختيار الحيوانات المستنسخة، ويقع مستعمرة مناسبة تحت التكبير المنخفض (الشكل 3E) ومعزولة عن طريق تتبع الأول والإيواء ذلك (أرقام 3F-G). المستعمرات إيواء ثم يتم كشط بلطفد من سفينة الثقافة (الشكل 3H). باستخدام ماصة P200، ثم يتم نقل كتل الخلايا في بئر واحدة من الغشاء القاعدي المغلفة مصفوفة لوحة 96-جيدا. يجب iPSCs إرفاق خلال 2-4 ساعات من الطلاء (الشكل 3I). إن لم يكن لوحظ التعلق خلال 24 ساعة، وكان الطابق السفلي غشاء مصفوفة طلاء أو Y-27632 معاملة المرجح الفرعي الأمثل. الغشاء القاعدي مصفوفة معطف لوحة 96-جيدا جديدة وإعداد الطازجة E8 + 10 ميكرومتر Y-27632 قبل اختيار أي المزيد من المستعمرات. مرة واحدة في شكل 96-جيدا، واستهدفت يتم توسيع استنساخ IPSC، وينبغي أن يحمل التعبير مستقر وموحد للGFP (أرقام 4D-E).

الشكل (1)
الشكل 1: جين استهداف ناقلات واستهداف التخطيطي. (A) إقرارات AAVS1-CAG-EGFP، والبلازميدات PZT-AAVS1-L1 / R1 TALENs المستخدمة في هذه الدراسة. وSA-عنصر 2A في البلازميد AAVS1-CAG-EGFP يمثل الببتيد-الشق الذاتي لصق-متقبل و2A تستخدم لتقييد بوروميسين N-أسيتيل ترانسفيراز (PAC) التعبير الجيني للأحداث تستهدف التكامل. يتم استخدام غلوبين الدجاج β-الأكتين (CAG) المروج لدفع التعبير عن EGFP. (B) واستهدفت AAVS1 آمن الميناء، الواردة في إنترون 1 من الجين PPP1R12C، وذلك باستخدام TALENs لتوليد استراحة DNA المزدوج تقطعت بهم السبل. هذا ينشط إعادة التركيب مثلي (HR) الأجهزة إصلاح، والذي يستخدم بعد ذلك AAVS1-CAG-EGFP المانحة (حمل السلاح التماثل المرافقة الموقع قطع) باعتبارها الركيزة للإصلاح. تم دمج الكاسيت ويتم وضع هذا الجين PAC تحت سيطرة PPP1R12C المروج الذاتية.

الشكل 2
الشكل 2. الجدول الزمني للتجربة التي تستهدف الجينات. iPSCs هي مثقفإلى 70٪ confluency وpassaged ~ 1: 6 يوم -2 (د-2). ومطلي MEFS في د-1، ويتم جمع iPSCs وtransfected في D0. في D1، يتم فيها تشغيل وسائل الاعلام لNutriStem، وiPSCs هي مثقف لاثنين من أكثر أيام قبل أن يتم أضاف بوروميسين إلى متوسطة في D3. مستعمرات جاهزة للقطف من قبل D12 عادة. ويسلط الضوء على الفترات التي iPSCs يتم تربيتها في E8 المتوسطة الأخضر، في حين فترات ثقافة NutriStem هي باللون الأزرق.

الشكل (3)
الشكل 3: IPSC استهداف الجينات صور تمثيلية (A) صورة المرحلة من iPSCs جودة عالية. ملاحظة الحدود بين مرحلة مشرقة ومثل الحصوه التشكل. (B) DR4 MEFS مطلي في 2 × 10 4 خلية / سم 2 بعد أربع وعشرين ساعة الذوبان. (C) اثنان وسبعون ساعة بعد ترنسفكأيشن، EGFP + الخلايا هي على ما يبدو بشكل واضح عندما ينظر إليها في ظل ميكر مضانoscope. (D) وبعد الاختيار القائم على بوروميسين ل~ 14 يوما، المستعمرات عرض موحد GFP مضان كبيرة بما يكفي ويمكن الحصول عليها. (EH) الصور التمثيلية للعملية قطف مستعمرة. يتم اختيار المستعمرات يستخدم ماصة باستير سحبت، أولا من خلال تحديد مستعمرة، ومن ثم من قبل الإيواء إلى الحصول على كتل الخلايا الصغيرة. (I) اختار المستعمرات IPSC نعلق على الغشاء القاعدي المغلفة مصفوفة سطح لوحة 96-جيدا في حدود 2 إلى 4 ساعة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4: تحليل FACS الكفاءة ترنسفكأيشن وiPSCs المستهدفة نسيلي. (A) مراقبة NCRM5 iPSCs دون ترنسفكأيشن من أي البلازميد. (B) NCRM5iPSCs transfected مع اختبار ناقلات صغيرة pMax-GFP هي تحليل FACS لGFP التعبير. (C) التعبير عابر من البلازميد AAVS1-CAG-EGFP يتم تقييمه من قبل FACS. يعرض استنساخ (D) وهو NCRM5-AAVS1-CAG-EGFP موحد إيجابي التعبير EGFP كما يعاير بواسطة FACS. ملاحظة تجميع ضيق من iPSCs تحليلها بالمقارنة مع C). (E) الإسفار صورة موسعة NCRM5-AAVS1-CAG-EGFP استنساخ المستهدفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الخطوات الأكثر أهمية للجيل ناجح من AAVS1 آمن الميناء استهدفت iPSCs الإنسان هي: (1) يعطي كفاءة TALEN والجهات المانحة البلازميدات إلى iPSCs من قبل ترنسفكأيشن. (2) تحسين تفكك iPSCs إلى خلايا واحدة قبل ترنسفكأيشن والطلاء كثافة بعد ترنسفكأيشن. (3) تحسين الجرعة ووقت المخدرات الاختيار على أساس نمو خط IPSC. (4) تشريح بعناية واختيار المستعمرات المستهدفة ونقل لوحة جديدة / جيد. بالمقارنة مع الطرق المماثلة المستخدمة في ورقة Hockemeyer في 10، وتستخدم هذا البروتوكول زوج من المصدر المفتوح AAVS1-TALENs، مختلف IPSC التفكك الكاشف، وجهاز ترنسفكأيشن مختلفة لتقديم TALENs والجهات المانحة ناقلات، مما ساعد على تخفيض عدد iPSCs المستخدمة في التجربة مع تحقيق ترنسفكأيشن عالية واستهداف الكفاءات.

لتحقيق الكفاءة العالية التحرير الجينات في iPSCs الإنسان، فمن الضروري أولا تحسين إيصال التبادل الالكتروني للبيانات الجيناتالكواشف تينغ (DNA / RNA)، في حين أن موازنة موت الخلايا الحاد طريقة التسليم والكواشف تسبب لiPSCs. والهدف هو تحقيق أقصى قدر من الكفاءة تسليم مع الحفاظ على مستوى منخفض محتمل من موت الخلايا. وبما أنه من السهل جدا لإعداد كميات كبيرة من البلازميدات AAVS1-TALEN التي يمكن أن تحقق> 50٪ كفاءة HR مع مساعدة من المخدرات في اختيار iPSCs الإنسان، فإنه ليس من الضروري أن تجعل من mRNAs من البلازميدات TALEN. التحدي المتمثل في تسليم يأتي من البلازميدات المانحة كبيرة، وهو في هذه الحالة هو ~ 10 كيلو بايت. فمن المستحسن استخدام المانحة AAVS1-CAG-EGFP لاختبار كفاءة تسليم في خطوط التوجيهية الإنسان محددة بدلا من استخدام pMaxGFP في الطقم ترنسفكأيشن، لأن pMaxGFP هو ~ 3.5 كيلوبايت بلازميد صغير وسهلة للغاية لتقديم في أي الخلايا. يمكن تعديل AAVS1-CAG-EGFP المانحة باستخدام أنزيمات التقييد هو مبين في الشكل 1A لاستهداف الجينات المحورة مختلفة في AAVS1 مكان. آخر المانحة 12 كيلو بايت، والذي يحتوي على كاسيت 6.4 كيلوبايت ليحل محل CAG-EGFP، قد يكونأون استخدمت بنجاح لتحقيق ترنسفكأيشن مماثلة واستهداف الكفاءة (لا تظهر البيانات). بشكل عام، iPSCs الإنسان من بين أنواع الخلايا التي يصعب بالنقل وكفاءة تسليم البلازميدات كبيرة يمكن أن تكون منخفضة مثل 5-10٪ مقاسا تحليل التدفق الخلوي للخلايا GFP +. مزيد من التحسين من كفاءة ترنسفكأيشن يعتمد على التفكك السليم للiPSCs الإنسان إلى خلايا واحدة، لأن كتل الخلايا سوف يقلل من فرصة لإيصال الجين التحرير الكواشف في كل خلية. يستخدم هذا البروتوكول كاشف طيف وخلية التفكك في العمل بسرعة، ولكن علاج iPSCs لأكثر من 10 دقيقة لا ينصح. عادة ثقافة IPSC هي أقل من 80٪ متموجة إذا التالية الخطوة 5.1، مما يجعل على بعد 5 دقائق الحضانة مع قبل تحسنت خلية لطيف-التفكك كاشف كافية عادة إلى فصل من iPSCs إلى الخلايا واحد مع pipetting لطيف. إذا كان يمكن فصلها ليس كل الخلايا في الخلايا واحد بعد 10 دقيقة من العلاج لزراعة الخلايا هو أكثر يخدعيجيد أو المستعمرات تصبح مدمجة للغاية، وذلك ببساطة جمع عدد الموصى بها من خلايا مفردة من المزيد من الآبار / لوحات وترك الخلايا المرفقة بإحكام خلف. لا ينصح pipetting لباهظا بسبب القص الميكانيكية هو أكثر ضار على خلايا الجسم من التفكك الأنزيمية. عند العمل مع iPSCs المبكر مرور (قبل مرور # 15)، والممارسة التفكك طيف مهمة جدا لبقاء الخلية لأن الخلايا هي بالفعل أكثر حساسية للإجهاد ترنسفكأيشن من iPSCs مرور في وقت متأخر. وإذا كان من الصعب تحقيق كفاءة عالية في كل ترنسفكأيشن وخلية البقاء على قيد الحياة، واختيار الممارسات التي تعطي أعلى كفاءة ترنسفكأيشن. بعد ترنسفكأيشن، ينبغي مطلي الخلايا في كثافة من شأنها أن تصل إلى 50-80٪ confluency في يوم 3 عندما يبدأ المخدرات التحديد. لأن كل خط IPSC ينمو بشكل مختلف، قد تحتاج بعد ترنسفكأيشن كثافة الطلاء إلى أن يكون الأمثل لكل خط الخلية. قد تؤدي كثافة الطلاء عالية إلى الإفراط في confluency أن يقلل من فعالية دروز-الاختيار، بينما قد يسبب انخفاض كثافة الطلاء المتطرفة الانتعاش تأخر ونمو المستعمرات المقاوم للأدوية. عادة 3 ملايين iPSCs بدء ما يكفي ليكون مطلي في ½ إلى 2 10 سم أطباق اعتمادا على بقاء ونمو iPSCs محددة. وبالمثل، إذا كان استخدام خط IPSC ولدت حديثا أو تلك التي ينتظر غير مجربة، وتوليد منحنى بوروميسين قتل لتحديد أقل جرعة فعالة في الخلايا untransfected قد يكون ضروريا؛ يمكن أن خطوط التوجيهية تختلف اختلافا كبيرا في حساسيتها للاختيار بوروميسين. واستخدمت MEFS لاختيار لأنها تظهر لدعم النمو IPSC أفضل من بعض مصفوفات خارج الخلية خلال اختيار المخدرات. وكقاعدة عامة من الإبهام، ما لا يقل عن 5 أيام من بوروميسين في 1 ميكروغرام / مل أو 7 أيام في هناك حاجة مل لاستكمال اختيار 0.5 ميكروغرام /. وأخيرا، تقنية التقاط مستعمرة أمر بالغ الأهمية للحفاظ على جميع المستعمرات المستهدفة بعد اختيار المخدرات. pipetting لطيف أو المعاملة التفكك كاشف يساعد على كسر المستعمرات إلى قطع متعددة بالتساويوزعت في البئر الجديد، وبالتالي يمكن تسريع التوسع الاستيطاني. في حالة استخدام كاشف التفكك إلى تفصيل المستعمرات التقطت قبل والطلاء، وتأكد من المخفف بما فيه الكفاية مع> 10X المتوسطة بعد العلاج، لأن التفكك كاشف المتبقية قد يقتل الخلايا المحولة إذا ما تركت على ليلة وضحاها. وشجعت غاية بغض النظر عن أي تقنية تستخدم، وممارسة مستعمرة قطف قبل التجارب الحقيقية.

كما تستخدم هذه الاستراتيجية وصفه طريقة الجينات فخ لدفع التعبير عن الجينات PAC الخروج من PPP1R2C المروج الذاتية، واختيار كبير يجب أن أكثر من 30 مستعمرات لم تثبت ضروريا. ربط SA-2A PAC اختيار يزيل نظريا الخلايا التكامل الوحيد عشوائية، ولكن يمكن أن يحدث التكامل عشوائي إضافية (ق) في iPSCs تحمل التكامل المستهدفة ناجحة. في معظم الحالات، ما يقرب من 100٪ من الحيوانات المستنسخة مختارة المخدرات واستهدفت التكامل و~ 10-40٪ منهم لديهم INTEGRATI عشوائي إضافيةإضافات. الغالبية العظمى من الحيوانات المستنسخة المستهدفة تميل إلى أن تكون استهداف احد أليل، على الرغم من التجارب حيث يحدث> 50٪ استهداف نقرا مزدوجا أليل. تردد متغير من التكامل عشوائية إضافية، فضلا عن نسبة أحادية مقابل استهداف مزدوج أليل، من الصعب السيطرة عليها. ولذلك، اختيار ~ 20 المستعمرات ويوصى لضمان المفرد أو المزدوج أليل الاستهداف فقط الحيوانات المستنسخة يمكن الحصول على. في ضوء التجارب استهداف فاشلة، وإعادة تقييم أسعار transfectability، البقاء على قيد الحياة، ونمو الخلايا المستهدفة، ينصح بشدة فعالية nucleases في خط خلية معينة، ونوعية الاستعدادات المانحة ونوكلياز قبل إعادة محاولة-التجربة في مجملها.

وتجدر الإشارة إلى أن استراتيجيات مماثلة المانحة الجينات فخ يمكن استخدامها لاستهداف الجينات النشطة الأخرى، ولكن ليست مناسبة للاستهداف الجين الصمت الذي يتطلب المروج مستقل لحملة اختيار التعبير الجيني. أيضا، في حين عشريعتبر البريد AAVS1 الملاذ الآمن لديها بنية الكروماتين مفتوحة، وهذا لا يضمن أن أي التحوير يمكن التعبير بقوة في هذا الموضع. في الواقع، أظهر تقريرنا الأخير أن العديد من المروجين ضعيفة لم يتمكنوا من دفع اكتشاف الفلورسنت التعبير مراسل الجين بعد التكامل تستهدف AAVS1 مكان 14.

يركز هذا البروتوكول على استخدام TALENs التحقق جيدا لاستهداف مدروسة موضع الملاذ الآمن في الجينوم البشري. التقنيات هي استنساخه للغاية وقابلة للتكيف بسهولة لكثير من التطبيقات التي تنطوي على أي التحوير. مقارنة مع أساليب الهندسة الجينوم باستخدام التكامل عشوائية، AAVS1-TALEN الجينات بوساطة استهداف هو كفاءة عالية ومحددة، وفي حالة iPSCs، والنتائج في خلايا الفلورسنت ثابت أن لديها القدرة على توسيع والتمايز إلى أي نوع من الخلايا البشرية. في حين أن هذا البروتوكول لا تصف تصميم والتحقق من nucleases مصمم أو تقييم المستعمرات IPSC المستهدفة لصالتكامل كاسيت روبر وبعيدا عن الهدف التحليل، وقد وصفت عدة بروتوكولات ممتازة هذه الجوانب المنهجية بالتفصيل 16-18. كما وصف IPSC الثقافة والركض تقنيات خالية من وحدة التغذية باستخدام E8 المتوسطة في التفاصيل في المنشور السابق 19. بروتوكول أعلاه، في حين الأمثل لإضافة الجينات في AAVS1 الملاذ الآمن لiPSCs الإنسان، يمكن أن تكون بمثابة القالب العام للتجارب التي تنطوي على موقع معين بوساطة نوكلياز الجين تحرير / إضافة باستخدام المانحة إعادة التركيب مثلي في أي نوع من الخلايا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

تعلن المؤلفين أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-Free, 10 ml Corning 354230 Store at -20 °C.
DMEM/F-12 Life Technologies 11320-033 Store at 4 °C.
Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates Corning 3506
Essential 8 Medium Life Technologies A1517001 Store basal medium at 4 °C. Store supplement at -20 °C.
Y-27632 dihydrochloride Tocris 1254 Store at room temp. Once dissolved in H2O, store at -20 °C.
Sodium Chloride Sigma S5886-500G
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Life Technologies 15575-020
DPBS, no calcium, no magnesium Life Technologies 14190-250
100 mm TC-Treated Culture Dish Corning 430167
DR4 MEF 2M IRR - Academic GlobalStem GSC-6204G Store in liquid Nitrogen.
DMEM, high glucose, pyruvate Life Technologies 11995-040 Store at 4 °C.
Defined Fetal Bovine Serum, US Origin HyClone SH30070.03 Store at -20 °C. Thaw at 4 °C overnight and aliquot. Store aliquots at -20 °C until needed.
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) Life Technologies 11140-050 Store at 4 °C.
4D-Nucleofector Core unit  Lonza AAF-1001B part of the electroporation system
4D-Nucleofector X unit  Lonza AAF-1001X part of the electroporation system
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (24 RCT) Lonza V4XP-3024 Upon arrival, remove Primary Cell Solution and supplement and store at 4 °C.
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Life Technologies A1110501 Store at -20 °C. Thaw overnight at 4°C and warm an aliquot in a 37 °C water bath before use.
NutriStem XF/FF Culture Medium Stemgent 01-0005 Store at -20 °C. Thaw overnight at 4 °C
AAVS1 TALENs (pZT-AAVS1-L1 and pZT-AAVS1-R1) Addgene 52637 and 52638
Name Company Catalog Number Comments
AAVS1-CAG-EGFP Homologous Recombination donor Addgene 22212
Puromycin Dihydrochloride Life Technologies A11138-03 Store at -20 °C. Prepare working aliquots of 1 mg/ml in ddH2O.
Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets Fisher Scientific 13-678-20A
Sorvall Legend XTR (Refrigerated), 120 V 60 Hz Thermo Scientific 75-004-521
TX-750 4 × 750 ml Swinging Bucket Rotor Thermo Scientific 75003607
Trypan Blue Solution, 0.4% Life Technologies 15250-061

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  2. Hentze, H., Graichen, R., Colman, A. Cell therapy and the safety of embryonic stem cell-derived grafts. Trends Biotechnol. 25 (1), 24-32 (2007).
  3. Smith, J. R., et al. Robust, persistent transgene expression in human embryonic stem cells is achieved with AAVS1-targeted integration. Stem Cells. 26 (2), 496-504 (2008).
  4. Lombardo, A., et al. Site-specific integration and tailoring of cassette design for sustainable gene transfer. Nat Methods. 8 (10), 861-869 (2011).
  5. Ogata, T., Kozuka, T., Kanda, T. Identification of an insulator in AAVS1, a preferred region for integration of adeno-associated virus DNA. J Virol. 77 (16), 9000-9007 (2003).
  6. Zwaka, T. P., Thomson, J. A. Homologous recombination in human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 21 (3), 319-321 (2003).
  7. Urbach, A., Schuldiner, M., Benvenisty, N. Modeling for Lesch-Nyhan disease by gene targeting in human embryonic stem cells. Stem Cells. 22 (4), 635-641 (2004).
  8. Hockemeyer, D., et al. Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases. Nature biotechnology. 27 (9), 851-857 (2009).
  9. Zou, J., et al. Gene targeting of a disease-related gene in human induced pluripotent stem and embryonic stem cells. Cell stem cell. 5 (1), 97-110 (2009).
  10. Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nature. 29 (8), 731-734 (2011).
  11. Sanjana, N. E., et al. A transcription activator-like effector toolbox for genome engineering. Nature protocols. 7 (1), 171-192 (2012).
  12. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  13. Ding, Q., et al. Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs. Cell stem cell. 12 (4), 393-394 (2013).
  14. Luo, Y., et al. Stable Enhanced Green Fluorescent Protein Expression After Differentiation and Transplantation of Reporter Human. Induced Pluripotent Stem Cells Generated by AAVS1 Transcription Activator-Like Effector Nucleases. Stem Cells Transl Med. 3 (7), 821-835 (2014).
  15. Zou, J., et al. Oxidase-deficient neutrophils from X-linked chronic granulomatous disease iPS cells: functional correction by zinc finger nuclease-mediated safe harbor targeting. Blood. 117 (21), 5561-5572 (2011).
  16. Luo, Y., Rao, M., Zou, J. Generation of GFP Reporter Human Induced Pluripotent Stem Cells Using AAVS1 Safe Harbor Transcription Activator-Like Effector Nuclease. Curr Protoc Stem Cell Biol. 29, 5A.7.1-5A.7.18 (2014).
  17. Peters, D. T., Cowan, C. A., Musunuru, K. Genome editing in human pluripotent stem cells. StemBook. , Harvard Stem Cell Institute. Cambridge, MA. Available from: http://www.stembook.org/node/1438 (2008-2013).
  18. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  19. Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat Protoc. 7, 2029-2040 (2012).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 96، التي يسببها الخلايا الجذعية المحفزة، والتحرير الجينات، AAVS1، TALEN، GFP
ترنسفكأيشن، اختيار، ومستعمرة قطف من صنع الإنسان المحفزة الخلايا الجذعية TALEN المستهدفة مع جين GFP في AAVS1 الملاذ الآمن
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cerbini, T., Luo, Y., Rao, M. S.,… More

Cerbini, T., Luo, Y., Rao, M. S., Zou, J. Transfection, Selection, and Colony-picking of Human Induced Pluripotent Stem Cells TALEN-targeted with a GFP Gene into the AAVS1 Safe Harbor. J. Vis. Exp. (96), e52504, doi:10.3791/52504 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter