Introduction
Возможность перепрограммирования соматических клеток человека в клеточных как индуцированных плюрипотентных стволовых клеток эмбриональных стволовых (ИПСК) был впервые обнаружен Такахаши и др. В 2007 1. Фибробласты человека кожные трансдуцированные ретровирусы выражения четыре фактора транскрипции (так окрестили Яманака факторы Oct3 / 4, Sox2, с-Мус и Klf4) было показано, что очень похожи на человеческие эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) на основе морфологии, пролиферации, экспрессии генов и эпигенетическом статуса; важно, иПСК также способны дифференцироваться в клетки всех трех зародышевых листков 1. Пролиферативный потенциал и дифференциация мощность ИПСК делает их очень привлекательными инструментами; перепрограммирования клетки от пациентов, страдающих от конкретных заболеваний, иПСК могут быть использованы как в качестве ин витро модели болезни систем и в качестве потенциальных терапевтических.
Для последней цели, некоторые вопросы должны быть решены до полного потенциала ИПСКв клинической практике может быть реализован; онкогенными потенциал в пробирке, культивируемых ЭСК и ИПСК, использование ксеногенным производных во время перепрограммирования и обслуживания клетки, и необходимость отслеживать пересаженных клеток в естественных условиях все важные препятствия для клинического применения плюрипотентных стволовых клеток (обзор Hentze соавторами. 2). Идеальное решение о необходимости отслеживания дифференцированных клеток после трансплантации будет включать визуально обнаруживаемый маркер, который устойчив к звукоизоляции, а также пестрота, независимо от приложения. Прочная и устойчивая выражение интегрированных генов являются наиболее легко достижимо, когда экзогенная ДНК вводят в безопасной гавани локусов; то есть, геномные сайты, которые позволяют достаточно транскрипцию интегрированного вектора и в то же время, смягчающего возмущения выражения в соседних генов 3. Один из таких сайтов, который был очень хорошо характеризует с момента его открытия в том, аденоассоциированный вирус Integrвания сайт 1 (AAVS1), в первом интроне белка фосфатазы 1 регуляторная субъединица 12С (PPP1R12C) гена. Этот локус, как было показано не только позволяют поддерживать и надежный выражение комплексных трансгенов с помощью расширенного времени в культуре и в пробирке дифференциации 3, но также и для защиты окружающей гены транскрипции возмущения 4; обе функции, как считается, из-за присутствия эндогенных хроматина элементов диэлектрик, фланкирующих AAVS1 сайт 5.
Достижения в геном технических средств Только за последнее десятилетие значительно облегчило легкость и эффективность, с которой генетические манипуляции в любой тип клеток может быть достигнута. В то время как ранние успешные эксперименты опиралась на чрезвычайно низкие уровни эндогенного гомологичной рекомбинации (HR) с введенной донора для достижения ген ориентации в ESCs 6,7, использование конкретных участков нуклеаз, таких как цинковый палец нуклеаз (ZFNs), которые СИГВВПficantly вызвать гомологичной рекомбинации через поколения перерыва двухцепочечной ДНК значительно повысило эффективность таких экспериментов 8,9. Повторное использование обоих транскрипционных активаторов, как эффекторов (сказок) растительного патогенного Ксанфомонас родов и прокариотических кластерные регулярно interspaced короткие палиндромные повторов (CRISPR) / Cas9 система в эффективные дизайнерские нуклеаз сайт-специфических сделал генного таргетинга в плюрипотентных стволовых клеток доступны и практически методология 10-13.
Недавняя статья описано эффективный способ для стабильной интеграции зеленого флуоресцентного репортера кассеты в AAVS1 безопасной гавани локуса человека ИПСК с помощью Сказка нуклеазы (Таленс) 14. Эти целевые иПСК сохранили свою флуоресценцию даже после направленной дифференцировки в кардиомиоциты и трансплантации в мышиной модели инфаркта миокарда (ИМ), обеспечивая убедительные доказательства полезности такихстабильно люминесцентные плюрипотентные стволовые клетки 14. Чтобы получить целевые колонии, метод гена-ловушка была использована в котором сплайсинга-акцептор (SA), 2А саморасщепляющиеся пептидную последовательность помещает пуромицин N-ацетил-трансферазы (PAC), ген под контролем эндогенного промотора PPP1R12C; Таким образом, только иПСК, которые включили донора ДНК в локусе AAVS1 выразить PAC, делая их доступными для на основе пуромицину сопротивления; (Рисунок 1, 15). Подробнее Этот протокол процедуры генерации AAVS1-GFP иПСК сообщили в недавней работе 14, в том числе процесс трансфекции ИПСК с Talens и 9,8 кб донора интеграции фрагмент 4.2kb ДНК в AAVS1 безопасной гавани локуса, выбрав ИПСК на основе пуромицину сопротивление, и сбор колонии для клональной экспансии. Методики, описанные в данном документе, могут быть применены ко многим генома инженерных экспериментов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка базальной мембраны Матрицы и покрытие Пластик
- Поместите замороженные базальной мембраны матрицу запас от -20 & deg; С на лед и оттаивают в течение ночи при 4 ° С.
- После оттаивания, пипетки 2 мг аликвоты базальной мембраны матрицы в предварительно охлажденные пробирки Эппендорфа. Храните их на -20 ° C до необходимости.
- Чтобы подготовить матричные покрытием пластин базальной мембраны, не таять одну аликвоту на льду до последнего куска льда в пробирку Эппендорф исчезает (обычно в течение ~ 2 ч).
- После оттаивания, добавить базальной мембраны матрицу 12 мл холодного (4 ° С) DMEM / F12, чтобы базальной мембраны раствора матрицы покрытия.
- Добавить матричного раствора, базальной мембраны в соответствующей культуральной судна. Для 6-луночный планшет с, обойтись 1 мл на лунку. Вихревой пластину, чтобы убедиться, матрица решений базальная мембрана полностью покрывает каждую лунку.
- Парафильмом запечатать базальной мембраны матрицы покрытием пластин / блюдо, и инкубировать при Роом температуре в течение 1 часа перед использованием. Кроме того, матричные пластинок, покрытых магазин базальной мембраны / блюда в 4 ° С и использовать в течение 2 недель покрытием.
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте экстра DMEM / F12 с базальной мембраной матрицы покрытием пластины / блюдо, чтобы предотвратить высыхание. Перед использованием 4 ° C хранить базальной мембраны матрицы покрытием пластин / блюдо, поместите его в кабинете биологической безопасности и дать ему нагреться до комнатной температуры в течение по крайней мере 30 мин. - Аспирируйте базальной мембраны матрица полностью перед добавлением среды и клеток.
2. Подготовка E8 среды
- Подготовка E8 культуральной среды путем оттаивания E8 добавки в течение ночи при 4 ° С.
- Удалить 10 мл E8 базальной среде со склада 500 мл и выбросить.
- Внесите всю 10 мл флакон E8 дополнения непосредственно в 490 мл E8 базальной среде. Не теплый полный E8 среду на водяной бане 37 ° C, а повторные колебания температуры могут ухудшить bFGF в КомплексыTE E8 средой.
- Используйте полный E8 среды в течение 2 недель добавлением добавки.
3. Таяние ИПСК
- Снимите флакон замороженных ИПСК из жидкого азота и место на сухом льду.
- Быстро разморозить флакона в водяную баню при 37 ° С; не взболтать флакон в водяной бане, пока только небольшой фрагмент льда останков.
- Спрей флакон с 70% этанола и трансфер в кабинете биологической безопасности.
- Добавить 1 мл каплям при комнатной температуре E8 среднего непосредственно в ампулу.
- Использование 2 мл пипетки, передавать по каплям клеточной суспензии в 9 мл среды E8 в 15 мл коническую трубку. Вихревой трубки часто, чтобы гарантировать, что клетки и среду хорошо перемешать быстро.
- Центрифуга клетки при 200 х г в течение 5 мин.
- Аспирата супернатант и ресуспендируют осадок клеток в соответствующий объем E8 с добавлением 10 мкМ Y-27632.
- Добавить клеток с соответствующим числом подвале MEMBRANе матрица-лунок, и место в 37 ° C, 5% CO 2 инкубаторе в течение ночи. Рекомендуется к пластине по меньшей мере 0,2 х 10 6 IPSC на лунку 6-луночный планшет для того, чтобы в быстром восстановлении после оттаивания.
4. Техническое обслуживание и текущий пассажи из ИПСК
- Обновить E8 среды ежедневно.
- Следить за морфологию и слияния клеток с помощью инвертированного микроскопа. иПСК высокого качества растут в плоских колоний с различными границ; отдельные колонии обладают "булыжника" вида.
- Прохождение клетки ИПСК когда они достигают ~ 70% слияния.
- Подготовка решения ЭДТА пассажи, добавив 0,9 г NaCl и 500 мкл 0,5 М ЭДТА до 500 мл DPBS. Все хорошо перемешать, чтобы растворить NaCl, и вакуумный фильтр для стерилизации. Теплый аликвоту пассирования раствора в 37 ° С водяной бане до пассажей.
- Для прохода, аспирации провел культуральной среды и промыть клетки один раз равным объемом теплой парованных решение. Аспирируйте и пипетки достаточно ЭДТА пассирования раствор для покрытия ячейки (1 мл на лунку 6-луночного планшета).
- Поместите клетки под инвертированным микроскопом и наблюдать колонии IPSC. Появление отверстия в колониях и привлеченных границ должно стать очевидным, в 2 до 5 мин.
- Тщательно аспирата ЭДТА пассажи решение.
- Использование 10 мл пипетки, обойтись 4 мл среды E8 (при использовании 6-луночный планшет) под высоким давлением непосредственно в каждую лунку, чтобы быть пассировать.
- Соберите сгустки IPSC, и группа распалась на соответствующее число скважин в зависимости от соотношения отколовшихся от 1: 8 до 1:12. Не слишком пипетки, а разбивка скопления клеток может привести к ухудшению жизнеспособности.
- Поместите пластину в инкубаторе, и рок пластину обратно и вперед и из стороны в сторону несколько раз, чтобы разогнать клетки.
5. Подготовка MEFs и ИПСК для Tansfection
- 48 ч до transfectioN, прохождение иПСК при ~ 1: 6 в четырех или более лунки базальной мембраны матрицы покрытием 6-луночного планшета, так, что они будут 70% сливной два дня, следовательно.
- На следующий день, оттаивают DR4 MEFs в MEF среды, состоящей из DMEM с высоким содержанием глюкозы () с добавлением 10% FBS и 1x-MEM NEAA.
- Пластина DR4 MEFs на две 10-см чашки при ~ 2 х 10 4 клеток / см 2 и инкубировать в течение ночи при 37 ° C.
- В день трансфекции MEF изменить среду Е8 с добавлением 10 мкМ Y-27632 30 минут, прежде чем выполнять трансфекцию на ИПСК.
- Необязательно: Если проточной цитометрии анализ ИПСК после трансфекции желательно, удалить базальной мембраны матрицы покрытием плиту от 4 ° C и место при комнатной температуре.
- Дополнительно: 4 ч до трансфекции, в дополнение предварительно трансфекции Ipsc культуру с Y-27632 в конечной концентрации 10 мкМ.
6. нежно-клеточной диссоциации реагента Леченией Трансфекцию ИПСК с помощью электропорации системы
- Удалить P3 первичной решение трансфекции клеток от 4 ° C и дайте ему нагреться до комнатной температуре в течение ~ 30 мин. Добавить весь 100 мкл дополнение к трансфекции раствора перед применением.
- Теплый нежно-диссоциации клеток реагент в C на водяной бане 37 °.
- Получить AAVS1 Talens (ЦТС-AAVS1-L1 и ЦТС-AAVS1-R1) и AAVS1-CAG-EGFP донора от -20 ° C.
- Удалить ИПСК из инкубатора и промыть один раз DPBS.
- Добавить 1 мл нежно-клеточной диссоциации реагента в каждую лунку, и инкубировали ИПСК при 37 ° С в течение 5 мин, или до более чем 50% клеток не отделены от культурального сосуда.
- Пипетки клетки вверх и вниз несколько раз с использованием пипетки P1000, чтобы отделить все оставшиеся клетки из культурального сосуда, и чтобы разбить комки Ipsc.
- Добавить 2 мл E8 среды в каждую лунку, и пипеток вверх и вниз несколько раз с помощью 10 мл пипетки Фюртэ разбить скопления клеток в одиночных камерах
ПРИМЕЧАНИЕ: Эффективность трансфекции значительно снижается, если скопления клеток не являются достаточно разбивки. - Сбор ИПСК в 15 мл коническую трубку, и центрифуге при 100 мкг в течение 3 мин.
- Аспирируйте супернатант и ресуспендирования клеток в минимальном количестве E8 среды.
- Граф клеток с использованием гемоцитометра после применения витальной окраски, например, 0,4% трипановым синим. Убедитесь, что клетки достаточно диссоциируют при подсчете (1-3 клеток в "комок").
- Не включать 3 × 10 6 клеток в каждую из двух 15 мл конические пробирки и снова вращаться при 100 х г в течение 3 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Низкая скорость центрифугирования уменьшает стресс клеток и позволяет легко ресуспензию ИПСК до электропорации. - Установите систему электропорации в конкретной программе камерного типа для эмбриона человека линии стволовых клеток H9 (Программа CB-150).
- После центрифугирования супернатант аспирата из CELл гранулы. С одной таблеткой, добавить 10 мкг HR донора в контрольном образце. Для другой гранулы добавляют 10 мкг HR донора, а также 5 мкг каждого Тален (PZT-AAVS1-L1 и PZT-AAVS1-R1) в экспериментальном образце.
- Ресуспендируют каждый осадок клеток в 100 мкл Р3 первичной трансфекции клеток раствором и передачи в кювету.
- Выполните трансфекции и сразу же добавить 500 мкл комнатной температуры E8 среды в каждую кювету.
- Передача по каплям трансфицированную ИПСК к одному 10-см блюдо с DR4 MEFs, полученного на стадии 5.4.
- Дополнительно: Добавить несколько капель из каждого эксперимента в одну лунку в базальной мембраны матрицы покрытием 6-луночный планшет, если проточной цитометрии Анализ на эффективность трансфекции желательно.
- Повторите шаги 6.15-6.17 закончить как образцы. На следующий день, мыть клетки с DPBS в два раза и перейти культуральной среды NutriStem, который, кажется, поддерживает IPSC культуру на фидерах лучше, чем E8.
- Трansient пики экспрессии EGFP в 48 до 72 ч после трансфекции; оценить эффективность трансфекции по желанию.
7. Пуромицин Выбор целевых ИПСК
- Начните выделение на Пуромицин 72 ч после трансфекции, когда иПСК до 70% слияния.
- Для NCRM5 ИПСК, начинают отбор пуромицин на 0,5 мкг / мл пуромицин (1/2 полной дозы) разведенной в NutriStem культуральной среде. Оптимальная концентрация пуромицин может варьироваться от 0,25 до 1 мкг / MLL для некоторых линий ИПСК.
- Культура иПСК в NutriStem + 0,5 мкг / мл пуромицин в течение 3 дней, ежедневно прохладительные среды.
- После 3-х дней, увеличивают концентрацию пуромицин до 1 мкг / мл.
- Культура иПСК до 1 мкг / мл пуромицин отбора еще 7 до 8 дней, или до тех пор, отдельные колонии не оказаться достаточно большой для колонии сбора.
8. колонии Выбор и расширение целевых ИПСК
- Использование базальной мембраныМатрица, чтобы покрыть 96-луночный планшет с дозирования 50 мкл раствора базальной мембраны матрицы покрытия (2 мг базальной мембраны разбавляют в матрице 12 мл DMEM / F12) в каждую лунку. Хранить пластины при 4 ° С в течение ночи перед использованием.
- После того матрица покрытием пластины базальной мембраны до комнатной температуры, аспирация базальной мембраны матрицу и внесите 100 мкл E8 с добавлением 10 мкМ Y-27632 в каждую лунку.
- Разместить инвертированного микроскопа в кабинете биологической безопасности, и брызги слегка с 70% этанола для стерилизации.
- Вытяните стекло пипетки Пастера над горелкой Бунзена, чтобы получить идеальный инструмент колонии-сбор, который имеет крошечный "крюк" на кончике. Стерилизовать 70% этанола, и поместите в капюшоне, чтобы высохнуть.
- Снимите блюдо, содержащее целевые колонии IPSC из инкубатора, и поместите в капот под микроскопом.
- Выберите ИПСК, прослеживая круг вокруг колонии границы с колонии-сбор инструмента.
- Используйте "крюк" инструмента колонии-сбор мягко очистить и удалить колонию IPSC от поверхности пластины. Для больших колоний, проводя X с колонии-сбор инструмента в квартале колония будет способствовать росту клеток после повторного посева.
- После того, как скопления клеток отделяются и свободно плавающий, использовать P200 пипеткой установить на ~ 30 мкл для сбора ИПСК. Пластина клеток непосредственно в 96-луночного планшета.
- Дополнительно: использовать P20 пипетки установлен на ~ 5 мкл для сбора ИПСК в пробирку Эппендорфа, затем добавить 50 мкл нежно-клеточной диссоциации реагента усваивается в течение 5 мин при 37 ° С. После расщепления, добавить 500 мкл E8 среды в пробирку Эппендорфа, чтобы разбавить диссоциации реагента нежно-клеток и замедления вращения клеток при 200 мкг в стандартной настольной микроцентрифуге в течение 5 мин. Тогда аспирации большую часть среды и оставить ~ 30 мкл для ресуспендирования и передачи клеток в 96-луночный планшет.
ПРИМЕЧАНИЕ: ЭтоПодход будет способствовать диссоциацию клеток скопления и быстрого расширения подобрали колонии. - Продолжить колонии комплектование до достаточное количество колоний ИПСК не были собраны (примерно 20-30 колоний на эксперимента рекомендуется).
- После колонии сбора, поместите 96-луночного планшета в инкубаторе в течение ночи. Обновить с полной E8 среде следующий день, и культуры до ~ 70% сливной.
- Прохождение клетки от 96-луночного в 24-и, а затем в 6-ну, как описано в шагах 4.5-4.10.
Примечание: объемы раствора ЭДТА и E8 среды должна быть пропорционально уменьшена при использовании скважин меньше, чем 6-луночный планшет с. - Оценка адресности слиянием ПЦР и Южной блот-анализа для подтверждения направленной интеграции кассету и отсутствию случайно вставленными векторов 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Визуализация протокола, представленный на рис 2, с периодами, в течение которого иПСК культивируют в другую среду, выделенную либо зеленый E8 или синий для NutriStem. Важно трансфекции только высококачественные ИПСК; изучить культуру кухни в течение планового технического обслуживания и убедитесь, что IPSC культуры содержат в основном отдельные колонии, несущие булыжной морфологию (рис 3а); дифференцированные клетки не должны занимать более 10% от культуры. Transfectability из ИПСК оценивается и оптимизированы с помощью небольшой Pmax-GFP вектор (рис 4A-Б), а трансфекции с Pmax-GFP, как правило, представляет максимально достижимое эффективность из-за его небольшого размера. Например, мы достигли 68,6% эффективности трансфекции с Pmax-GFP (рис 4б). Ориентация на AAVS1 безопасной гавани, иПСК пассируют, используя мягкий одноклеточных диссоциации реагента и трансфецируют AAVS1-Таленс и AAVS1-CAG-EGFP (плазмиды, изображенные на рисунке 1а). Трансфицированные иПСК затем высевали на подходящей плотности DR4 MEFs (фиг.3В). Переходный выражение AAVS1-CAG-EGFP пиков при 48 до 72 часов после трансфекции (фиг.3С); при желании, небольшая часть трансфицированных ИПСК могут быть FACS-анализа. NCRM5 иПСК могут быть трансфицированы с эффективностью 60,9% при использовании AAVS1-CAG-EGFP донора (рис 4в). Эффективность трансфекции может существенно отличаться; Для экспериментов, в котором GFP + фракция еще цене 10%, по-прежнему выбора пуромицин. После выполнения выбора пуромицину, индивидуальные клоны, отображающие равномерное свечение должно быть достаточно большим для колонии сбора (рис 3D). Для получения клонов, подходит колония находится под малым увеличением (рис 3Е) и выделяют первый розыску и расквартирования его (рис 3F-G). Расквартированных колонии затем аккуратно соскоблитьд из сосуда для культивирования (фиг 3H). Использование P200 пипетки, сотовые сгустки, которые затем передаются в одну лунку в базальной мембраны матрицы с покрытием 96-луночного планшета. иПСК должны приложить в течение 2-4 часов обшивки (рис 3i). Если вложение не наблюдается в течение 24 часов, Базальная мембрана матрица покрытия или Y-27632 лечение, скорее всего неоптимальной; Базальная мембрана матрица пальто новый 96-луночный планшет и подготовить свежий E8 + 10 мкм Y-27632, прежде чем выбрать любые другие колонии. После того, как в формате 96-луночного, направлены Ipsc клоны расширен и должен демонстрировать стабильную и равномерную экспрессию GFP (фиг 4D-E).
Рисунок 1: Джин ориентации векторов и ориентации схему. (A) Представления AAVS1-CAG-EGFP и ЦТС-AAVS1-L1 / R1 Talens плазмиды, используемые в данном исследовании. SA-2A элемент в плазмиде AAVS1-CAG-EGFP представляет собой сплайс-акцептора и 2а саморасщепляющиеся пептид, используемый для ограничения пуромицин N-ацетил-трансферазы (PAC) экспрессию гена в целевой интеграции-событий. Куриные β-актина глобина (CAG), промотор используется для управления экспрессией EGFP. (B) AAVS1 безопасной гавани, содержится в интрона 1 гена PPP1R12C, предназначен помощью Talens генерировать перерыв двухцепочечной ДНК. Это активирует гомологичной рекомбинации (HR) ремонта техники, которые затем использует AAVS1-CAG-EGFP донора (несущие плечами гомологии, фланкирующие сайт резки) в качестве субстрата для ремонта. Кассета встроена и ген РАС находится под контролем эндогенного промотора PPP1R12C.
Рисунок 2. Хронология генного таргетинга эксперимента. ИПСК культивируют70% слияния и пассируют ~ 1: 6 в день -2 (D-2). MEFs высевают в D-1, и иПСК собраны и трансфецируют на D0. В d1, носитель переключается на NutriStem и иПСК культивируют в течение еще двух дней, прежде чем пуромицин добавляют к среде при d3. Колонии, как правило, готовы для сбора на D12. Периоды, в течение которого иПСК культивируют в E8 среды выделены зеленым цветом, в то время как периоды NutriStem культуры в синий цвет.
Рисунок 3: ген IPSC ориентации представительства изображения () Этап изображение высокого ИПСК качества.. Обратите внимание на границу фазового яркий и булыжника, как морфология. (B) DR4 MEFs высевали при 2 х 10 4 клеток / см 2 через двадцать четыре часа после оттаивания. (C) семидесяти двух часов после трансфекции, EGFP + клетки очевидными если смотреть под флуоресцентным MICRoscope. (D) После пуромицин основе отбора ~ 14 дней, колонии, отображающие равномерное флуоресценции GFP являются достаточно большими, чтобы быть собраны. (ЕН) Типичные изображения процесса загрузки колонии. Колонии собирают с помощью вытащил пипетки Пастера, во-первых, рассказав колонию, а затем расквартирования его, чтобы получить меньшие скопления клеток. (I) поднято IPSC колонии прикрепляются к базальной мембраны матрицы поверхности, покрытой 96-луночного планшета в течение 2 4 ч. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 4: FACS анализ эффективности трансфекции и клоновых целевых ИПСК. (А) управления NCRM5 иПСК без трансфекции любой плазмиды. (В) NCRM5иПСК трансфицированные вектором небольшой тест Pmax-GFP являются FACS-анализу на экспрессию GFP. (С) временной экспрессии плазмиды AAVS1-CAG-EGFP оценивали путем FACS. (D) NCRM5-AAVS1-CAG-EGFP клон отображает равномерно положительно экспрессии EGFP, как показал анализ FACS. Обратите внимание на тесную кластеризации анализируемых ИПСК по сравнению с C). (E) флуоресценции образ расширенной NCRM5-AAVS1-CAG-EGFP целевой клона.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Наиболее важные шаги для успешного поколения AAVS1 безопасной гавани нацелены человека иПСК являются: (1) эффективной доставки Тален и донорские плазмиды в ИПСК с помощью трансфекции; (2) оптимизация диссоциации ИПСК в одиночные клетки до трансфекции и покрытия плотностью после трансфекции; (3) оптимизация дозы и время лекарственной выбор, основанный на росте IPSC линии; (4) тщательно анализируя и выбирая целевых колонии и передачи новой пластинкой / лунку. По сравнению с аналогичными методами, используемыми в работе Hockemeyer в 10, это протокол, используемый пару с открытым исходным кодом AAVS1-Таленс, другой IPSC диссоциации реагента, а также различные трансфекции устройство для доставки Talens и донорские векторы, которые помогли уменьшить количество ИПСК, используемого в Эксперимент при достижении высокой трансфекции и ориентации эффективности.
Для достижения редактирование гена высокой эффективности в человеческих ИПСК, важно, чтобы первый оптимизировать доставку гена EDITing реагенты (ДНК / РНК), в то время как балансировка острых клеточной гибели способ доставки и реагенты вызывают к ИПСК. Цель состоит в том, чтобы максимально повысить эффективность доставки, сохраняя при этом терпимо низкий уровень гибели клеток. Так как это очень легко приготовить большое количество AAVS1-Тален плазмид, которые могут достичь> 50% эффективности HR с помощью наркотиков отбора в человеческих ИПСК, это не нужно делать мРНК из Тален плазмид. Задача доставки исходит от больших по доноров плазмид, которые в этом случае составляет ~ 10 кб. Рекомендуется использовать донора AAVS1-CAG-EGFP проверить работоспособность доставки в конкретных человеческих линий ИПСК, а не с помощью pMaxGFP входит в комплект трансфекции, потому что pMaxGFP является ~ 3,5 кб небольшой плазмиды и очень легко доставить в любую клеток. AAVS1-CAG-EGFP донор может быть изменен с помощью ферментов рестрикции, показанные на рисунке 1А ориентированы на различные трансгены в AAVS1 локуса. Еще 12 кб донор, который содержит 6,4 кб кассету для замены CAG-EGFP, имеет бытьан успешно использованы для достижения аналогичного трансфекции и ориентации эффективность (данные не показаны). В общем, человека иПСК Среди типов клеток труднодоступных трансфекции и эффективность доставки больших плазмид может быть как 5-10%, как измерено с помощью проточной цитометрии анализа GFP + клеток. Кроме того оптимизации эффективности трансфекции зависит от правильного диссоциации человека ИПСК в отдельные клетки, клеточные скопления, потому что уменьшит возможность доставки гена редактирования реагенты в каждую ячейку. Этот протокол использует нежный и диссоциации быстро рабочую ячейку реагента, но лечения ИПСК более чем 10 минут не рекомендуется. Обычно культуры Ipsc составляет менее 80% вырожденная, если следующим шагом 5,1, делая 5-минутной инкубации с предварительно нагретой нежно-клеточной диссоциации реагента, как правило, достаточной для диссоциации ИПСК на отдельные клетки с осторожно пипеткой. Если не все клетки могут быть диссоциированы на отдельные клетки через 10 мин обработки, так как культура клеток является более кон-свободно или колонии становятся очень компактный, просто собирать рекомендуемое количество одиночных клеток из более колодец / пластин и оставить плотно прикрепленные клетки сзади. Тяжелая пипетки не рекомендуется, поскольку механические ножницы более вредным для клеток, чем ферментативной диссоциации. При работе с раннего прохода ИПСК (до прохождение # 15), нежный практика диссоциации является очень важным для выживания клеток, потому что клетки уже более чувствительны к трансфекции стресса, чем поздно проход ИПСК. Если трудно добиться высокой эффективности в обоих трансфекции клеток и выживание, выбрать практику, что дает высокую эффективность трансфекции. После трансфекции клетки должны быть покрыты при плотности, что позволит достичь 50-80% слияния в день 3, когда начинается препарат отбора. Поскольку каждый IPSC линия растет по-разному, после трансфекции покрытие плотность может должны быть оптимизированы для каждой клеточной линии. Высокая плотность покрытия может привести к чрезмерной слияния, что снижает эффективность друг-отбор, в то время как крайняя низкая плотность покрытия может привести к отложенной восстановления и роста резистентных колоний. Обычно 3000000, начиная иПСК достаточно, чтобы быть покрыты в ½ до 2 10 см чашках в зависимости от выживания и роста конкретных ИПСК. Кроме того, при использовании только что созданный или пока еще непроверенное IPSC линию, создавая кривую пуромицину убить, чтобы установить самую низкую эффективную дозу в нетрансфицированных клеток может быть необходимой; IPSC линии могут значительно различаться по своей чувствительности к выбору пуромицином. В MEFs были использованы для выбора, потому что они появляются, чтобы поддержать рост IPSC лучше, чем некоторые внеклеточного матрикса при выборе препарата. Как правило, не менее 5 дней пуромицин на 1 мкг / мл или 7 дней при 0,5 мкг / мл, необходимых для завершения выбора. Наконец, колония-сбор метод имеет решающее значение для сохранения всех целевых колонии после выбора препарата. Нежный пипетки или лечение диссоциации реагента помогает разрушить колонии на несколько частей равномернораспределяются в новой скважины, и, следовательно, может ускорить расширение колоний. При использовании диссоциации реагента заключается в выделении отобранных колоний до посева, убедитесь, что он достаточно разбавляют> 10x среду после лечения, потому что остаточная диссоциации реагента может убить перенесенные клетки, если не на ночь. Независимо от того, какой метод используется, практикуя колонию сбор перед реальными экспериментами настоятельно рекомендуется.
Как описано стратегия использует метод гена-ловушки для управления экспрессией гена PAC от эндогенного промотора PPP1R2C, значительно получения более 30 колоний, не должны оказаться необходимым. SA-2A связан выбор ПКК теоретически исключает случайной интеграции только клетки, но дополнительное случайное интегрирование (ы) может происходить в ИПСК несущих успешных целевых интеграции. В большинстве случаев, почти 100% клонов с наркотиками выбран таргетинг интеграции и ~ 10-40% из них имеют дополнительную случайный IntegratiДополнения. Большинство целевых клонов, как правило, имеют одну-аллель адресности, хотя экспериментов, в которых имеет место> 50% дважды аллель таргетинг. Переменная частота дополнительных случайных интеграции, а также соотношение одно- сравнению с двойной аллель таргетинга, трудно контролировать. Поэтому, выбирая ~ 20 колоний рекомендуется обеспечить одинарного или двойного аллель таргетинг только клоны могут быть получены. В свете неудачных экспериментов таргетирования переоценки ставок transfectability, выживания и роста клеток-мишеней ", эффективность нуклеаз в определенной клеточной линии, и качество доноров и нуклеазы препаратов рекомендуется перед повторной попыткой эксперимент во всей его полноте.
Следует отметить, что подобные стратегии доноры генов-ловушки могут быть использованы для нацеливания других активных генов, но не подходит для тихого нацеливания гена, который требует независимого промотор для управления экспрессией гена выбираемый. Кроме того, в то время как гое AAVS1 безопасной гавани, как считается, открытую структуру хроматина, это не гарантирует, что любой трансгенов может быть выражена сильно в этом локусе. В самом деле, наше недавнее отчет показал, что несколько слабых промоутеры не смогли проехать экспрессии этого флуоресцентный ген репортер после целенаправленной интеграции на AAVS1 локуса 14.
Этот протокол фокусируется на использовании хорошо проверенные Talens целевой хорошо изученную безопасной гавани локус в геноме человека. Эти методы являются очень воспроизводимые и легко адаптируется для многих приложений, связанных с какой-либо трансген. По сравнению с геном инженерных методов, использующих случайные интеграции, AAVS1-Тален опосредованного генного таргетинга является высокоэффективным и специфические, и в случае ИПСК, приводит к стабильно флуоресцирующих клеток, которые имеют потенциал для расширения и дифференцироваться в любой тип клеток человека. Хотя этот протокол не описать дизайн и проверку дизайнерских нуклеаз или оценку целевых колоний ИПСК для рРопер интеграция кассеты и мимо анализ, несколько отличные протоколы описал эти аспекты методологии подробно 16-18. В IPSC культуры и пассажи методы Feeder-бесплатное пользование E8 среду также подробно описаны в предыдущей публикации 19. Выше протоколом, в то время оптимизированы для генной того в AAVS1 безопасной-гавани человека ИПСК, может служить в качестве общего шаблона для экспериментов с сайт-специфической нуклеазы-опосредованного генного редактирование / добавление с использованием гомологичной рекомбинации донора в различных типов клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-Free, 10 ml | Corning | 354230 | Store at -20 °C. |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320-033 | Store at 4 °C. |
| Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates | Corning | 3506 | |
| Essential 8 Medium | Life Technologies | A1517001 | Store basal medium at 4 °C. Store supplement at -20 °C. |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | Store at room temp. Once dissolved in H2O, store at -20 °C. |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886-500G | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies | 15575-020 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190-250 | |
| 100 mm TC-Treated Culture Dish | Corning | 430167 | |
| DR4 MEF 2M IRR - Academic | GlobalStem | GSC-6204G | Store in liquid Nitrogen. |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 11995-040 | Store at 4 °C. |
| Defined Fetal Bovine Serum, US Origin | HyClone | SH30070.03 | Store at -20 °C. Thaw at 4 °C overnight and aliquot. Store aliquots at -20 °C until needed. |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Life Technologies | 11140-050 | Store at 4 °C. |
| 4D-Nucleofector Core unit | Lonza | AAF-1001B | part of the electroporation system |
| 4D-Nucleofector X unit | Lonza | AAF-1001X | part of the electroporation system |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (24 RCT) | Lonza | V4XP-3024 | Upon arrival, remove Primary Cell Solution and supplement and store at 4 °C. |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies | A1110501 | Store at -20 °C. Thaw overnight at 4°C and warm an aliquot in a 37 °C water bath before use. |
| NutriStem XF/FF Culture Medium | Stemgent | 01-0005 | Store at -20 °C. Thaw overnight at 4 °C |
| AAVS1 TALENs (pZT-AAVS1-L1 and pZT-AAVS1-R1) | Addgene | 52637 and 52638 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AAVS1-CAG-EGFP Homologous Recombination donor | Addgene | 22212 | |
| Puromycin Dihydrochloride | Life Technologies | A11138-03 | Store at -20 °C. Prepare working aliquots of 1 mg/ml in ddH2O. |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Sorvall Legend XTR (Refrigerated), 120 V 60 Hz | Thermo Scientific | 75-004-521 | |
| TX-750 4 × 750 ml Swinging Bucket Rotor | Thermo Scientific | 75003607 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Hentze, H., Graichen, R., Colman, A. Cell therapy and the safety of embryonic stem cell-derived grafts. Trends Biotechnol. 25 (1), 24-32 (2007).
- Smith, J. R., et al. Robust, persistent transgene expression in human embryonic stem cells is achieved with AAVS1-targeted integration. Stem Cells. 26 (2), 496-504 (2008).
- Lombardo, A., et al. Site-specific integration and tailoring of cassette design for sustainable gene transfer. Nat Methods. 8 (10), 861-869 (2011).
- Ogata, T., Kozuka, T., Kanda, T. Identification of an insulator in AAVS1, a preferred region for integration of adeno-associated virus DNA. J Virol. 77 (16), 9000-9007 (2003).
- Zwaka, T. P., Thomson, J. A. Homologous recombination in human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 21 (3), 319-321 (2003).
- Urbach, A., Schuldiner, M., Benvenisty, N. Modeling for Lesch-Nyhan disease by gene targeting in human embryonic stem cells. Stem Cells. 22 (4), 635-641 (2004).
- Hockemeyer, D., et al. Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases. Nature biotechnology. 27 (9), 851-857 (2009).
- Zou, J., et al. Gene targeting of a disease-related gene in human induced pluripotent stem and embryonic stem cells. Cell stem cell. 5 (1), 97-110 (2009).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nature. 29 (8), 731-734 (2011).
- Sanjana, N. E., et al. A transcription activator-like effector toolbox for genome engineering. Nature protocols. 7 (1), 171-192 (2012).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Ding, Q., et al. Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs. Cell stem cell. 12 (4), 393-394 (2013).
- Luo, Y., et al. Stable Enhanced Green Fluorescent Protein Expression After Differentiation and Transplantation of Reporter Human. Induced Pluripotent Stem Cells Generated by AAVS1 Transcription Activator-Like Effector Nucleases. Stem Cells Transl Med. 3 (7), 821-835 (2014).
- Zou, J., et al. Oxidase-deficient neutrophils from X-linked chronic granulomatous disease iPS cells: functional correction by zinc finger nuclease-mediated safe harbor targeting. Blood. 117 (21), 5561-5572 (2011).
- Luo, Y., Rao, M., Zou, J. Generation of GFP Reporter Human Induced Pluripotent Stem Cells Using AAVS1 Safe Harbor Transcription Activator-Like Effector Nuclease. Curr Protoc Stem Cell Biol. 29, 5A.7.1-5A.7.18 (2014).
- Peters, D. T., Cowan, C. A., Musunuru, K. Genome editing in human pluripotent stem cells. StemBook. , Harvard Stem Cell Institute. Cambridge, MA. Available from: http://www.stembook.org/node/1438 (2008-2013).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat Protoc. 7, 2029-2040 (2012).
