Introduction
胚性幹細胞のような多能性幹細胞（iPS細胞）へのヒト体細胞を再プログラムする能力は、最初高橋らによって発見された2007年1に4つの転写因子を発現するレトロウイルスで形質導入したヒト皮膚線維芽細胞（いわゆるダビング山中のOct3因子/ 4、Sox2の、c-Mycの、およびKlf4）の形態、増殖、遺伝子発現、およびエピジェネティックな状態に基づいて、ヒト胚性幹細胞（hESC）と非常に類似であることが示された。決定的に、iPS細胞はまた、3つの胚葉全て1の細胞に分化することができる。性IPSCの増殖能と分化能力は、彼らに非常に魅力的なツールになります。特定の疾患に罹患している患者からの細胞を再プログラミングすることによって、iPS細胞は、in vitro疾患モデル系としての潜在的治療薬としての両方に使用することができる。
後者の目的のために、いくつかの問題がiPS細胞の可能性を最大限前に対処する必要があります臨床設定で実現することができる。 in vitroで培養したhESCおよびiPSCの再プログラミングおよび細胞メンテナンス時異種誘導体の使用の腫瘍形成能、およびin vivoで移植された細胞を追跡する必要性は 、Hentze らによるレビュー、多能性幹細胞の臨床応用（のすべての重要なハードルである。 2）。移植後に関係なく、アプリケーションのサイレンと斑入り抵抗し、視覚的に検出可能なマーカーを伴うだろう分化した細胞を追跡する必要性に理想的なソリューション。外来DNAが安全ハーバー遺伝子座に導入されたときに統合された導入遺伝子の堅牢かつ持続的な表現は、最も容易に達成可能である。つまり、統合されたベクターの十分な転写を可能にするゲノム部位の隣接遺伝子3における発現の摂動を緩和し、同時に一方で。非常によく、その発見以来、特徴付けられているそのようなサイトには、アデノ随伴ウイルスINTEGRですタンパク質ホスファターゼ1調節サブユニット12C（PPP1R12C）遺伝子の第1イントロンにおけるATIONサイト1（AAVS1）、。この遺伝子座は、培養およびインビトロ分化3 に伸長時を統合導入遺伝子の持続的かつ強固な発現を可能にするだけでなく、転写摂動4から周囲の遺伝子を保護するだけでなく、示されている。両方の機能に起因AAVS1部位5に隣接する内因性のクロマチンインスレーターエレメントの存在のためであると考えられている。
単に過去10年間のゲノムエンジニアリングツールの進歩は著しく、任意の細胞型で遺伝子操作を達成することができる容易さと効率性を促進した。初期の成功した実験では、ESCは6,7に遺伝子ターゲッティングを達成するために導入された供与体と内因性相同組換え（HR）の非常に低レベルの依拠が、このようなジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFNは）、有意と、部位特異的ヌクレアーゼの使用ficantlyような実験8,9の効率を大幅に増加している二本鎖DNA切断の生成を介して相同組換えを誘導する。効率的なサイト固有のデザイナーヌクレアーゼに植物病原性キサントモナス属の転写活性化因子のようなエフェクター（テイルズ）および原核クラスタ化され、定期的にinterspaced短い回文反復（CRISPR）/ Cas9システムの両方の再利用は、多能性幹細胞でアクセス可能な遺伝子ターゲティングを行っていると実用的な方法論10-13。
最近の論文は、TALEヌクレアーゼ（TALENs）14を用いてヒトiPS細胞でAAVS1セーフハーバー座への緑色蛍光レポーターカセットの安定した組み込みのための効率的な方法を説明した。これらの標的性IPSCは、このような有用性のための強力な証拠を提供しても、心筋梗塞（MI）のマウスモデルへの心筋細胞移植に向け分化後に蛍光を維持安定した蛍光多能性幹細胞14。標的コロニーを得るために、遺伝子トラップ法は、スプライシングアクセプター（SA）は、図2（a）の自己切断ペプチド配列は、内因性PPP1R12Cプロモーターの制御下のピューロマイシン-N-アセチルトランスフェラーゼ（PAC）の遺伝子を配置し、前記使用された。したがって、AAVS1遺伝子座にDNA供与体を取り込んだだけiPS細胞は、彼らがピューロマイシン耐性に基づいて選択可能なレンダリング、PACを表現。 （ 図1、15）。このプロトコルは、AAVS1-GFP iPS細胞を生成する手順は、上のベースの性IPSCを選択、AAVS1セーフハーバー座に4.2キロバイトのDNA断片を統合するTALENsでiPS細胞をトランスフェクトするプロセスを含む、最近の論文14、および9.8キロバイトドナーで報告詳細をピューロマイシン耐性、およびクローン増殖のためにコロニーを選ぶ。本明細書に記載の技術は、多くのゲノム工学実験に適用することができる。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.基底膜マトリックスの調製とプラスチック製品の塗装
- 氷の上に-20℃から凍結された基底膜マトリックスの株式を置き、4℃で一晩解凍。
- 解凍後、予め冷却したエッペンドルフチューブに基底膜マトリックスのピペット2mgのアリコート。必要になるまで-20℃でこれらを保管してください。
- 基底膜マトリックスでコーティングされたプレートを製造するために、（通常〜2時間以内）エッペンドルフチューブ消える氷の最後の一片まで氷上に1アリコートを解凍。
- 解凍後、基底膜マトリックスコーティング溶液を作製し、冷（4℃）DMEM / F12を12mlに基底膜マトリックスを追加する。
- 適切な培養容器に基底膜マトリックス溶液を加える。 6ウェルプレートについて、ウェル当たり1mlを分配する。基底膜マトリックス溶液が完全に、各ウェルを確実に覆うようにするにプレートを渦巻。
- パラフィルムは、基底膜マトリックスでコーティングされたプレート/皿をシールし、カンガルーインキュベート使用前に1時間メートル温度。 4℃での代わりに、店の基底膜マトリックス被覆プレート/ディッシュとコーティングの2週間以内に使用します。
注：乾燥を防ぐために基底膜マトリックスでコーティングされたプレート/皿に余分なDMEM / F12を追加します。 4℃で保存し基底膜マトリックスでコーティングされたプレート/皿を使用する前に、生物学的安全キャビネットに入れて、少なくとも30分間室温に来ることができます。 - 完全培地と細胞の添加の前に吸引基底膜マトリックス。
E8媒体の調製
- 4℃で一晩E8サプリメントを解凍しE8培地を準備します。
- 500ミリリットルのストックからE8基本培地の10ミリリットルを取り外し、廃棄します。
- 直接E8基礎培地の490ミリリットルにE8サプリメントの全体10ミリリットルバイアルをピペット。繰り返し温度変動が攻殻でのbFGFを分解することができるように、37℃の水浴中で完全E8媒体を暖めるしないTE E8媒体。
- サプリメントの添加2週間以内に完全なE8媒体を使用してください。
性IPSCの3.解凍
- ドライアイス上で液体窒素や場所から凍結したiPS細胞のバイアルを取り外します。
- 急速に37℃の水浴中でバイアルを解凍する。氷の遺跡の唯一の小さなフラグメントまで水浴中でバイアルを旋回。
- 生物学的安全キャビネットに70％エタノールおよび転送バイアルスプレー。
- バイアルに直接室温E8メディア滴下の1ミリリットルを追加します。
- の2mlピペットを用いて15mlのコニカルチューブにE8培地9ml中に細胞懸濁液を滴下移す。細胞および培地はすぐによく混ぜていることを確認するために頻繁にチューブを旋回。
- 5分間200×gで細胞を遠心します。
- 上清を吸引し、10μMのY-27632を補足したE8の適切な容量の細胞ペレットを再懸濁します。
- 地下室の適切な数にセルを追加membran一晩37℃、5％CO 2インキュベーター内の電子マトリックスで被覆したウェル、および場所。それは、解凍後迅速な復旧を可能にするために、6ウェルプレートのウェルあたり少なくとも0.2×10 6 IPSCをメッキすることをお勧めします。
4.メンテナンスとiPS細胞のルーチン継代
- 毎日のE8媒体をリフレッシュします。
- 倒立顕微鏡で細胞の形態および集密度を監視します。高品質のiPS細胞は、明確な境界線を持つフラットコロニーに成長。個々のコロニーを「丸石様」の外観を有する。
- 継代性IPSC細胞を、それらが〜70％コンフルエントに達する。
- 500ミリリットルのDPBSに0.9グラムのNaClと500μlの0.5 M EDTAを加えることによって、EDTA継代溶液を調製する。滅菌するためにNaCl、および真空フィルターを溶解するために十分に混合する。継代の前に37℃の水浴中で継代溶液のアリコートを温める。
- 通路に、吸引は、培地を費やし、暖かいのパ等量の細胞を1回洗浄ソリューションをsaging。コートに吸引し、ピペット十分なEDTA継代液細胞（6ウェルプレートのウェルあたり1ml）。
- 倒立顕微鏡下で細胞を置き、IPSCのコロニーを観察します。コロニー育ち境界内の穴の外観は、2から5分以内に明らかとなるはずです。
- 慎重にEDTA継代ソリューションを吸引。
- を10mlピペットを用いて、十分に継代する各直接高圧下（6ウェルプレートを使用する場合）E8培地4mlを分注する。
- IPSCの塊を収集し、1から分割比に応じて、井戸の適切な数に分割さ：1:12 8。細胞塊の解離が悪い可能性になりますように、オーバーピペットはありません。
- インキュベーター内でプレートを置き、細胞を分散させるために、前後および左右に数回プレートを揺する。
TansfectionのためのMEFとiPS細胞の5準備
- transfectioする48時間前基底膜マトリックスコートした6ウェルプレートの4つ以上のウェルに6、それらは従って二日間70％コンフルエントになるように：〜1でnは、通過性IPSC。
- 翌日、10％FBSおよび1×MEM-NEAAを補充したDMEM（高グルコース）からなるMEF培地にDR4 MEFを解凍。
- 〜2×10 4細胞/ cm 2の二つの10cmディッシュにプレートDR4 MEFを、37℃で一晩インキュベートする。
- トランスフェクションの日に、iPS細胞にトランスフェクションを行う前に、10μMのY-27632の30分を補ったE8にMEF培地を変更します。
- オプション：iPS細胞のフローサイトメトリー分析の後、トランスフェクションが所望される場合、室温で4℃、場所から基底膜マトリックスでコーティングされたプレートを取り外す。
- オプション：トランスフェクションの前に4時間、10μMの最終濃度で、Y-27632で事前にトランスフェクションIPSC文化を補う。
6.ジェントル細胞解離試薬トリートメントND性IPSCのトランスフェクションは、エレクトロポレーションシステムを使用して
- 4℃からP3一次細胞トランスフェクション溶液を除去し、それは〜30分間室温に来ることができます。使用前にトランスフェクション溶液に全体を100μlのサプリメントを追加します。
- 37℃の水浴中で穏やかな暖かい細胞解離試薬。
- AAVS1 TALENs（PZT-AAVS1-L1とPZT-AAVS1-R1）-20℃からとAAVS1-CAG-EGFPドナーを取得します。
- インキュベーターからiPS細胞を取り出し、DPBSで一度洗う。
- ウェル当たり穏やかな細胞解離試薬1 mLを加え、5分間37℃でiPS細胞をインキュベート、または50％を超える細胞が培養容器から解離するまで。
- アップおよび培養容器から残りの細胞を解離するために、とIPSC塊を分割するP1000ピペットを用いて数回上下細胞をピペットで。
- フュルトする10ミリリットルピペットを用いて各ウェルにE8培地2mlを追加し、ピペットを上下に数回ER単一細胞に細胞塊を分解
注：細胞塊が十分に細分化されていない場合のトランスフェクション効率が著しく低下する。 - 15ミリリットルコニカルチューブでiPS細胞を収集し、3分間100×gで遠心。
- E8媒体の最小限の量で、上清を吸引し、そして細胞を再懸濁する。
- 生体染色などの0.4％トリパンブルーを適用した後の血球計数器を用いて細胞を数える。 （「塊」あたり1-3細胞）をカウントしながら、細胞が十分に解離していることを確認します。
- 2 15ミリリットルコニカルチューブのそれぞれに3×10 6個の細胞を分配し、3分間100×gで再びスピンダウン。
注：低速遠心分離細胞ストレスを軽減し、エレクトロポレーションの前にiPS細胞の容易な再懸濁することができます。 - ヒト胚性幹細胞株H9（プログラムCB-150）のための細胞型特異的プログラムへのエレクトロポレーションシステムを設定します。
- 遠心分離した後、CELから上清を吸引Lペレット。 1ペレットに、対照試料としてのHRドナー10μgのを追加します。他のペレットに実験試料として各TALEN5μgの（PZT-AAVS1-L1とPZT-AAVS1-R1）と一緒に、HRドナー10μgのを追加します。
- P3一次細胞のトランスフェクション溶液100μlの各細胞ペレットを再懸濁し、キュベットに移す。
- トランスフェクションを行い、すぐにそれぞれのキュベットに室温E8培地500μlを添加する。
- ステップ5.4で作成DR4のMEFのを含む1つの10 cmディッシュにトランスiPS細胞の滴下を転送します。
- オプション：トランスフェクション効率のanaylsisフローサイトメトリーが所望される場合は基底膜マトリックスコートした6ウェルプレートの1ウェルに、各実験からの数滴を加える。
- 繰り返して両方のサンプルを完了するために6.15から6.17までを繰り返します。次の日は、二回DPBSで細胞を洗浄し、E8よりも良いフィーダー上IPSC文化をサポートするために表示されNutriStemに培養液を切り替える。
- Trは48時間トランスフェクション後72時ansient EGFP発現のピーク。必要に応じて、トランスフェクション効率を評価する。
目標とされたiPS細胞の7マイシン選択
- 性IPSCは、70％の集密度に達したときにピューロマイシン選択をトランスフェクション後72時間を開始します。
- NCRM5性IPSCは、0.5 / mlのピューロ（1/2フル用量）NutriStem培養培地中に希釈された時にピューロマイシン選択を開始する。最適ピューロ濃度は0.25からいくつかのIPSCライン用の1μg/ MLLに異なる場合があります。
- NutriStem文化性IPSC毎日の中をリフレッシュする3日間+ 0.5 / mlのピューロ、。
- 3日後、1μg/ mlのピューロマイシンへの濃度を増加させる。
- 別の7から8日間/ mlピューロマイシン選択1μgの下に、または個別のコロニーがコロニーピッキングのための十分な大き表示されるまで、文化性IPSC。
8.コロニーをピッキングし、ターゲットiPS細胞の拡大
- 基底膜を使用して、コーティングするマトリックスを各ウェルに（12ミリリットルDMEM / F12に希釈し2mgの基底膜マトリックス）基底膜マトリックスコーティング溶液50μlを分配することにより、96ウェルプレート。使用前に4℃で一晩プレートを保管してください。
- 基底膜マトリックスでコーティングされたプレートを室温にさせた後、基底膜マトリックスを吸引し、10μMのY-27632各ウェルに補充した100μlのE8を分配する。
- 生物学的安全キャビネットに倒立顕微鏡を置き、滅菌するために70％のエタノールで軽くスプレー。
- 先端に小さな「フック」があり、理想的なコロニーピッキングツールを入手するためにブンゼンバーナー上のガラスパスツールピペットを引き出します。 70％のEtOHで滅菌し、乾燥するフード内に置く。
- インキュベーターから目標とIPSCのコロニーを含むシャーレを取り出し、顕微鏡下でフード内に配置します。
- コロニーピッキングツールを使用してコロニーの境界線の周りに円をトレースすることによりiPS細胞を選択してください。
- 優しくこすり、プレートの表面からIPSCコロニーを削除するには、コロニーピッキングツールの「フック」を使用してください。大きなコロニーについて、コロニーを再メッキ後の細胞の成長を促進する四半期にコロニーピッキングツールを使用してXを描く。
- 細胞塊が切り離され、自由に浮遊していると、〜にiPS細胞を収集するために30μlの設定P200ピペットを使用しています。直接96ウェルプレートに細胞をプレート。
- オプション：その後、37℃で5分間消化するために、50μlの穏やかな細胞解離試薬を追加し、エッペンドルフチューブにiPS細胞を収集するために〜5μlに設定P20ピペットを使用しています。消化後、穏やかな細胞解離試薬を希釈し、5分間標準テーブルトップ微量200×gで細胞をスピンダウンするエッペンドルフチューブに500μlのE8媒体を追加します。次に、培地のほとんどを吸引し、96ウェルプレートに細胞を再懸濁し、転送するために〜30μlのままにしておきます。
注：このアプローチは、細胞塊と取り出しコロニーの迅速な拡大の解離を促進する。 - IPSCコロニーの十分な数が収集されるまで、コロニーピッキングを継続（約実験あたり20〜30個のコロニーを推奨します）。
- コロニーピッキングした後、一晩インキュベーター内で96ウェルプレートを配置。 〜70％コンフルエントになるまで完全E8媒体翌日、そして文化にリフレッシュします。
- への96ウェルから継代細胞を24ウェル、その後に6ウェル、ステップ4.5から4.10に記載されているように。
注：6ウェルプレートよりも小さいウェルを使用した場合EDTA溶液およびE8媒体の体積は比例して減少されるべきである。 - ランダムに挿入されたベクターの16の標的カセットの統合と存在しないことを確認するために、接合PCRおよびサザンブロット分析によって成功を目標と評価する。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
プロトコルの可視化は、iPS細胞がNutriStemのいずれかのためE8緑色または青色で強調異なる培地で培養している期間に、 図2に設けられている。それは、高品質のiPS細胞をトランスフェクトすることが重要である。定期的なメンテナンスを通じて培養皿を調べ、IPSC培養は玉石様の形態（ 図3A）を有する、主に個別のコロニーが含まれていることを確認します。分化した細胞は、培養の10％以上を占めるべきではない。 pMaxに-GFPでのトランスフェクションは、一般的に、その小さなサイズに達成可能な最大効率を表すようにiPS細胞のトランスフェクション能力は、小さなpMaxに-GFPベクター（ 図4A-B）を用いて評価し、最適化されています。例えば、我々はpMaxに-GFP（ 図4B）と68.6パーセントのトランスフェクション効率を達成した。 AAVS1セーフハーバーをターゲットに、iPS細胞は、穏やかな、単一細胞解離試薬を用いて継代されるとAAVS1-TALENsとAAVS1-でトランスフェクトするCAG-EGFP（プラスミドは、 図1Aに示される）。トランスフェクションされたiPS細胞は、その後DR4のMEF（図3B）の適当な密度でプレーティングする。 48〜72時間後にトランスフェクション（ 図3C）でAAVS1-CAG-EGFPピークの一過性発現。所望ならば、トランスフェクトされたiPS細胞の小さな部分は、FACS分析することができる。 NCRM5性IPSCはAAVS1-CAG-EGFP供与体（ 図4C）を使用して、60.9％の効率でトランスフェクトすることができる。トランスフェクション効率を大幅に変えることができる。 GFP +画分にもと低い10％であることを特徴とする実験のために、ピューロマイシン選択に進みます。ピューロマイシン選択を行った後、均一な蛍光を表示する個々のクローンを、コロニーピッキング（ 図3D）のために十分に大きくなければならない。クローンを選ぶためには、適切なコロニーは、低倍率（ 図3E）の下に配置され、最初のトレースとそれ（ 図3F-G）四分で単離する。宿舎コロニーを優しくこすりされている培養容器（ 図3H）からD。 P200ピペットを用いて、細胞塊は、次に基底膜マトリックスでコーティングされた96ウェルプレートの1ウェルに移す。性IPSCは、メッキの2〜4時間（ 図3I）以内に取り付ける必要があります。アタッチメント24時間以内に観察されていない場合、基底膜マトリックスコーティング又はY-27632処理は、おそらく、サブ最適であった。基底膜マトリックスコート新しい96ウェルプレートとこれ以上コロニーを選ぶ前に、新鮮なE8 +10μMのY-27632を準備します。一度、96ウェルフォーマットで、IPSCクローンが拡張され、GFP（ 図4D-E）の安定で均一な発現を示すべき標的。
図1：ジーンターゲティングベクターと回路図をターゲットに。 AAVS1-CAG-EGFPの（A）表現、及び本研究で用いたPZT-AAVS1-L1 / R1 TALENsプラスミド。 SA-AAVS1-CAG-EGFPプラスミド中の2A族元素は、ターゲット統合イベントにピューロマイシンN-アセチルトランスフェラーゼ（PAC）は、遺伝子発現を制限するために使用されるスプライスアクセプターおよび2A自己切断ペプチドを表す。ニワトリβアクチングロビン（CAG）プロモーターは、EGFPの発現を駆動するために使用される。PPP1R12C遺伝子のイントロン1内に含まれる（B）AAVS1セーフハーバーは、二本鎖DNA切断を生成するTALENsを用いて標的化される。これは、その後の修復のための基質として（切断部位に隣接する相同性アームを有する）AAVS1-CAG-EGFPドナーを使用して、相同組換え（HR）修復機構を活性化する。カセットが組み込まれ、PAC遺伝子が内因PPP1R12Cプロモーターの制御下に置かれる。
図2。ジーンターゲッティング実験のタイムライン。iPS細胞を培養し当日6 -2の（d-2）：70％の集密度と約1継代する。 MEFのをd-1でプレーティングされ、iPS細胞を回収し、d0とでトランスフェクトされる。 d1は、培地はNutriStemに切り替えられ、ピューロマイシンがd3ので培地に添加される前に、iPS細胞をさらに2日間培養する。コロニーは通常、D12によるピッキングの準備ができている。 NutriStem文化の期間は青でありながら、iPS細胞は、E8培地で培養される期間は、緑の強調表示されます。
図3：代表的な画像をターゲットIPSC遺伝子高品質のiPS細胞の（A）位相画像。位相明るいボーダーと丸石様の形態に注意してください。（B）DR4のMEFは2二十四時間解凍後に2×10 4細胞/ cmで播種。（C）を 72時間トランスフェクション後、EGFP +細胞が明らかに明らかである蛍光MICRの下で見たときoscope。（D）〜14日間、ピューロマイシンによる選択の後、均一なGFP蛍光を表示するコロニーをピックアップするのに十分な大きさである。（EH）コロニーピッキング方法の代表的な画像。コロニーは、最初のコロニーを概説することによって、およびより小さい細胞塊を得るために、それを等分することによって、引っ張らパスツールピペットを用いて取り出される。（I）IPSCコロニーが2以内、96ウェルプレートの基底膜マトリックスでコーティングされた表面に付着摘み4時間。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：トランスフェクション効率およびクローン標的iPS細胞のFACS分析。任意のプラスミドのトランスフェクションなし（A）コントロールNCRM5 iPS細胞（B）NCRM5小テストベクトルをpMax-GFPでトランスフェクトしたiPS細胞は、FACSは、GFP発現について分析される。AAVS1-CAG-EGFPプラスミド（C） 一過性発現は、FACSによって評価される。 FACSによりアッセイとして（D）NCRM5-AAVS1-CAG-EGFPクローンディスプレイ一様に正のEGFP発現。 Cと比較して）分析したiPS細胞のタイトなクラスタリングを注意してください。（拡張NCRM5-AAVS1-CAG-EGFPを標的クローンのE）蛍光画像。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
（1）効率的にトランスフェクションにより性IPSCにTALENとドナープラスミドを提供する：AAVS1セーフハーバーの成功の世代のための最も重要なステップは、人間のiPS細胞であるターゲット（2）トランスフェクション後、トランスフェクションとメッキ密度の前に単一細胞にiPS細胞の解離を最適化する。 （3）用量およびIPSCラインの成長に基づく薬剤選択の時間を最適化する。 （4）を慎重に解剖し、目標とコロニーピッキング/ウェル新しいプレートに移す。 Hockemeyerの論文10で使用される類似の方法と比較して、このプロトコルは、で使用されるiPS細胞の数を減らすのに役立っている、オープンソースのAAVS1-TALENs、異なるIPSC解離試薬およびTALENsドナーベクターを送達するための別のトランスフェクションデバイスのペアを使用高いトランスフェクションを達成し、効率化を目標としながら実験。
ヒトiPS細胞における高効率の遺伝子編集を実現するためには、まず、遺伝子電子取引の配信を最適化することが不可欠である配送方法および試薬急性細胞死のバランスを取りながらティン試薬（DNA / RNA）は、iPS細胞を引き起こす。目標は、細胞死のまずまず低レベルを維持しながら、送達効率を最大化することである。それは、ヒトiPS細胞における薬物選択の助けを借りて、> 50％のHR効率を実現することができるAAVS1-TALENプラスミドを大量に調製することは非常に容易であるので、TALENプラスミドからmRNAをする必要がない。配信の課題は、この場合には〜10kbの大ドナープラスミド、から来ている。 pMaxGFPは、〜3.5キロバイト小さなプラスミド、あらゆる細胞に届けることは非常に容易であるため、これは、特定の人間のIPSCラインではなくpMaxGFPはトランスフェクションキットに含まれて使用して送達効率をテストするためにAAVS1-CAG-EGFP供与体を使用することをお勧めします。 AAVS1-CAG-EGFPドナーはAAVS1遺伝子座に異なる遺伝子を標的とするために、図1Aに示される制限酵素を用いて修飾することができる。 CAG-EGFPを置き換える6.4 kbのカセットを含んでさらに12 kbのドナーは、あってもいる専用（データは示していない）類似のトランスフェクションを達成するために成功裏に使用され、効率をターゲット。一般に、ヒトiPS細胞が困難にトランスフェクトできる細胞型の中で、大規模なプラスミドの送達効率は、GFP +細胞のフローサイトメトリー分析によって測定されるように5〜10％と低くすることができる。細胞塊が各セルに遺伝子編集試薬を送達する可能性を低減するので、トランスフェクション効率のさらなる最適化は、単一細胞へのヒトiPS細胞の適切な解離に依存する。このプロトコルは、穏やかと高速ワーキング細胞解離試薬を使用していますが、10分以上iPS細胞を治療するのはお勧めしません。穏やかにピペッティングを持つ単一の細胞にiPS細胞を解離するために一般的に十分な予め温め優しい-細胞解離試薬で5分間のインキュベーションを行う、ステップ5.1を以下の場合は、通常、IPSC文化が80％未満のコンフルエントである。細胞培養過剰詐欺であるため、すべての細胞は、治療の10分後、単一の細胞に解離させることができる場合流暢またはコロニーは、非常にコンパクトになり、単純にそれ以上のウェル/プレートから単一細胞の推奨される数を収集し、背後にしっかりと付着した細胞を残す。機械的せん断が酵素的解離より細胞により有害であるので、ヘビーペッティングはお勧めしません。初期の継代iPS細胞（継代＃15の前）で作業する場合、細胞が既に後期継代iPS細胞よりもトランスフェクションストレスに対してより敏感であるため、穏やかな解離の練習は、細胞の生存のために非常に重要である。それは、トランスフェクション及び細胞生存の両方で高効率を達成することは困難である場合、最も高いトランスフェクション効率を与える練習を選択する。トランスフェクションの後、細胞は、薬物選択が開始されると3日目に50-80％のコンフルエンシーに到達する密度でプレートされるべきである。各IPSCラインは異なって成長しているため、トランスフェクション後メッキ密度は、各細胞株のために最適化する必要がある場合があります。高いメッキ密度がDRUの有効性を減少させ、オーバーコンフルエンシーにつながる可能性G-選択、極端な低メッキ密度が薬剤耐性コロニーの遅延回復と成長を引き起こすかもしれない。通常300万開始性IPSCは、生存と特定のiPS細胞の成長に応じて1/2 2 10cmの皿にプレーティングされるのに十分である。新たに生成されたかのように、まだテストされていないIPSCラインを使用した場合も同様に、非トランスフェクト細胞中での最低有効用量を確立するために、ピューロマイシン死滅曲線を生成する必要があるかもしれない。 IPSCラインはピューロマイシン選択に対する感受性がかなり変化することができる。これらは薬剤選択中のある細胞外マトリックスよりも良好なIPSCの成長をサポートするように見えるためのMEFは、選択のために使用した。経験則として、0.5μgの/ mlの1mlのμgの/または7日目のピューロマイシンの最低5日間の選択を完了するために必要とされる。最後に、コロニーピッキング手法は、薬剤選択後にすべてのターゲットにコロニーを維持することが重要である。穏やかにピペッティングまたは解離試薬処理が均等に複数の部分にコロニーを破壊するのに役立ちます新しいウェルに分配され、したがって、コロニーの拡大をスピードアップすることができます。メッキ前に拾ったコロニーを分解するために解離試薬を使用している場合は、一晩放置しておくと、残存解離試薬が導入細胞を殺す可能性があるため、それは十分に、治療後に> 10倍培地で希釈されていることを確認してください。使用されている技術にかかわらず、実際の実験の前に、コロニーピッキングを練習することは非常に奨励されている。
記載さ戦略は大幅にピッキング、内因PPP1R2CプロモーターのオフPAC遺伝子の発現を駆動するために、遺伝子トラップ法を利用したよう30以上のコロニーが必要な証明するべきではありません。 SA-2AリンクPACの選択は、理論的にはランダム組込み専用細胞を排除するが、追加のランダムな組み込み（S）が成功した目標との統合を持つiPS細胞で発生する可能性があります。ほとんどの場合、薬物選択されたクローンのほぼ100％が統合を対象としており、〜それらの10〜40％は、追加のランダムintegratiを持つアドオン。 > 50％の二重対立遺伝子標的化が発生し、前記実験が標的クローンの大部分は、単一の対立遺伝子ターゲティングを有する傾向がある。追加のランダムインテグレーションの可変周波数、ならびに二対立遺伝子標的に対する単一の比が、制御が困難である。そのため、〜20コロニーを選ぶことは単一性を確保することをお勧めしますまたはダブル対立遺伝子を標的のみのクローンを得ることができる。失敗したターゲティング実験は、標的細胞のトランスフェクション能力、生存、および成長率の再評価に照らして、特定の細胞株中のヌクレアーゼの有効性、およびドナーおよびヌクレアーゼ調製物の品質は非常に前に推奨される実験を再試行するその全体。
これは、類似した遺伝子トラップドナー戦略は、他の活性遺伝子を標的化するために使用されるが、選択可能な遺伝子の発現を駆動するための独立したプロモーターを必要とするサイレント遺伝子ターゲティングに適していないことができることに留意すべきである。また、目の間に電子AAVS1セーフハーバーは、オープンクロマチン構造を持っていると考えられている、これは、任意の導入遺伝子が、この遺伝子座で強く発現することができることを保証するものではありません。確かに、私たちの最近の報告では、いくつかの弱いプロモーターがAAVS1遺伝子座14を対象とした統合後に検出可能な蛍光レポーター遺伝子発現を駆動することができなかったことを示した。
このプロトコルは、ヒトゲノムにおいてよく研究されセーフハーバー遺伝子座を標的とするように、よく検証されTALENsを使用して焦点を当てています。技術は再現性の高い、任意の導入遺伝子を含む多くのアプリケーションに簡単に適応可能である。ランダムな統合を使用して、遺伝子工学的方法と比較して、標的とAAVS1-TALEN媒介遺伝子は非常に効率的かつ特異的であり、iPS細胞の場合には、拡張し、任意のヒト細胞型に分化する能力を有する安定した蛍光細胞をもたらす。このプロトコルは、デザインとデザイナーヌクレアーゼの検証やpの目標とIPSCコロニーの評価については説明しませんがローパーカセット統合およびオフターゲット分析は、いくつかの優れたプロトコルが詳細16-18方法論のこれらの態様を記載している。 E8媒体を用いた無フィーダーIPSC培養および継代技術は、以前の刊行物19に詳細に記載されている。上記のプロトコルは、人間性IPSCのAAVS1セーフハーバーへの遺伝子の添加のために最適化されている間、任意の細胞型における相同組換えドナーを用いた部位特異的ヌクレアーゼ媒介遺伝子編集/追加を伴う実験のための一般的なテンプレートとして機能することができます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-Free, 10 ml | Corning | 354230 | Store at -20 °C. |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320-033 | Store at 4 °C. |
| Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates | Corning | 3506 | |
| Essential 8 Medium | Life Technologies | A1517001 | Store basal medium at 4 °C. Store supplement at -20 °C. |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | Store at room temp. Once dissolved in H2O, store at -20 °C. |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886-500G | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies | 15575-020 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190-250 | |
| 100 mm TC-Treated Culture Dish | Corning | 430167 | |
| DR4 MEF 2M IRR - Academic | GlobalStem | GSC-6204G | Store in liquid Nitrogen. |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 11995-040 | Store at 4 °C. |
| Defined Fetal Bovine Serum, US Origin | HyClone | SH30070.03 | Store at -20 °C. Thaw at 4 °C overnight and aliquot. Store aliquots at -20 °C until needed. |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Life Technologies | 11140-050 | Store at 4 °C. |
| 4D-Nucleofector Core unit | Lonza | AAF-1001B | part of the electroporation system |
| 4D-Nucleofector X unit | Lonza | AAF-1001X | part of the electroporation system |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (24 RCT) | Lonza | V4XP-3024 | Upon arrival, remove Primary Cell Solution and supplement and store at 4 °C. |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies | A1110501 | Store at -20 °C. Thaw overnight at 4°C and warm an aliquot in a 37 °C water bath before use. |
| NutriStem XF/FF Culture Medium | Stemgent | 01-0005 | Store at -20 °C. Thaw overnight at 4 °C |
| AAVS1 TALENs (pZT-AAVS1-L1 and pZT-AAVS1-R1) | Addgene | 52637 and 52638 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AAVS1-CAG-EGFP Homologous Recombination donor | Addgene | 22212 | |
| Puromycin Dihydrochloride | Life Technologies | A11138-03 | Store at -20 °C. Prepare working aliquots of 1 mg/ml in ddH2O. |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Sorvall Legend XTR (Refrigerated), 120 V 60 Hz | Thermo Scientific | 75-004-521 | |
| TX-750 4 × 750 ml Swinging Bucket Rotor | Thermo Scientific | 75003607 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Hentze, H., Graichen, R., Colman, A. Cell therapy and the safety of embryonic stem cell-derived grafts. Trends Biotechnol. 25 (1), 24-32 (2007).
- Smith, J. R., et al. Robust, persistent transgene expression in human embryonic stem cells is achieved with AAVS1-targeted integration. Stem Cells. 26 (2), 496-504 (2008).
- Lombardo, A., et al. Site-specific integration and tailoring of cassette design for sustainable gene transfer. Nat Methods. 8 (10), 861-869 (2011).
- Ogata, T., Kozuka, T., Kanda, T. Identification of an insulator in AAVS1, a preferred region for integration of adeno-associated virus DNA. J Virol. 77 (16), 9000-9007 (2003).
- Zwaka, T. P., Thomson, J. A. Homologous recombination in human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 21 (3), 319-321 (2003).
- Urbach, A., Schuldiner, M., Benvenisty, N. Modeling for Lesch-Nyhan disease by gene targeting in human embryonic stem cells. Stem Cells. 22 (4), 635-641 (2004).
- Hockemeyer, D., et al. Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases. Nature biotechnology. 27 (9), 851-857 (2009).
- Zou, J., et al. Gene targeting of a disease-related gene in human induced pluripotent stem and embryonic stem cells. Cell stem cell. 5 (1), 97-110 (2009).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nature. 29 (8), 731-734 (2011).
- Sanjana, N. E., et al. A transcription activator-like effector toolbox for genome engineering. Nature protocols. 7 (1), 171-192 (2012).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Ding, Q., et al. Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs. Cell stem cell. 12 (4), 393-394 (2013).
- Luo, Y., et al. Stable Enhanced Green Fluorescent Protein Expression After Differentiation and Transplantation of Reporter Human. Induced Pluripotent Stem Cells Generated by AAVS1 Transcription Activator-Like Effector Nucleases. Stem Cells Transl Med. 3 (7), 821-835 (2014).
- Zou, J., et al. Oxidase-deficient neutrophils from X-linked chronic granulomatous disease iPS cells: functional correction by zinc finger nuclease-mediated safe harbor targeting. Blood. 117 (21), 5561-5572 (2011).
- Luo, Y., Rao, M., Zou, J. Generation of GFP Reporter Human Induced Pluripotent Stem Cells Using AAVS1 Safe Harbor Transcription Activator-Like Effector Nuclease. Curr Protoc Stem Cell Biol. 29, 5A.7.1-5A.7.18 (2014).
- Peters, D. T., Cowan, C. A., Musunuru, K. Genome editing in human pluripotent stem cells. StemBook. , Harvard Stem Cell Institute. Cambridge, MA. Available from: http://www.stembook.org/node/1438 (2008-2013).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat Protoc. 7, 2029-2040 (2012).
