Transfektion, Urval och Koloni-plockning av mänskliga inducerade pluripotenta stamceller Talen riktade med en GFP Gene i AAVS1 Safe Harbor
Summary
TALEN-mediated gene editing at the safe harbor AAVS1 locus enables high-efficiency transgene addition in human iPSCs. This protocol describes the procedures for preparing iPSCs for TALEN and donor vector delivery, transfecting iPSCs, and selecting and isolating iPSC clones to achieve targeted integration of a GFP gene to generate reporter lines.
Abstract
Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral vector mediated random integration. This protocol describes a universal and efficient transgene targeted addition platform in human iPSCs based on utilization of validated open-source TALENs and a gene-trap-like donor to deliver transgenes into a safe harbor locus. Importantly, effective gene editing is rate-limited by the delivery efficiency of gene editing vectors. Therefore, this protocol first focuses on preparation of iPSCs for transfection to achieve high nuclear delivery efficiency. When iPSCs are dissociated into single cells using a gentle-cell dissociation reagent and transfected using an optimized program, >50% cells can be induced to take up the large gene editing vectors. Because the AAVS1 locus is located in the intron of an active gene (PPP1R12C), a splicing acceptor (SA)-linked puromycin resistant gene (PAC) was used to select targeted iPSCs while excluding random integration-only and untransfected cells. This strategy greatly increases the chance of obtaining targeted clones, and can be used in other active gene targeting experiments as well. Two weeks after puromycin selection at the dose adjusted for the specific iPSC line, clones are ready to be picked by manual dissection of large, isolated colonies into smaller pieces that are transferred to fresh medium in a smaller well for further expansion and genetic and functional screening. One can follow this protocol to readily obtain multiple GFP reporter iPSC lines that are useful for in vivo and in vitro imaging and cell isolation.
Introduction
Förmågan att omprogrammera mänskliga somatiska celler in embryonala stamcellsliknande inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) upptäcktes först av Takahashi et al. 2007 1. Humana dermala fibroblaster omvandlade med retrovirus som uttrycker fyra transkriptionsfaktorer (Den så dubbad Yamanaka Faktorer Oct3 / 4, Sox2, c-Myc och Klf4) visade sig vara mycket lik mänskliga embryonala stamceller (hESCs) baserat på morfologi, spridning, genuttryck, och epigenetiska status; avgörande, iPSCs är också förmåga att differentiera till celler av alla tre germinallager 1. Den proliferativa potentialen och differentiering kapacitet iPSCs gör dem väldigt attraktiva verktyg; genom omprogrammering celler från patienter som lider av vissa sjukdomar, kan iPSCs användas både som in vitro sjukdomsmodellsystem och som potentiella terapeutiska medel.
För det senare ändamålet, måste flera frågor lösas innan den fulla potentialen av iPSCsi en klinisk miljö kan förverkligas; den tumörframkallande potential in vitro odlade hESCs och iPSCs, användningen av xenogena derivat under omprogrammering och cell underhåll, och behovet av att spåra transplanterade celler in vivo är alla viktiga hinder för den kliniska tillämpningen av pluripotenta stamceller (Betygsatt av Hentze et på. 2). En idealisk lösning på behovet av att spåra differentierade celler efter transplantation skulle innebära en visuellt detekterbar markör som motstår tysta och färgskiftning oavsett ansökan. Robust och ihållande uttryck av integrerade transgener är lättast uppnås när exogena DNA införs i safe-harbour loci; det vill säga genomiska platser som möjliggör tillräcklig transkription av en integrerad vektor medan samtidigt mildra störningar av expression i angränsande gener 3. En sådan plats som har blivit mycket väl karakteriseras sedan dess upptäckt är adenoassocierat virus integration site 1 (AAVS1), i det första intronet av proteinfosfatas en reglerande subenhet 12C (PPP1R12C) genen. Denna locus har visat inte bara att tillåta fortsatt och robust uttryck av integrerade transgener genom förlängt tiden i kultur och in vitro differentiering 3, men också för att skydda omgivande gener från transkriptions störning 4; båda funktionerna tros vara på grund av närvaron av endogena kromatin isolatorelement flankerar AAVS1 site 5.
Framsteg inom genomet ingenjörsverktyg över bara det senaste decenniet har väsentligt underlättat den lätthet och effektivitet med vilken kan uppnås genetiska manipulationer i någon celltyp. Medan tidiga lyckade experiment åberopats ytterst låga nivåer av endogen homolog rekombination (HR) med en introducerad donator för att uppnå riktad genmodifiering i ESC 6,7, användningen av platsspecifika nukleaser, såsom zinkfinger nukleaser (ZFNs), att signiligt framkalla homolog rekombination genom generering av ett dubbelsträngat DNA break har kraftigt ökat effektiviteten i sådana experiment 8,9. Den återanvända både transkriptions aktivator liknande effektorer (Tales) av vegetabiliskt patogena Xanthomonas släkten och de prokaryota klustrade regelbundet mellanrum korta palindromiska upprepningar (CRISPR) / Cas9-systemet till effektiva platsspecifika designer nukleaser har gjort riktad genmodifiering i pluripotenta stamceller en tillgänglig och praktiskt metod 10-13.
En nyligen papper beskrev ett effektivt förfarande för stabil integration av en grön fluorescerande reporterkassetten i AAVS1 safe-harbour lokus i humana iPSCs använder tale nukleaser (Talens) 14. Dessa riktade iPSCs bibehöll sin fluorescens även efter riktad differentiering till hjärtmuskelceller och transplantation i en musmodell av hjärtinfarkt (MI), vilket ger starka belägg för nyttan av en sådanstabilt fluorescerande pluripotenta stamceller 14. För att erhålla målinriktade kolonier, var en gen-fälla metod användas, varvid en skarvning-acceptor (SA), placerar 2A själv klyva peptidsekvens puromycin N-acetyl-transferas (PAC) genen under kontroll av den endogena PPP1R12C promotorn; således, endast iPSCs som har inkorporerat DNA donator vid AAVS1 lokuset uttrycker PAC, som följaktligen är selekterbar baserad på puromycin-resistens; (Figur 1, 15). Detta protokoll detaljer förfarandena för att generera AAVS1-GFP iPSCs redovisas i senaste pappers 14, inklusive arbetet med transfekterar iPSCs med Talens och en 9,8 kb donator för att integrera ett 4,2 kb DNA-fragment i AAVS1 safe-harbor locus, välja iPSCs baserade på puromycin resistens, och plockar kolonier för klonal expansion. De tekniker som beskrivs häri kan tillämpas på många genomet tekniska experiment.
Protocol
Representative Results
Discussion
De mest kritiska stegen för en framgångsrik generation AAVS1 safe-harbour riktade mänskliga iPSCs är: (1) effektivt leverera Talen och givar plasmider i iPSCs genom transfektion; (2) optimera dissociation av iPSCs i enskilda celler före transfektion och plätering tätheten efter transfektion; (3) optimera dos och tid för drog urval baserat på tillväxten av iPSC linje; (4) försiktigt dissekera och plocka riktade kolonier och överföra till ny platta / brunn. Jämfört med liknande metoder som används i Hockem…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the NIH Common Fund and Intramural Research Program of the National Institute of Arthritis, Musculoskeletal, and Skin Diseases.
Materials
| NAME OF MATERIAL/EQUIPMENT | COMPANY | CATALOG # | COMMENTS/DESCRIPTION |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-Free, 10mL | Corning | 354230 | Store at -20°C. |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320-033 | Store at 4°C. |
| Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates | Corning | 3506 | |
| Essential 8 Medium | Life Technologies | A1517001 | Store basal medium at 4°C. Store supplement at -20°C. |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | Store at room temp. Once dissolved in H2O, store at -20°C. |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886-500G | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies | 15575-020 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190-250 | |
| 100mm TC-Treated Culture Dish | Corning | 430167 | |
| DR4 MEF 2M IRR – Academic | GlobalStem | GSC-6204G | Store in liquid Nitrogen. |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 11995-040 | Store at 4°C. |
| Defined Fetal Bovine Serum, US Origin | HyClone | SH30070.03 | Store at -20°C. Thaw at 4°C overnight and aliquot. Store aliquots at -20°C until needed. |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Life Technologies | 11140-050 | Store at 4°C. |
| 4D-Nucleofector Core unit | Lonza | AAF-1001B | part of the electroporation system |
| 4D-Nucleofector X unit | Lonza | AAF-1001X | part of the electroporation system |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (24 RCT) | Lonza | V4XP-3024 | Upon arrival, remove Primary Cell Solution and supplement and store at 4°C. |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies | A1110501 | Store at -20°C. Thaw overnight at 4°C and warm an aliquot in a 37°C water bath before use. |
| NutriStem XF/FF Culture Medium | Stemgent | 01-0005 | Store at -20°C. Thaw overnight at 4°C |
| AAVS1 TALENs (pZT-AAVS1-L1 and pZT-AAVS1-R1) | Addgene | 52637 and 52638 | |
| AAVS1-CAG-EGFP Homologous Recombination donor | Addgene | 22212 | |
| Puromycin Dihydrochloride | Life Technologies | A11138-03 | Store at -20°C. Prepare working aliquots of 1 mg/mL in ddH2O. |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Sorvall Legend XTR (Refrigerated), 120V 60Hz | Thermo Scientific | 75-004-521 | |
| TX-750 4 × 750mL Swinging Bucket Rotor | Thermo Scientific | 75003607 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Hentze, H., Graichen, R., Colman, A. Cell therapy and the safety of embryonic stem cell-derived grafts. Trends Biotechnol. 25 (1), 24-32 (2007).
- Smith, J. R., et al. Robust, persistent transgene expression in human embryonic stem cells is achieved with AAVS1-targeted integration. Stem Cells. 26 (2), 496-504 (2008).
- Lombardo, A., et al. Site-specific integration and tailoring of cassette design for sustainable gene transfer. Nat Methods. 8 (10), 861-869 (2011).
- Ogata, T., Kozuka, T., Kanda, T. Identification of an insulator in AAVS1, a preferred region for integration of adeno-associated virus DNA. J Virol. 77 (16), 9000-9007 (2003).
- Zwaka, T. P., Thomson, J. A. Homologous recombination in human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 21 (3), 319-321 (2003).
- Urbach, A., Schuldiner, M., Benvenisty, N. Modeling for Lesch-Nyhan disease by gene targeting in human embryonic stem cells. Stem Cells. 22 (4), 635-641 (2004).
- Hockemeyer, D., et al. Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases. Nature biotechnology. 27 (9), 851-857 (2009).
- Zou, J., et al. Gene targeting of a disease-related gene in human induced pluripotent stem and embryonic stem cells. Cell stem cell. 5 (1), 97-110 (2009).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nature. 29 (8), 731-734 (2011).
- Sanjana, N. E., et al. A transcription activator-like effector toolbox for genome engineering. Nature protocols. 7 (1), 171-192 (2012).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Ding, Q., et al. Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs. Cell stem cell. 12 (4), 393-394 (2013).
- Luo, Y., et al. Stable Enhanced Green Fluorescent Protein Expression After Differentiation and Transplantation of Reporter Human. Induced Pluripotent Stem Cells Generated by AAVS1 Transcription Activator-Like Effector Nucleases. Stem Cells Transl Med. 3 (7), 821-835 (2014).
- Zou, J., et al. Oxidase-deficient neutrophils from X-linked chronic granulomatous disease iPS cells: functional correction by zinc finger nuclease-mediated safe harbor targeting. Blood. 117 (21), 5561-5572 (2011).
- Luo, Y., Rao, M., Zou, J. Generation of GFP Reporter Human Induced Pluripotent Stem Cells Using AAVS1 Safe Harbor Transcription Activator-Like Effector Nuclease. Curr Protoc Stem Cell Biol. 29, 5A.7.1-5A.7.18 (2014).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat Protoc. 7, 2029-2040 (2012).
