Introduction
Encefalopatie spongiformi trasmissibili (TSE, malattie prioniche) sono un gruppo di malattie neurodegenerative fatali con periodi di incubazione lunghi che interessano una varietà di animali ed esseri umani. L'agente eziologico putativo di TSE comprende un isomero misfolded della proteina prionica host (PrP) che è in grado di auto-propagazione per conversione template-driven della forma cellulare normale PrP (PrP C) in una, associata malattia infettiva forma (PrP TSE) che si accumula nei tessuti del sistema nervoso centrale dell'ospite infettato 1. Prioni mammiferi infettive in genere trasmettono da host-to-host in modo specifico per le specie, che ha dato origine al concetto di "TSE specie barriera" limitare gli eventi di trasmissione interspecie 2. I fattori biologici della barriera prione specie non sono ben compresi. Sequenza aminoacidica somiglianza tra il infettiva PrP TSE e l'host PrP C cUn'influenza fortemente se conversione avviene 3-5, ma rimane insufficiente per spiegare tutti gli eventi di trasmissione dei prioni osservati in vivo 6,7.
Così, la caratterizzazione delle barriere di specie TSE ha largamente invocato studi di provocazione animale: esporre animali ingenui da una determinata specie di prioni da un altro e misurando il tempo di incubazione risultante per l'insorgenza della malattia e il tasso di attacco come indicatori di efficienza di trasmissione. I topi che esprimono PrP C da specie eterologhe sono utilizzati anche per questo tipo di studio 8. I costi associati alla produzione di topo transgenico e biotest prioni prolungati, così come le considerazioni etiche di utilizzo degli animali, sono ostacoli alla ricerca sperimentale di TSE barriere di specie. Valutazione della barriera di specie umana di TSE si basa su topi ingegnerizzati per esprimere umana PrP C. Questi topi richiedono periodi di incubazione lunghi a soccombere alle TSE o modifiche al T umaniegli molecola PrP C umana per la malattia rapida insorgenza 9. Periodi di incubazione delle EST non umano in questi topi possono estendersi oltre la normale durata di vita del mouse facendo interpretazione dei risultati negativi difficili. I primati non umani sono stati utilizzati anche come proxy per lo studio delle barriere di specie umane, ma questi studi sono irto le stesse sfide degli altri tipi di sperimentazione animale e primati non umani non può ricapitolare precisamente malattia procede nell'ospite umano.
Analisi su animali rimangono il metodo "gold standard" per misurare la suscettibilità di una specie di TSE, ma gli ostacoli, i costi e l'etica di questi studi su animali vivi hanno costretto indagini alternative. Un certo numero di saggi in vitro, basati sulla valutazione della conversione di ospitante PrP C ad una proteinasi K (PK) Stato -resistenti (res PrP) quando seminato da PrP TSE, sono stati sviluppati e utilizzati per studiare TSE spECIES barriere 10-12. Esempi di saggi in vitro includono test cell-free di conversione, proteine misfolding di amplificazione ciclica (PMCA), e il rapporto di efficienza di conversione (CER) dosaggio 10-14. Anche se nessuno di questi test tiene conto di fattori periferici coinvolti in barriere di specie dopo l'infezione naturale, tutto può essere utile per identificare gli host potenzialmente sensibili per le TSE.
Qui vi presentiamo il protocollo per il test CER, in cui due substrati denaturati PrP C derivati da normali omogenati cerebrali sono utilizzati in reazioni di conversione prione banco (Figura 1) 13. PrP C nel substrato denaturato a pH 7,4 può essere convertito solo res PrP da PrP TSE seminate nella reazione in assenza di una barriera di specie 14. Al contrario, denaturazione di PrP C in altro substrato a pH 3.5 permette di essere convertito PrP res seguente incubazionecon PrP TSE da qualsiasi specie e serve come controllo per la conversione. Il rapporto di conversione di PrP C res PrP in pH 7,4 substrato rispetto a quella del substrato pH 3.5 fornisce una misura della barriera di specie. Abbiamo scoperto che il test CER predice noto barriere di specie di topi di laboratorio per varie TSE e hanno utilizzato il test nel tentativo di prevedere la barriera di specie di numerose specie di mammiferi, tra cui pecore bighorn, alla malattia del dimagrimento cronico (CWD) e altre TSE 14, 15. Gli investigatori interessati in uno strumento che consenta il rapido screening delle TSE specie barriere o valutazione della conversione PrP C-to-PrP res troveranno questa metodologia utile.
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Protocol
Animal lavoro condotto presso l'USGS National Wildlife Health Center è stata eseguita in accordo con l'Ufficio NIH di linee guida Laboratory Animal Welfare e sotto la cura degli animali istituzionale e comitato uso protocollo # EP080716. I tessuti di animali cacciatori-raccolta erano doni del Wisconsin o Michigan dipartimenti delle risorse naturali.
1. Soluzione Preparazione
NOTA: Le soluzioni elencate di seguito sono necessari per la preparazione del substrato test CER nella Sezione 2 sotto. Preparare ciascuna di queste soluzioni di elevate soluzioni concentrazione azionari; Le concentrazioni consigliate per soluzioni madre sarà dato in parentesi dopo ogni rispettivo nome chimico elencato. Preparare tutte le soluzioni fresche sulla preparazione del substrato e conservare a 4 ° C fino al momento dell'utilizzo.
- Per tampone di lisi, preparare una soluzione delle seguenti in Tris 10 mM, pH 7.5 (1 M Tris, pH 7.5 soluzione madre consigliato): 100 mm scloruro di odium (NaCl, 1 M soluzione madre), 10 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA, EDTA 500 mm, pH 8.0 soluzione madre), 0,5% NP-40 (10% soluzione madre), 0,5% desossicolato (DOC, 10% soluzione madre ).
- Per buffer di conversione, preparare una soluzione di 0,05% sodio dodecil solfato (SDS, 10% soluzione madre) e 0,5% Triton X-100 (10% soluzione madre) in 1 tampone fosfato salino (PBS, 10, pH 7.4 soluzione stock).
- Per le soluzioni caotropici, preparare due 3 M soluzioni di guanidina cloridrato (GdnHCl, 8 m stock) in 1x PBS (10x soluzione madre). Regolare il pH di una delle soluzioni di 3,5 ± 0,05 con acido cloridrico concentrato (HCl). Verificare che il pH della seconda soluzione rimane a pH 7,4 ± 0,05 e regolare utilizzando idrossido concentrato HCl o di sodio (NaOH) se necessario.
2. Preparare CER Assay substrato Pairs
- Ottenere tessuto cerebrale sano, non-TSE-infettati da specie di interesse e preparare un volume peso-per-10%(W / v) omogenato in tampone di lisi utilizzando uno dei seguenti metodi: Dounce, branello-mulino, o mortaio e pestello omogeneizzazione. Ulteriori definire risultante omogenati sottoponendoli a siringa e ago omogeneizzazione, usando aghi di calibro crescente fino substrato può essere aspirato ed espulsa con facilità attraverso un ago di siringa G 27.
- Per sottofondi preparati da roditori e altri piccoli mammiferi, omogeneizzare tutto il cervello (s); per substrati preparati da grandi mammiferi, utilizzare OBEX (tronco encefalico) tessuto da preparare omogeneizzati. Quando si seleziona la quantità di omogenato cerebrale, preparare non più del 50% della capacità della centrifuga utilizzata per precipitazione delle proteine nel passo 2.6.
- Se la qualità del tessuto cerebrale acquisita è discutibile, valutare i livelli di PrP C da SDS-PAGE 16 e immunoblot 17 prima del substrato di preparazione.
- Dividere omogenato cervello in due volumi uguali a tubi conici di plastica etichettati separati. Aggiungi GdnHCl (3 M soluzioni in 1 PBS) a pH 3,5 o 7,4 a ciascuna provetta in un rapporto 1: 1 volume di omogenato cerebrale.
- Controllare i valori di pH delle due soluzioni. Regolare il pH del pH 3.5 ± substrato a pH 0,05 con HCl concentrato. Assicurarsi che il pH del altro substrato rimane a pH 7,4 ± 0,05 e regolare il pH se necessario con HCl o NaOH come necessario. Evitare di superamento dei valori di pH da giudiziosa aggiunta di acido o di base.
- Ruotare soluzioni in un mixer end-over-end a temperatura ambiente (RT) per 5 ore.
- Precipitato proteico aggiungendo quattro volumi di metanolo alle soluzioni substrato in ogni provetta conica, vortex per miscelare bene, e incubare a -20 ° C per 16-18 ore.
- Campioni di sedimento di centrifugazione a 13.000 xg per 30 min a 4 ° C. Decantare con cautela e scartare il surnatante e lasciare evaporare il metanolo dai pellet. Utilizzare applicatori con punta di cotone per aiutare ad assorbire metanolo aggrappato alla parte interna del tubo. Non permettere pellets di over-dry e una volta metanolo non è più visibile, procedere al passo successivo.
- Pellets proteine Risospendere in tampone di conversione. Utilizzare una quantità di tampone di conversione pari alla quantità di omogenato cerebrale materiale di partenza erogato in ogni provetta nel passo 2.2.
NOTA: E 'fondamentale che il buffer di conversione usato per risospendere pellet di proteine sia da pH 3,5 e preparati substrato 7,4-trattati è la soluzione di cui al precedente punto 1.2 (che contiene bassi livelli di detersivi e un pH fisiologico). - Soluzioni brevemente agli ultrasuoni substrato in un sonicatore cuphorn (10 sec al ~ 30% di potenza massima), aliquota in 0,5-1,0 ml di volume in etichetta 1,5 ml microprovette. Eseguire un immunoblot controllo di qualità (passo 2.9) su un'aliquota di ciascun substrato. Conservare le altre aliquote a -80 ° C fino al momento di effettuare test CER (sezione 4).
- Eseguire il controllo della qualità su coppie substrato CER prima dell'uso (Figura 2). Questi passaggi assicurano che substrati CER saranno provide risultati ottimali in studi di conversione.
- Garantire quantità comparabili di PrP C nei due substrati. Confronta i livelli di PrP in 10-25 ml di ogni substrato mediante SDS-PAGE 16 e immunoblotting 17. Se i livelli di proteine nel pH 7.4 e 3.5 supporti si trovano a circa il 10% di ogni altro, le coppie substrato sono appropriati per l'utilizzo in studi CER.
NOTA: Le immunoblots PrP non dovrebbero mostrare la prova di un'eccessiva degradazione PrP C. L'immunoreattività PrP dovrebbe essere principalmente> 20 kDa. Bands meno di questa massa molecolare possono essere prodotti di degradazione. Modelli banding dovrebbero essere più o meno equivalente tra coppie substrato. - Come la PrP C in entrambi i substrati dovrebbe essere sensibile PK, trattare 10-25 microlitri di ciascun substrato con PK ad una concentrazione finale di 100 mg / ml e digerire campioni a 1,000 rpm a 37 ° C per 1 ora in termo-shaker. Valutare qualsiasi segnale PrP rimanente SDS-PAGE 16 e immunoblotting 17.Substrati con res PrP non sono adatti per l'utilizzo in studi CER.
- Garantire quantità comparabili di PrP C nei due substrati. Confronta i livelli di PrP in 10-25 ml di ogni substrato mediante SDS-PAGE 16 e immunoblotting 17. Se i livelli di proteine nel pH 7.4 e 3.5 supporti si trovano a circa il 10% di ogni altro, le coppie substrato sono appropriati per l'utilizzo in studi CER.
3. Preparare TSE Agente Seeds
- Ottenere tessuto cerebrale TSE-infettati da specie di interesse e di preparare un 10% (w / v) omogeneizzato in 1x PBS pH 7.4 con le modalità di cui al punto 2.1.
NOTA: Semi potrebbero essere ottenuti anche da altri tessuti infetti da TSE fuori del sistema nervoso centrale, tuttavia, l'efficienza di conversione del cervello derivato substrati da semi derivati da tessuti periferici TSE-infette non è ancora stata valutata sperimentalmente nella letteratura pubblicata. - Aliquota risultante omogeneizzato (s) in 100-300 volumi microlitri in 0,5 ml provette da microcentrifuga e conservare a -80 ° C fino al momento di eseguire il test CER.
4. CER Assay
NOTA: Il test CER comporta aggiunta di una quantità relativamente piccola di PrP TSE (fornito nel "seme") da una speciein un eccesso relativo di PrP C (fornito nel cervello non infette "substrato") da un'altra specie che è stato parzialmente denaturati a pH 3.5 o 7.4. Dopo un periodo di incubazione prolungato tremante, la conversione template-driven di PrP C da PrP TSE in ogni reazione è valutata dal segnale densitometrica di PrP res rimanente dopo PK digestione e la rilevazione immunoblot. Confrontando livelli res PrP nei substrati precedentemente denaturate a pH 3,5 contro 7,4 fornisce una misura della barriera di specie. Una panoramica sperimentale di questa procedura di analisi è fornito in Figura 1.
- Lentamente scongelare infetti coppie substrato CER (test richiede volumi uguali di substrati precedentemente denaturato sia a pH 3.5 e 7.4) e le soluzioni di semi TSE-infetti mettendoli sulla cima di un letto di ghiaccio (a circa 1 ora di tempo disgelo).
- Una volta completamente scongelati, aspirare e poi espellere ogni soluzione substrato attraverso un27 G siringa più volte a ri-omogeneizzare. Brevemente agli ultrasuoni ogni soluzione seme TSE-infettati per 10 secondi al ~ 30% di potenza massima. Tenere tutte le soluzioni sul ghiaccio mentre si prepara reazioni di conversione.
- Label 5 singoli, pareti sottili tubi basso legame PCR per agente TSE in fase di sperimentazione.
- Preparare reazioni di conversione in questi tubi aggiungendo 5 ml di soluzione al 10% di semi TSE-infetta a 95 ml di (a) substrato CER preparati a pH 7,4 e (b) substrato CER preparati a pH 3,5.
- Per ogni campione sperimentale, preparare reazioni parallele a coppie substrato CER precedentemente denaturato sia a pH 3,5 e 7,4.
- Ottimizzare i rapporti di TSE seme agente per substrato cervello infetto attraverso la determinazione empirica. Seme Comune: rapporti substrato impiegati mantengono un volume totale di reazione di 100 ml e comprendono 1:99 microlitri, 2:98 e 5:95 ul ul. Per la maggior parte delle applicazioni, il seme 5:95 microlitri: rapporto volume del substrato è adeguato ed è quello che si presenta in thè il protocollo.
- Preparare tre campioni di controllo per agente TSE in fase di test nel modo seguente: (a) aggiungere 5 ml di soluzione al 10% di semi di TSE-infetta al buffer di conversione 95 microlitri come controllo per ingresso res PrP; aggiungere buffer di conversione 5 ml a 95 ml di substrato preparato a (b) pH 3.5 (c), pH 7,4 come controlli per non-specifico, la conversione non su modelli.
- Brevemente vortice ogni campione nella sua provetta PCR chiuso mescolare semi e substrato bene. Seguire con un impulso momentaneo in una bassa velocità da banco mini-centrifuga per rimuovere qualsiasi volume della miscela di reazione intrappolato nel coperchio provetta PCR.
- Caricare i campioni in tubi PCR singolarmente etichettati in un banco top termo-shaker attrezzato per accettare provette PCR. Agitare campioni a 1,000 rpm a 37 ° C per 24 ore.
- Dopo agitazione, aggiungere sarcosile ad una concentrazione finale del 2% (w / v) e PK ad una concentrazione finale di 100 mg / ml. Campioni Digest a 1,000 rpm a 37 ° C per 1 ora in termo-shaker.
NOTE: aggiunta di sarcosile campioni aiuti post-conversione in PK digestione di PrP C. Segnali positivi falsi in campioni non teste di serie (punto 4.5) sono virtualmente eliminati con l'aggiunta di sarcosile. - Aggiungere tampone campione SDS-PAGE, campioni di calore a 95 ° C per 5 minuti e risolvere rimanenti PrP res in ciascun campione mediante SDS-PAGE seguita da immunoblotting 16 17.
NOTA: Dopo l'aggiunta di tampone campione e riscaldamento, i campioni possono essere immediatamente elaborato o campioni possono essere conservati a -20 ° C o -80 ° C prima di immunoblotting. Tutti i dati qui presentati sono stati generati utilizzando i sistemi di gel e di trasferimento Novex NuPAGE. I singoli campioni del test CER sono stati trattati con il tampone e la riduzione dell'agente secondo le istruzioni del produttore. I campioni sono stati successivamente riscaldati a 95 ° C per 5 min e 30 microlitri di ciascun campione sono stati caricati in un 12% bis-tris gel prefabbricati. - Calcolare il rapporto efficienza di conversione (CER) come misurabarriera di specie. Misura i livelli di res PrP di densitometria 17 e dividono la densità totale del campione pH 7,4 da quella del campione di 3,5 pH. Moltiplicare per 100 per produrre una percentuale.
- Compilare i dati da repliche sperimentali indipendenti di generare una media CER ± deviazione standard per una specie con un determinato agente TSE.
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Representative Results
Uso di successo del dosaggio CER dipende in gran parte dalla qualità delle coppie substrato utilizzati nelle reazioni di conversione. Per questo motivo, secondo procedure per preparare CER coppie substrato, un immunoblot controllo di qualità deve essere eseguito (Figura 2). Per entrambi i substrati, dosaggio 10-25 ml per immunoblotting. PrP C dovrebbe essere facilmente rilevabile in ogni substrato e livelli di PrP C deve essere di circa la stessa tra i due. Immunoreattività sarà principalmente visibile sopra 20 kDa, ma le bande più piccole può anche essere evidente. Nella nostra esperienza, la presenza di bande più piccoli è specie dipendente. Se i prodotti con peso molecolare inferiore sono osservate, la loro presenza deve essere confermata in entrambe le coppie di substrato.
E 'importante assicurare che i substrati CER sono esenti da res PrP endogeni trattando substrati con PK (Figura 2). Se è presente res PrP, l'animale utilizzato per substPreparazione tasso potrebbe essere stato TSE-infetti o subclinically-infetti. In alternativa, la PrP C nel substrato può avere mal ripiegate a uno stato PK-resistente durante le procedure di denaturazione o precipitazione. Indipendente dalla ragione, substrato CER contenente res PrP non è accettabile per l'uso nel saggio di conversione.
I topi di laboratorio sono uno degli animali più frequentemente utilizzati sperimentali nella ricerca TSE; in quanto tale, la loro suscettibilità alle più TSE è ben caratterizzato-8, fornendo un punto di riferimento in vivo contro il quale mettere alla prova la fedeltà del test CER. Figura 3A presenta i risultati della conversione dosaggio CER di PrP C di topo (ceppo CD1) substrato di PrP res da 1) il ceppo di scrapie RML mouse diversi passaggi, un agente adattati all'host del mouse 18, 2) pecora domestica scrapie classica, un agente che può trasmettere a topi dopo un periodo di incubazione lunga 18, e 3) WHIcervi te-coda (Odocoileus virginianus) CWD e 263K ceppo di scrapie-criceto diversi passaggi, gli agenti a cui i topi sono minimamente o non suscettibile 19,20. Risultanti livelli res PrP erano variabili attraverso substrati del mouse denaturate a pH 7,4 e seminati con i vari agenti della TSE mentre res PrP è stato trovato in tutti i substrati denaturato a pH 3,5 e seminato con un agente di TSE. Coefficienti di conversione confrontando livelli PrP res nel pH 7,4 e 3,5 substrati sono stati calcolati indipendentemente almeno tre volte e mezzi ± SD sono mostrati nella Figura 3B. Per le reazioni seminati da RML, rapporti di conversione tra pH 7,4 e 3,5 substrati erano circa il 100%. Per coloro seminato da scrapie, la conversione nel substrato pH 7,4 era circa il 75% di quello del substrato pH 3.5. CWD o conversione 263K indotta del substrato pH 7,4 era minimo. Un'analisi uno della varianza non riusciva a distinguere la differenza nei rapporti di conversione di RML e scrapie o CWD e 263K, comunque rapporti di conversione di RML e scrapie sono stati significativamente diversi da quelli di CWD e 263K.
Il test CER può essere adattato per l'uso con i tessuti umani o con specie animali in cui test biologici sono troppo impegnativi o non la produzione etica e di topo transgenico non è desiderata. Abbiamo utilizzato questo test per caratterizzare la suscettibilità di diverse specie di fauna selvatica a CWD. Come esempio di utilizzo di questo saggio, presentiamo alcuni risultati preliminari in Figura 4. Brains da Bobcats Hunter-intrappolati (Lynx rufus) sono risultati contengono ancora livelli rilevabili di PrP C e prodotti di degradazione PrP non erano ampie, il che suggerisce che questi tessuti possono essere una fonte accettabile per substrato CER (Figura 4A). Coppie substrato generate da cervello bobcat mostrato PrP immunoreattività di peso molecolare appropriato e non contenevano res PrP endogeni (Figura 4B). Quando le coppie di substrato bobcat CER generati da due animali separate sono state incubate con la stessa cervi dalla coda bianca agente CWD utilizzato nel test del mouse CER descritto in figura 3, abbiamo trovato substrati preparati a pH 7,4 avevano livelli di res PrP rispetto ai substrati preparati a pH 3,5 (Figura 4C), indicativo di un minimo specie di barriera di bobcat PrP C alla conversione da CWD. Il CER per la conversione di cervi dalla coda bianca PrP C dalla stessa CWD isolare utilizzato per convertire Bobcat PrP C qui, come controllo positivo, è stato in precedenza segnalato come 95,2 ± 18,4% in Morawski et al. (2013) 15.
Figura 1:. Panoramica sperimentale del test CER due substrati di analisi sono preparati da parte denaturazione PrP C in non-prioni infetti tessuto cerebrale wSoluzioni esimo caotropici a pH 3,5 o pH 7.4. Substrati sono seminati con PrP TSE da agente prione di interesse e campioni sperimentali vengono sottoposti a 24 ore di incubazione con agitazione per consentire PrP C alla conversione PrP TSE sia pH 3.5 e 7.4 substrati. Dopo l'incubazione, la conversione viene valutata mediante SDS-PAGE e immunoblotting. Densità di segnale vengono lette mediante densitometria e CER è calcolato il rapporto tra pH 7,4 e pH 3,5 densità di segnale per ogni campione sperimentale.
Figura 2: Il controllo di qualità su substrati CER. (A) prima dell'uso nel saggio CER, substrati topo preparati a pH 7.4 o 3.5 sono saggiati mediante immunoblot in 1) assenza di trattamento PK per valutare il contenuto PrP C di ciascuna coppia substrato (livelli PrP C siano equivalenti tra pH 7.4 e 3.5 substra TES per l'uso in test CER) e 2) presenza di PK (100 mcg / ml) Trattamento per verificare preesistente res PrP nei tessuti utilizzati per preparare substrati (eventuali substrati che visualizzano res PrP pre-esistenti non sono adatti per l'uso in il dosaggio CER). (B) Per l'analisi di non-specifica formazione PrP res durante il saggio di conversione, substrati del mouse PrP C preparati a pH 7.4 o 3.5 vengono seminate con tampone di conversione, agitazione per 24 ore a 1000 rpm, 37 ° C , e successivamente PK-trattato (100 mcg / ml) e analizzati per res PrP mediante immunoblotting (destra due corsie). Non-scossa, substrati del mouse non PK trattati rappresentano contenuto totale PrP C nelle reazioni del saggio (a sinistra due corsie). Per (B), corsie irrilevanti sono state tagliate per chiarezza, ma ogni pannello immunoblot deriva dallo stesso gel, membrane e l'esposizione. Immunoblots in tutti i pannelli usati anticorpo monoclonale SAF 83.
Figura 3:. Test CER con substrato topo di laboratorio (A) del mouse CER substrato test preparato sia a pH 7.4 o 3.5 è stato incubato con RML mouse adattato scrapie, domestico pecora scrapie classica, cervo dalla coda bianca malattia del dimagrimento cronico (CWD) o 263K ceppo di scrapie criceto adattati nel dosaggio CER. I campioni di controllo (etichetta "none") conteneva solo una pari quantità di agenti infettivi e nessun supporto mouse. I campioni sono stati analizzati per la presenza di proteina prionica PK-resistente (res PrP) mediante immunoblot con valori densitometrici anticorpo monoclonale SAF 83. prime per ogni campione vengono visualizzati sotto ogni corsia. (B) Grafico a barre indica i rapporti medi (± deviazione standard) tra pH 7,4 e 3,5 substrati del mouse per ogni agente infettivo sulla base di un minimo di 3 dosaggi di indipendenti. Minuscole lettere indicano statisticamentesottoinsiemi omogenei (analisi della varianza con il metodo Tukey-Kramer differenze significatività minimo; p <0,05). Questa cifra è stata modificata da Morawski et al. 2013 15.
Figura 4: Esempio di utilizzo di test CER per indagare bobcat suscettibilità alla CWD Bobcat omogenato cerebrale (A) e del substrato test CER (B) è stato testato da immunoblotting in assenza e in presenza di PK (100 mg / ml) per valutare PrP C esistente. livelli e la presenza di res PrP pre-esistenti, rispettivamente. (C) substrati Bobcat sono stati seminati con tampone di conversione e dosati nel test CER per valutare la formazione non specifica PrP res (a sinistra due corsie). Non-scossa, substrati Bobcat non-PK trattati rappresentano contenuto totale PrP C nelle reazioni del saggio (a destra due corsie).Substrato (D) Bobcat preparato sia a pH 7.4 o 3.5 è stato incubato con coda bianca CWD cervi con il saggio CER. Il campione di controllo (etichetta "none") conteneva una quantità uguale di agente CWD ma nessun substrato bobcat. I valori densitometrici prime per ogni campione sotto ogni corsia vengono visualizzati. Immunoblots in tutti i pannelli monoclonale usato 3f4, che reagisce con la proteina prionica 21 felina.
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Discussion
Per il completamento di questo protocollo, occorre prestare attenzione ai livelli PrP C nel tessuto cerebrale infetto usato per la preparazione del substrato (fase 2.1.2) e il seme al substrato rapporto per le reazioni di conversione (passo 4.4.2). Nella nostra esperienza, cervello possono essere estratte per uso come substrato CER dopo un sostanziale periodo post-mortem, purché PrP C è presente per immunoblotting (Figura 4). In effetti, alcuni autolisi è stato osservato nel cervello dei Bobcats utilizzati per gli studi CER. Tuttavia, l'incubazione di substrati derivati da questi cervelli ancora portato alla formazione di res PrP. Noi ipotizziamo che, in parte, la robustezza del test CER deriva dalla denaturazione di substrati CER in 1,5 M GdnHCl, che molti inattivare le proteasi.
Seed al substrato rapporti può avere bisogno di essere empiricamente determinato a ottenere il segnale accettabile PrP res by immunoblotting. Troppo o troppo lres PrP ittle per eseguire la densitometria, alta sfondo res PrP livelli in campioni di controllo mancano substrato e rapporti di conversione incoerenti sono tutti motivi per ottimizzare seme: rapporti substrato. Variazioni mantengono un volume totale di reazione di 100 ml e comprendono 1:99 microlitri, 2:98 e 5:95 ul ul. In quasi tutte le occasioni, abbiamo scoperto che 5:95 seme microlitri: rapporto volume del substrato è ottimale. Non importa quale sia il rapporto un lavoro subordinato, la stessa quantità di agenti TSE vengono utilizzati e il saggio è internamente coerenti. Tuttavia, la concentrazione seme della omogenato cerebrale prioni infetti utilizzato per reazioni di template probabile influisce sul risultato del test CER in quanto titoli seme variabili o diluizioni potrebbe comportare vari livelli di conversione PrP C -per-PrP res. Questo effetto è stato dimostrato in altri saggi in vitro conversione prionica 22 e può complicare il confronto di diversi isolati prione. Per affrontare questo nel saggio CER, semi could essere titolato in ogni substrato PrP C preparata a pH 3.5 e 7.4 per identificare una serie di diluizioni quel modello di conversione PrP C. Diluizioni seme ideali evitare saturare la soluzione con prioni seme eccesso e forniscono ancora comprensione della sensibilità della reazione di conversione. In alternativa, la conversione PrP C-to-PrP res in reazioni dosaggio CER potrebbe essere misurata in multipli, timepoints regolari per tutta la durata del saggio e tracciati come velocità di conversione di curve, simile alle letture per real-time polymerase chain reaction ( qPCR) 23 e in tempo reale, tremante di conversione indotta (RT-QuIC) 24 saggi. Tali letture potrebbero consentono interpretazioni più complete di barriere di specie e sono un focus interessante del futuro sviluppo di questa metodologia.
Nel protocollo presentato qui, usiamo, tubi a basso legame con pareti sottili PCR, ma abbiamo usato anche tubi standard di 1,5 ml in una termo-shaker attrezzata perquesto tipo di tubo. Nessun altre variazioni al protocollo sono necessari per utilizzare i tubi più grandi dimensioni. Nella nostra esperienza, però, abbiamo avuto una produzione più PrP res e risultati più riproducibili in tubi a bassa vincolante PCR rispetto a 1,5 ml provette. Mentre spiegazioni per il miglioramento delle prestazioni del test in provette da PCR sono solo speculativi in questo momento, in base ai risultati che indicano che l'interfaccia aria-acqua è fondamentale per PrP fibrillization 25, ipotizziamo che i tubi più piccoli offrono una tensione superficiale più ottimale per PrP conversione.
Forse il limite principale di utilizzo del test CER è nel capire che cosa rapporti di conversione rappresentano in termini di in vivo specie barriere determinanti, come la penetranza della malattia o della durata del periodo di incubazione. Mentre attualmente sconosciuto, traduzione tra in vitro e in vivo fattori specie di barriera dovrebbe diventare più chiaro con l'uso continuato del test CER nei test Additional TSE barriere di specie che sono già stati stabiliti in vivo e vi aiuterà a qualificarsi risultati nelle specie in cui i dati saggio biologico non sono disponibili. Un vantaggio del test CER rispetto PMCA è la presenza di un controllo interno per la conversione PrP, vale a dire il substrato pH 3,5, che può essere convertita da qualsiasi agente TSE. Questo controllo è di valore quando non è chiaro che, se del caso, gli agenti della TSE dovrebbe causare misfolding di di un host esotico PrP C. L'incapacità di un determinato substrato di accoglienza per amplificare un agente specifico TSE in PMCA potrebbe essere interpretato come prova di una barriera di specie o potrebbe essere dovuto a difetti tecnici. Svantaggi del test CER rispetto a PMCA includono l'amplificazione di res PrP, ulteriori passi in CER preparazione del substrato e non infettività conosciuto nei res PrP prodotte da reazioni CER limitati. È da notare che in uno studio precedente, tuttavia, abbiamo trovato il dosaggio CER determinato un modello simile di res PrP formazioni come quello di PMCA 15. I risultati qui presentati indicano anche che il test CER predice correttamente le barriere di specie per la trasmissione di varie TSE a topi di laboratorio (Figura 3) e suggeriscono che linci possono avere sensibilità di CWD (figura 4), in accordo con i rapporti che i gatti domestici (Felis catus) può acquisire prione della malattia dopo la CWD sperimentale sfida 26,27. Gli studi che utilizzano il test CER potrebbe complimentarmi sforzi di sequenziamento PrP per capire la fauna selvatica suscettibilità alla CWD 28.
Il test CER consente un rapido, a basso costo, la valutazione attendibile del TSE barriere di specie in vitro. Pur non essendo un sostituto completo per il "gold standard" di prova biologica animale, il test CER può essere utilizzato come una prima valutazione dell'esistenza di una specie di barriera TSE che possono giustificare o evitare ulteriori studi in animali vivi. Per questo motivo, e poiché il saggio si basa solosul tessuto cerebrale, che può essere acquistato da animali non sperimentali, il CER è in linea con gli sforzi per sostituire, ridurre e perfezionare le procedure sperimentali animali 29. Oltre a valutare barriere di specie, il saggio CER può anche fornire una piattaforma semplificata con cui studiare i meccanismi del evento fondamentale definire biologia malattia prionica: la conversione del normale, funzionale PrP C ad una forma misfolded.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12% Bis-Tris SDS-PAGE gels | Life Technologies | NP0342 | |
| 0.5 mm Zirconium oxide beads | Next Advance | ZROB05 | Other varieties of beads are also effective |
| Antibodies | various suppliers | Select appropriate primary and secondary antibodies for immunoblot detection of PrPres from species of interest | |
| Bead homogenizer | Next Advance | BBY24M | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | 369434 | High speed with temperature control |
| Conical tubes | any brand | ||
| Cotton-tipped applicator | Uline | S-18991 | |
| Cuphorn sonicator | Heat Systems-Ultrasonics | W-380 | Heat Systems-Ultrasonics, Inc. is now Qsonica, LLC |
| Densitometry software program | UVP | Vision Works LS Image Acquisition and Analysis software | Other programs, such as NIH ImageJ, will also work |
| Dounce homogenizer | Kimble Chase | 885300 | |
| End-over-end mixer | Labnet International | H5600 | |
| Ethylenediaminetetra acetic acid | Boston Bioproducts | P-770 | Hazardous chemical: eye irritation |
| Guanidine hydrochloride, 8 M | Thermo Fisher Scientific | 24115 | Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye irritation |
| Heating block | Fisher Scientific | 11-718 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 435570 | Hazardous chemical: strong acid |
| Lithium dodecyl sulfate sample buffer, 4x | Life Technologies | NP0008 | Hazardous chemical: skin & respiratory irritation, serious eye damage, flammable solid |
| Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | Hazardous chemical: acute toxicity, flammable liquid |
| Microcentrifuge tubes | any brand | ||
| Mini-centrifuge | Labnet International | C1301 | |
| N-lauroyl-sarcosine (sarkosyl) | Sigma-Aldrich | L-5125 | Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye damage |
| Nonidet P-40 | Amresco | M158 | Hazardous chemical: skin irritation, eye damage |
| SDS-PAGE gel system | Life Technologies | NuPAGE electrophoresis system | Other SDS-PAGE systems will also work |
| PCR tubes (low-binding) | Axygen | PCR-02-L-C | |
| Pestle homogenizer | Fisher Scientific | 03-392-106 | |
| pH meter | Sentron | SI600 | |
| Polyvinyldifluoride membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Proteinase K | Promega | V3021 | Hazardous chemical: skin & eye irritation, respiratory sensitisation, organ toxicity |
| Reducing agent for SDS-PAGE samples, 10x | Life Technologies | NP0009 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | Hazardous chemical: acute toxicity |
| Sodium dodecyl sulfate | Thermo Fisher Scientific | 28364 | Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye damage, flammable solid |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | Hazardous chemical; strong base |
| Syringe | BD Biosciences | various | Use syringe size appropriate to volumes of substrate to be homogenized |
| Syringe needles | BD Biosciences | various | |
| Thermoshaker (PCR tube shaker) | Hangzhou All Sheng Instruments | MS-100 | |
| Tris base | Bio Basic | 77-86-1 | Hazardous chemical: skin, eye, respiratory irritation |
| Triton X-100 | Integra Chemical Company | T756.30.30 | Hazardous chemical: acute toxicity, eye irritation |
| Vortexer | Fisher Scientific | 12-812 |
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