Introduction
Bulaşıcı sünger tipi ansefalopatiler (TSEler prion hastalıkları, vs.), hayvanlarda ve insanlarda çeşitli etkiler uzun kuluçka dönemleri ile ölümcül nörodejeneratif hastalıkların bir grubudur. TSElerin varsayılan etiyolojik ajan bir enfeksiyon, hastalık ile ilişkili olarak PrP (PrP C) normal hücre formunun şablon odaklı dönüştürme yoluyla kendi kendine yayılma kapasitesine sahip konakçı prion proteini (PrP), bir yanlış katlanmış izomer oluşur enfekte konak 1 merkezi sinir sistemi dokularında biriken formu (PrP TSE). Bulaşıcı memeli prionların genellikle türler arası iletim olayları 2 sınırlayıcı "TSE tür engeli" kavramına yol açmıştır bir türe özgü bir şekilde, konak-to-host dan iletir. prion tür bariyer biyolojik belirleyicileri iyi anlaşılmış değildir. Bulaşıcı PrP TSE ve ana PrP Cı C arasında amino asit dizisi benzerliğibir kuvvetle dönüşüm 3-5 gerçekleşir, ancak in vivo 6,7 gözlenen tüm prion iletim olayları açıklamak için yetersiz kalır mı etkilemektedir.
Böylece, TSE tür engellerin karakterizasyonu büyük ölçüde hayvan meydan çalışmaları güvenerek etti: diğerinden prionlara verilen bir türe naif hayvanların teşhir ve hastalığın başlangıcında ve iletim verimliliği göstergeleri olarak saldırı hızı ortaya çıkan kuluçka süresi ölçme. Insan olmayan primat, PrP C ifade eden fareler da çalışma 8, bu tür kullanılır. transgenik fare üretimi ve uzun süreli prion biyoanalizlerin yanı sıra, hayvan kullanımının etik hususlar ile ilgili maliyetler, TSE türleri engellerin deneysel soruşturma engeller vardır. TSEler insan türü bariyer değerlendirilmesi, insan PrP C ifade etmek üzere geliştirilen fareler üzerinde dayanır. Bu fareler insan TSElerinin veya t değişikliklere yenik uzun kuluçka dönemleri gerektirirhızlı hastalık başlangıcı 9 o insan PrP C molekülü. Bu farelerde insan olmayan TSEler için İnkübasyon süreleri zorlu negatif sonuçların yorumunu yapıyor normal fare ömrü ötesine uzanabilir. Sigara insan primatlar da insan türü engelleri incelenmesi için vekiller olarak kullanılmıştır, ama insan konakta ilerlerken bu çalışmalar tam hastalığı özetlemek olmayabilir hayvan deneyleri ve insan olmayan primatların diğer türleri gibi aynı sorunlarla doludur.
Hayvan biyodeneyler bir TSE için bir türün hassasiyetini ölçmek için "altın standart" yöntemi kalır, ancak engeller, maliyetler ve bu canlı hayvan çalışmalarının etik alternatifler soruşturma mecbur var. PrP TSE tarafından seribaşı bir proteinaz K (PK) dirençli devlet (PrP res) ev sahipliği PrP C dönüşüm değerlendirilmesine dayanmaktadır in vitro tahliller, bir dizi gelişmiş ve TSE sp araştırmak için kullanılmıştırecies engelleri 10-12. In vitro tahlillerin örnekleri, hücre içermeyen dönüşüm tahlilleri, protein siklik amplifikasyon (PMCA) yanlış katlanması ve dönüşüm verimliliği oranının (CER) deney 10-14 içerir. Bu testlerin hiçbiri doğal enfeksiyondan sonra tür engelleri katılan hesap periferik faktörler içine alırken, tüm TSEler için potansiyel duyarlı ana belirlemek için yararlı olabilir.
Burada normal beyin homojenatlanndaki elde edilen iki denatüre PrP substratı tezgah üstü prion dönüştürme reaksiyonlarında kullanıldığı CER tahlili için protokol, (Şekil 1) 13 sunulmaktadır. PH değeri 7.4 'de denatüre alt-tabaka PrP Cı sadece bir tür bariyer 14 yokluğunda reaksiyona içine ekildi PrP TSE PrP res dönüştürülebilir. Bunun aksine, pH 3.5, diğer alt-tabaka PrP C denatürasyonu PrP res aşağıdaki kuluçkalama dönüştürülmesini sağlarve herhangi bir türden elde edilen PrP TSE ile dönüşüm için bir kontrol olarak işlev görür. pH 3.5 substratın pH 7.4 alt-tabaka görece PrP res PrP C dönüşüm oranı tür bariyer bir ölçü sağlar. Bu da, CER deneyi, çeşitli TSElerin laboratuar farelerin türler arası bilinen tahmin eder ve kronik bitkinlik hastalığını (CWD) ve diğer TSEler 14 Hammond koyun dahil olmak üzere birçok memeli türünden, bir tür bariyer tahmin çabalarında deneyi kullandık bulmuşlardır 15. Yararlı Bu metodoloji bulacaksınız TSE türleri engelleri ya da PrP C -to-PRP res dönüşüm değerlendirilmesi hızlı tarama sağlayan bir araç ilgilenen Müfettişler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
USGS Ulusal Yaban Hayatı Sağlığı Merkezi'nde gerçekleştirilen Hayvan çalışmaları Laboratuar Hayvan Refahı kurallar NIH Ofisi uyarınca ve kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesi protokol # EP080716 altında yapıldı. Avcı-hasat hayvanlardan dokular Wisconsin veya Doğal Kaynaklar Michigan Müdürlüklerinden hediye edildi.
1. Çözüm hazırlanması
Not: Aşağıda listelenen çözümler aşağıda Bölüm 2 CER deney alt-tabakanın hazırlanması için gereklidir. Daha yüksek konsantrasyonu, stok çözeltilerinden, bu çözümlerin her birinin hazırlanması; stok çözeltileri için tavsiye edilen konsantrasyon listelenen her biri ilgili kimyasal tanımlamanın sonra parantez içinde verilmektedir. Kullanılana kadar 4 ° C'de Yüzey hazırlığı ve mağaza üzerine taze tüm çözümleri hazırlayın.
- 100 mM s: liziz tamponu için, 10 mM Tris içinde, pH 7.5 (1M Tris, pH 7.5 stok çözeltisi tavsiye edilir) aşağıdaki içeren bir çözelti hazırlamakde sodyum klorid (NaCI, 1 M stok çözelti), 10 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA, 500 mM EDTA, pH 8.0 stok çözelti),% 0.5 NP-40 (% 10 stok çözelti),% 0.5 deoksikolat (DOC,% 10 stok çözeltisi ).
- Dönüşüm tamponu sağlamak için,% 0.05 sodyum dodesil sülfat (SDS,% 10 stok çözelti) ve% 0.5 Triton X-100 1, fosfat tamponlu tuzlu su içinde (% 10 stok çözelti) (PBS, 10, pH 7.4 stok çözelti) ihtiva eden bir çözelti hazırlayın.
- Chaotropic çözümler için, guanidinhidroklorid 1x PBS (GdnHCl, 8 M stok) (10x stok çözelti) iki 3 M çözüm hazırlamak. Konsantre edilmiş hidroklorik asit (HCl) ile 3.5 ± 0.05'e çözümlerden biri pH ayarlayın. İkinci çözeltinin pH değeri pH 7,4 ± 0,05 kalmasını kontrol edin ve konsantre HCI veya sodyum hidroksit (NaOH), gerekirse kullanarak ayarlayın.
2. CER Testi Yüzey Çiftleri hazırlayın
- Ilgi türlerin sağlıklı olmayan TSE-enfekte beyin dokusu elde edilir ve% 10 ağırlık başına hacim hazırlamakAşağıdaki yöntemlerden herhangi biri kullanılarak parçalama tamponu içinde homojenatı (ağ / hac): Dounce, boncuk değirmeni veya havan ve dibek homojen hale getirilmesi. Ayrıca, şırınga-ve-iğne homojenizasyon onları tabi tabaka aspire ve 27 G şırınga iğne ile kolaylıkla sınırdışı edilebilir kadar artan göstergesi iğneler kullanarak homojenatları ortaya çıkan rafine.
- Kemirgenler ve diğer küçük memeliler hazırlanan yüzeyler için, bütün beyin (ler) homojenize; Daha büyük memeliler hazırlanan yüzeyler için, homojenatları hazırlamak için obex (beyin sapı) doku kullanın. Beyin homojenatının miktarını seçerken, Aşama 2.6 protein çökelmesi için kullanılan santrifüj kapasitesinin en fazla% 50 hazırlar.
- Edinilmiş beyin dokusunun kalitesi sorgulanabilir ise, SDS-PAGE 16 ve immunoblot 17 alt tabakaya önce hazırlık PrP C düzeylerini değerlendirmek.
- Ayrı etiketli plastik konik tüpler iki eşit hacimlerde içine beyin Homojenat bölün. (GdnHCl EkleBeyin homojenatı 1 hacim oranı: pH 3.5 ya da 1, her bir tüpe 7.4 ya da 1 PBS içinde 3 M solüsyonu).
- Iki çözeltinin pH değeri kontrol edin. Konsantre HCI kullanılarak 0.05 ± pH, pH 3.5, substratın pH ayarlayın. Diğer alt-tabakanın pH'ı, pH 7.4 ± 0.05 olarak kalmasını sağlamak ve HCI veya NaOH ile gerektiğinde gerekli olduğu yerde pH'ı ayarlamak. Asit veya bir baz makul ilavesiyle pH değerleri aşılması kaçının.
- 5 saat boyunca oda sıcaklığında (RT), bir ucu-üzerinde-ucunda karıştırıcı çözüm döndürün.
- Her konik bir tüp içinde alt-tabaka çözeltiler metanol dört hacmi eklenerek proteinin çökeltilmesi, girdap, iyice karıştırılmakta ve 16-18 saat süre ile -20 ° C 'de inkübe etmek.
- 4 ° C'de 30 dakika boyunca 13,000 x g'de santrifüj ile tortu örnekleri. Dikkatle süzün ve Süpernatantlar atmak ve metanol pelet buharlaşmasına izin verin. Tüp içine sarıldı metanol emmede yardım sağlamak için pamuk uçlu aplikatörler kullanın. Pelet over-dr izin vermeyiny ve metanol artık görünür bir kez, bir sonraki adıma geçin.
- Dönüşüm tampon maddesi içinde yeniden süspanse Protein peletleri. Aşama 2.2 Her tüpe dağıtılmıştır beyin homojenatı başlangıç malzemesinin miktarına eşit dönüşüm tampon bir miktar kullanın.
NOT: Bu dönüşüm tampon hem de pH 3.5 ve 7.4 ile muamele edilmiş alt-tabaka preparatlar protein pelet yeniden askıya almak için (deterjan düşük seviyeleri ve fizyolojik bir pH'a sahip) Yukarıdaki adım 1.2 tanımlanan bir çözelti kullanılır kritiktir. - Bir cuphorn sonikatörde Kısaca sonikasyon altyapı solüsyonları, (% 30 maksimal gücü ° 'de 10 sn), 0.5 içine kısım - etiketli bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri içinde, 1.0 ml hacim. Her bir alt-tabakanın bir tümbölen üzerinde bir kalite kontrol immüno (adım 2.9) yapın. CER tahlili (Bölüm 4) gerçekleştirmek için hazır olana kadar -80 ° C'de diğer alikotları saklayın.
- Kullanmadan önce CER substrat çiftleri (Şekil 2) kalite kontrolünü gerçekleştirin. Bu adımlar CER alt-tabakalar provid sağlamakDönüşüm çalışmalarında E en iyi sonuçlar.
- İki yüzeylerde PrP C karşılaştırılabilir miktarda olun. 10-25 SDS-PAGE 16 tarafından her alt tabakanın ul ve 17 imünolekeleme PrP seviyelerini karşılaştırın. 7.4 ve 3.5 alt-tabakalar birbirinin% 10 ~ dahilinde pH protein seviyeleri, alt-tabaka çiftlerinin CER çalışmalarda kullanım için uygun ise.
NOT: PrP immünblotlarında geniş PrP C bozulma kanıt göstermek gerekir. PrP imünoreaktivite özellikle> 20 kDa olmalıdır. Bu moleküler kütleye daha az Grupları bozunma ürünleri olabilir. Bantlama desen substrat çiftleri arasında kabaca eşit olmalıdır. - Her iki alt tabaka PrP Cı duyarlı PK olması gerektiği gibi, 100 ug / ml bir son konsantrasyonda PK ile her bir alt tabaka 10-25 ul tedavi ve ısı bir çalkalayıcıda 1 saat süreyle 37 ° C'de 1000 rpm'de örnekleri özet. SDS-PAGE 16 ve 17 imünolekeleme kalan herhangi bir sinyal PrP değerlendirin.PrP res ile Yüzeyleri CER çalışmalarında kullanılmak için uygun değildir.
- İki yüzeylerde PrP C karşılaştırılabilir miktarda olun. 10-25 SDS-PAGE 16 tarafından her alt tabakanın ul ve 17 imünolekeleme PrP seviyelerini karşılaştırın. 7.4 ve 3.5 alt-tabakalar birbirinin% 10 ~ dahilinde pH protein seviyeleri, alt-tabaka çiftlerinin CER çalışmalarda kullanım için uygun ise.
3. TSE Ajan tohumları hazırlayın
- Çevrede türünden TSE ile enfeksiyona uğramış beyin dokusu elde edilir ve 1 x PBS, pH 7.4 içinde homojenat yukarıdaki adım 2.1 listelenen yöntemler kullanılarak (a / h), 10% hazırlar.
Not: Tohumlar aynı zamanda merkezi sinir sistemi dışındaki diğer TSE ile enfeksiyona uğramış doku elde edilebilir, bununla birlikte, TSE ile enfeksiyona uğramış periferik dokularda türetilen tohumlar ile beyin türevi substratların dönüşüm etkinliği daha deneysel yayınlanmış literatürde değerlendirilmemiştir. - 100 içine Homojenat (ler) elde edilen kısım - hazır olana kadar -80 ° C de, 0.5 ml mikrosantrifüj tüpleri içinde 300 ul hacim ve mağaza CER deneyi gerçekleştirmek için.
4. CER Testi
Not: CER deney bir türden ("tohum" olarak verilen), PrP TSE nispeten küçük bir miktarının ilave edilmesini içerirkısmen pH 3.5 ya da 7.4 ya da C'da denatüre edilmiş olan başka bir türden (enfekte edilmemiş beyin "alt-tabaka" olarak verilen), PrP ° C'lik bir kıyasla, daha fazla içine. Uzun bir çalkalama enkübasyon süresinin ardından, her bir reaksiyon PrP TSE PrP C şablon odaklı dönüştürme PrP res kalan PK sindirim hem de immün algılama sonra densitometrik sinyali ile değerlendirilir. Daha önce pH değeri 3.5 vs 7.4 de denatüre yüzeylerde PrP res seviyelerini karşılaştırılması tür engeli bir ölçü sağlar. Bu deney prosedürü bir deneme genel görünüşü Şekil 1'de verilmiştir.
- Yavaş yavaş bulaşmamış CER substrat çiftleri çözülme buz yatağı (yaklaşık 1 saat çözülme zamanı) üstüne yerleştirerek ve TSE-enfekte tohum çözümleri (tahlil daha önce hem pH 3.5 ve 7.4 de denatüre yüzeylerde eşit hacimlerde gerektirir).
- Tamamen çözülmüş sonra, aspirat ve ardından aracılığıyla her bir taban çözüm sınırdışı27 G iğne şırınga birkaç kez yeniden homojenize. Kısaca, 30% maksimum güç ° 'de 10 saniye boyunca her bir TSE ile enfeksiyona uğramış tohum çözeltisi sonikasyon. Dönüşüm reaksiyonları hazırlarken buz üzerinde tüm çözümleri tutun.
- TSE ajanı başına Etiket 5 ayrı düşük bağlanma, ince duvarlı PCR tüpleri test edilir.
- PH 3.5 hazırlanmış, pH 7.4 ve (b) CER alt-tabaka hazırlanır: (a) CER alt-tabaka 95 ul% 10 TSE ile enfeksiyona tohum çözeltisi 5 ul ekleyerek, bu tüpler dönüşüm reaksiyonları hazırlayın.
- Her deney örneği için, önce her iki pH değeri 3.5 ve 7.4 de denatüre CER substrat çiftleri paralel reaksiyonlar hazırlamak.
- Ampirik belirlenmesi yoluyla enfekte olmamış beyin yüzeye TSE ajanı tohum oranları optimize. Ortak tohum: kullanılan alt-tabaka oranları 100 ul toplam reaksiyon hacmi korumak ve 1:99 ul 2:98 ul ve 5:95 ul bulunmaktadır. Çoğu uygulama için, 5:95 ul tohumu: Yüzey hacim oranı uygun ve inci ne sunulmuştur edilirprotokoldür.
- Aşağıdaki gibi, TSE maddesi başına üç kontrol numuneleri, test edilen hazırlayın: (a) giriş PrP res için bir kontrol olarak 95 ul dönüşüm tamponu,% 10 TSE ile enfeksiyona tohum çözeltisi 5 ul; (b) pH değeri 3.5 ve non-spesifik olmayan şablonu dönüşüm için kontrol olarak (C), pH 7.4'te hazırlanan 95 ul substrata 5 ul dönüşüm tampon eklemek.
- Kısaca iyi tohum ve alt tabakayı karıştırmak için kapalı PCR tüpünde her örnek vorteks. PCR tüp kapağına sıkışan reaksiyon karışımının herhangi hacmi kaldırmak için düşük hızda tezgah üstü mini santrifüj bir anlık darbe ile izleyin.
- PCR tüpleri kabul donanımlı bir tezgah üst termo-çalkalayıcı içine ayrı ayrı etiketli PCR tüpleri yükleyin örnekleri. 24 saat boyunca 37 ° C'de 1000 rpm'de örnekleri çalkalayın.
- Izlenerek (ağırlık / hacim) ve FK-100 ug / ml 'lik bir nihai konsantrasyona kadar% 2'lik bir nihai konsantrasyona kadar Sarkosyl ilave sarsma. Özet örnekleri termo-karıştırıcısı içinde 1 saat boyunca 37 ° C'de 1,000 rpm'de.
NOT: PrP C PK sindirim örneklerin sonrası dönüşüm yardımları için Sarkosyl eklenmesi. Giremeyen numuneler (4.5 Adım) yanlış pozitif sinyaller neredeyse Sarkosyl eklenmesiyle ortadan kalkar. - 17 immunoblotting SDS-PAGE 16 her bir numune içinde Kalan PrP res 5 dakika boyunca 95 ° C'ye kadar, SDS-PAGE numune tampon maddesi, ısı örnekleri ekleyin ve çözmek.
Not: Örnek tampon ve ısıtma ek olarak, örnekler hemen işlenebilir veya örnekleri -20 ° C'de saklandı veya -80 ° C önce immunoblotting sonra. Burada sunulan tüm veriler Novex NuPAGE jel ve transfer sistemleri kullanılarak üretildi. CER tahlilinden Tüm örnekler örnek tamponu ve üreticinin talimatlarına uygun olarak indirgeme maddesi ile muamele edilmiştir. Numuneler daha sonra 5 dakika boyunca 95 ° C'de ısıtıldı ve her numune için 30 ul% 12 Bis-Tris hazır jel yüklenmiştir. - Bir tedbir olarak dönüşüm verimliliği oranı (CER) hesaplayıntür bariyer. Dansitometri 17 ile PrP res Tedbir seviyeleri ve pH 3.5 örnek olduğu pH 7.4 numunenin toplam yoğunluğunu bölmek. Bir yüzdesini üretmek için 100 ile çarpın.
- Belirli bir TSE ajanı ile bir tür için ortalama CER ± standart sapma oluşturmak için bağımsız deneysel çoğaltır gelen verileri derlemek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CER testinin başarılı kullanımı dönüşüm reaksiyonlarında kullanılan substrat çiftlerinin kalitesine büyük ölçüde bağlıdır. Bu nedenle, alt-tabaka çiftini CER hazırlanması için prosedürler takip edilerek, bir kalite kontrol immünoblot (Şekil 2) yapılmalıdır. Her iki yüzeyler için, tahlil imünoblotlama ile 10-25 ul. PrP Cı her alt-tabaka olarak kolaylıkla tespit edilebilir ve PrP C düzeyleri ikisi arasında yaklaşık olarak aynı olmalıdır. Immünoreaktivite 20 kDa üzerinde ağırlıklı olarak görülebilir, ama daha küçük bantlar da belirgin olabilir. Bizim tecrübelerimize göre, küçük bantların varlığı türleri bağlıdır. Düşük molekül ağırlıklı ürünler gözlenmesi halinde, kendi varlığı hem substrat çiftler halinde teyit edilmelidir.
O CER yüzeyler PK yüzeylerde muamele ederek (Şekil 2) endojen PrP res ücretsiz olmasını sağlamak için önemlidir. PrP res mevcut ise, hayvan subst için kullanılanoran hazırlık TSE-enfekte veya subklinik enfekte olabilir. Seçenek olarak ise, alt-tabaka PrP Cı denaturasyonu veya çökeltme işlemleri sırasında bir PK dirençli duruma yanlış katlanmış olabilir. Nedeninden bağımsız olarak, PrP res ihtiva eden CER, substrat dönüştürme deneyi içinde kullanım için uygun değildir.
Laboratuvar fareleri TSE araştırmalarında en sık kullanılan deney hayvanlarında biri; örneğin, en TSElerin kendi duyarlılık CER deneyinin kalitesini test etmek için. Şekil 3A (CD1 soyu) PrP substratm fareden PrP C CER deney dönüştürme sonuçlarını göstermektedir karşı in vivo bir kriter sağlamak, 8 iyi karakterize edilmiş olan fare-pasajını, skrapi RML suşu) 1 ile res bir madde fare konukçuda 18, 2) yerli koyun klasik skrapi, uzun bir kuluçka süresi 18 Aşağıdaki farelere iletebilir bir ajan, ve 3) WHI adaptete-kuyruklu geyik (Odocoileus virginianus) CWD ve hamster pasajlandı skrapi 263K suşu, ajanlar minimal veya 19,20 duyarlı olan fareler. Elde edilen PrP res seviyeleri PrP res pH 3.5 denatüre ve TSE ajanı ile seribaşı tüm yüzeylerde bulunan iken fare yüzeyler pH 7.4 de denatüre ve çeşitli TSE ajanları ile seribaşı genelinde değişken idi. PH 7.4 ve 3.5 substratlar PrP res seviyelerini karşılaştıran Dönüşüm oranı bağımsız olarak en az üç kez hesaplanır ve Şekil 3B'de gösterilmiştir ortalama ± SD edildi. RML ile tohumlanmış reaksiyonlar için, pH değeri 7.4 ve 3.5, substratlar arasındaki dönüşüm oranları yaklaşık olarak% 100 idi. Skrapi ile tohumlanmış olan pH değeri, 7.4 alt-tabaka dönüşüm pH 3.5 substrattaki yaklaşık% 75 oldu. CWD veya pH 7.4 substrat 263K-kaynaklı dönüşüm az oldu. Bir varyans tek yönlü analizi RML ve s dönüşüm oranlarında bir fark ayırt edilememiştircrapie veya CWD ve 263K, RML ve skrapi ancak dönüşüm oranları CWD'sindeki ve 263 K'da bu anlamlı farklı bulunmuştur.
CER deneyi, insan dokularıyla veya biyolojik analizler, çok zor veya etik ve transgenik fare üretimi istenmediği olan hayvan türlerinde kullanım için adapte edilebilir. Biz CWD'sindeki çeşitli yaban hayatı türlerinin duyarlılığını karakterize bu testi kullanılarak edilmiştir. Bu deneyde kullanımına ilişkin bir örnek olarak, Şekil 4 'de bir ön sonuçları sunulmaktadır. Avcı tuzak bobcats (Lynx rufus) için Brain bulunmuştur hala PrP C ve PrP yıkım ürünlerinin bulgulanabilir seviyelerini ihtiva bu, bu işaret, geniş değildi dokular CER alt-tabaka (Şekil 4A) için kabul edilebilir bir kaynak olabilir. Vaşak beyninden elde Yüzey çiftleri uygun bir molekül ağırlığına PrP imünoreaktivite gösterdi ve endojen PrP res içermeyen (Şekil 4B). Iki ayrı hayvanlardan elde edilen vaşak CER alt-tabaka çiftlerinin CWD maddesi Şekil 3'te tarif edilen fare CER deneyinde kullanılan aynı beyaz kuyruklu geyik ile inkübe edildi, biz, PrP res seviyeleri pH değerinde hazırlanan alt tabakaların göre olan pH 7.4'te hazırlanan alt tabakaların bulundu CWD ile dönüştürme bobcat PrP ° C'lik bir minimum tür bariyer göstergesi 3,5 (Şekil 4C). Aynı CWD beyaz kuyruklu geyik PrP C dönüştürülmesi için CER bir pozitif kontrol olarak, burada bobcat PrP C dönüştürmek için kullanılan izolat, daha önce Morawski ark 95.2 ±% 18,4 olarak bildirilmiştir. (2013) 15.
Şekil 1:. CER testinin Deneysel bakış İki tahlil yüzeyler kısmen beyin dokusu w enfekte olmayan prion PrP C denatüre hazırlanırpH 3.5 veya pH 7.4 ya en i chaotropic çözümleri. Elyaf ilgi prion madde elde edilen PrP TSE ile tohumlanır ve deney örnekleri, her ikisi de pH 3.5 ve 7.4 substratlar PrP TSE dönüşüm PrP C izin vermek için çalkalanarak 24 saat inkübasyon tabi tutulur. İnkübasyondan sonra, dönüştürme, SDS-PAGE ve immün değerlendirilir. Sinyal yoğunluğu, yoğunluk ölçümü ile okunur ve CER her deney numunesi için pH 3.5, sinyal yoğunluğu, pH 7.4 oranı ile hesaplanır.
Şekil 2: CER yüzeylerde Kalite Kontrol. CER tahlilinde kullanımlarına önce fare alt-tabakalar, pH 7.4 ya da 3.5 ya da hazırlanan (A) her bir alt-tabaka çiftinin PrP C içeriğini değerlendirmek için PK tedavi 1) yokluğunda immunoblotting deneye tabi tutulur (PrP C düzeyleri arasındaki eşdeğer olmalıdır pH 7.4 ve 3.5 substra TES CER deneyinde kullanılmak üzere) ve 2) PK varlığı (100 ug / ml) ile tedavi için test etmek için önceden var olan substratlar (önceden var olan PrP res kullanım için uygun değildir görüntüleyen alt tabakalar hazırlanması için kullanılan dokular PrP res CER tahlili). (B), dönüşümü tahlil sırasında spesifik olmayan pRP res oluşumu için test etmek için, pH 7.4 ya da 3.5 ya da hazırlanmış fare PrP Cı alt-tabakalar, 37 ° C, 1000 rpm'de, 24 saat süre ile çalkalandı, dönüştürme tamponu ile tohumlanır ve daha sonra PK ile muamele edilmiş (100 ug / ml) (sağ iki şerit) immunoblotting PrP res için tahlil edilmiştir. Sigara sarsılmış, olmayan PK tedavi fare yüzeyler tahlil reaksiyonlar (sol iki şerit) toplam PrP C içeriği temsil eder. (B), alakasız şerit netlik için kırpılmış edilmiş, ancak her immunoblot paneli aynı jel, membran ve maruz türemiştir. Tüm panellerde immünblotlarında SAF 83 monoklonal antikor kullanıldı.
Şekil 3:. Laboratuvar fare substrat kullanılarak CER tahlil (A) Fare CER tahlil substrat pH 7.4 veya 3.5 RML fare adapte skrapisi, yerli koyun klasik skrapisi, beyaz kuyruklu geyik, kronik israf hastalığı ile inkübe edildi (CWD'sindeki) ya da 263 K'da ya hazırlanan CER tahlilde hamster adapte skrapi suşu. Kontrol numuneleri (etiketli "none") Sadece enfeksiyöz ajan eşit miktarda ve hiçbir fare substratı içeriyordu. Numuneler, her şerit, aşağıda gösterilen her örnek için monoklonal antikor SAF 83. Ham dansitometrik değerleri ile immunoblotting PK dayanıklı prion proteininin (PrP S) mevcudiyeti için analiz edilmiştir. (B), bir bar grafiktir ortalama oranlarını gösteren (± standart sapma) pH 7.4 ve her enfeksiyöz ajan için 3.5 fare yüzeyler arasında en az 3 bağımsız deney koşulara dayalı. Alt-harfler istatistiksel bakınhomojen alt kümeleri (Tukey-Kramer asgari önemi fark yöntemi ile varyans analizi; p <0.05). Bu rakam, Morawski et al. 2013 15 modifiye edilmiştir.
Şekil 4: CER tahlilinde Örnek kullanımı CWD için bobcat hassasiyetlerini incelemek için Bobcat beyin homojenatı (A) ve PrP C mevcut değerlendirmek için PK yokluğunda ve varlığında (100 ug / ml) test edildi ve immünolojik işaretleme CER deney substratı (B) gerçekleştirildi. düzeyleri ve önceden var olan PrP res varlığı bulunmuştur. (C), Bobcat alt-tabakalar dönüşüm tamponu ile tohumlandı ve spesifik olmayan pRP S oluşumunu değerlendirmek için CER deneyinde tahlil edilmiştir (iki şerit sol). Sigara sarsılmış, olmayan PK tedavi bobcat yüzeyler tahlil reaksiyonlar (sağ iki şerit) toplam PrP C içeriği temsil eder.Ya da pH değeri 7.4 veya 3.5 de hazırlanan bileşik (D), Bobcat alt-tabaka CER tahlili kullanılarak beyaz kuyruklu geyik CWD ile inkübe edilmiştir. Kontrol örneği (etiketli "none") CWD maddesi eşit miktarda ama hiçbir bobcat substratı içeriyordu. Her numune için ham dansitometrik değerleri her kulvar altında görüntülenir. Tüm paneller kedi prion proteini 21 ile reaksiyona kullanılan monoklonal antikor, 3F4, içinde Muafiyet benekleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokolün başarıyla tamamlanması için, dikkat substrat hazırlanması (adım 2.1.2) ve dönüşüm reaksiyonlarının (adım 4.4.2) için madde oranı için tohum için kullanılan bulaşmamış beyin dokusunda PrP C seviyelerine dikkat edilmelidir. Bizim tecrübelerimize göre, beyinleri sürece PrP C immunoblotting (Şekil 4) ile mevcut olduğu gibi, önemli bir dönem otopsi sonrası CER substrat olarak kullanılmak üzere elde edilebilir. Aslında, bazı otoliz CER çalışmalar için kullanılan bobcats beyinlerinde gözlenmiştir. Bununla birlikte, bu beyinlerinden elde edilen alt-tabakaların inkübasyon hala PrP res oluşumu ile sonuçlandı. Bu kısmen, CER tahlilinde sağlamlığı çok proteazlarını inaktive olur 1.5M GdnHCl CER substratların denatürasyon, elde edilir, ki speküle ediyoruz.
Oranları alt tabakaya Tohum imünoblotlama ile kabul PRP res sinyali elde etmek ampirik olarak tespit gerekebilir. Çok fazla ya da çok lsubstrat oranları: ittle PrP res yüzey ve tutarsız dönüşüm oranları tohum optimize tüm nedenleri eksik kontrol örneklerinde densitometrisi, yüksek arka plan PrP res seviyelerini gerçekleştirmek için. Varyasyonlar 100 ul toplam reaksiyon hacmi korumak ve 1:99 ul 2:98 ul ve 5:95 ul bulunmaktadır. Substrat hacim oranı optimal: hemen hemen tüm durumlarda, biz 5:95 ul tohum bulduk. Ne olursa olsun istihdam oranı ne, TSE ajanı eşit miktarlarda kullanılır ve tahlil tutarlı olduğunu. Ancak, şablon reaksiyonlar için kullanılan prion-enfekte beyin homojenatının tohum konsantrasyonu olasılıkla bu değişen tohum titreleri veya seyreltici CER tahlil sonucu PrP C -to-PRP res dönüşüm çeşitli düzeylerde neden olabilir etkiler. Bu etki in vitro prion dönüştürme deneylerinde 22 Diğer ispat edilmiştir ve farklı bir prion izole karşılaştırılması karmaşıklaştırabilir. CER tahlilde bu adres için, tohumlar cPrP Cı dönüşüm şablon seyreltileri, bir dizi tespit etmek, pH 3.5 ve 7.4 de hazırlanan her PrP Cı alt-tabaka olarak titre edilebilir ould. İdeal tohum dilüsyonları fazla tohum prionlara ile çözüm doyurarak önlemek ve henüz dönüşüm reaksiyonunun hassasiyeti içgörü sağlamak. Seçenek olarak ise, CER deney reaksiyonları PrP Cı -to-PRP res dönüştürme deneyinin süresi boyunca birden fazla, düzenli zaman noktalarında ölçülmüştür ve gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu için okumalar (benzer hızı arasında dönüşüm eğrileri olarak çizilen edilebilir qPCR 23) ve gerçek-zamanlı kaynaklı dönüşümü (RT-QUIC) 24 tahlilleri sarsıntı. Bu tür okumalar tür engellerin daha kapsamlı yorumlara izin ve bu metodolojinin gelecekteki gelişimi ilginç bir odak olabilir.
Burada sunulan protokol, düşük bağlanma, ince duvarlı PCR tüpleri kullanın, ama biz de donanımlı bir termo-çalkalayıcı standart 1.5 ml'lik tüpler kullandıkborunun bu tür. Protokole başka varyasyonlar, daha büyük boyutlu borular kullanmak için ihtiyaç vardır. Bizim tecrübelerimize göre, ancak, biz daha fazla PRP res üretim ve 1.5 ml tüplere kıyasla düşük bağlayıcı PCR tüpleri daha tekrarlanabilir sonuçlar vardı. PCR tüplerine tahlilinde gelişmiş performans için açıklama yalnızca bu zamanda spekülatif hava-su ara-yüzü PrP fibrillization 25 için kritik olduğunu gösteren sonuçlarına göre olmakla birlikte, daha küçük borular PrP için daha uygun olan bir yüzey gerilimi temin varsayımında dönüşüm.
Belki CER testinin kullanımı baş sınırlama dönüşüm oranları gibi hastalık geçişi veya kuluçka dönemi uzunluğu gibi in vivo tür engeller belirleyicileri, açısından temsil hangi anlayış içinde. In vitro ve in vivo tür engelleyici faktörler olarak bilinmemektedir, çeviri kontrol addit CER tahlilinde sürekli kullanımı ile daha da açık hale gerekirkenZaten in vivo kurulmuş ve biyotahlil veri mevcut değildir nerede türler sonuçları nitelemek için yardımcı olacaktır uğratarak TSE türler arası geçiş. PMCA göre CER tahlilinin bir avantajı, herhangi bir TSE madde ile dönüştürülebilir PrP dönüşümü, yani pH 3.5 alt-tabaka, bir iç kontrol varlığıdır. O varsa, TSE ajanları egzotik konağın PrP C yanlış katlanmasına neden gereken, belli olduğunda Bu kontrol değeri yoktur. PMCA belirli TSE ajanı yükseltmek için belirli bir konak substrat yetersizlik, bir tür bariyer kanıtı olarak yorumlanabilir veya teknik başarısızlıkları nedeniyle olabilir. PMCA göre CER tahlil dezavantajları PrP res, CER yüzey hazırlığından ek adımlar ve CER reaksiyonlar tarafından üretilen PrP res bilinen enfekte güçlendirilmesini sınırlı içerir. Bu önceki çalışmada, ancak, CER deney PrP res benzer bir model fo neden mu olduğu not edilmelidirPMCA 15 olduğu gibi ım. Burada sunulan sonuçlar da CER tahlil doğru laboratuvar fareleri (Şekil 3) çeşitli TSElerinin iletimi için türleri engelleri tahmin belirtmek ve bobcats yerli kedi (raporları ile anlaşarak, CWD'sindeki (Şekil 4) Felis yatkınlığı sahip olabileceğini düşündürmektedir catus) Deneysel CWD meydan 26,27 sonra prion hastalığı edinebilirler. CER testi kullanılarak çalışmalar CWD'sindeki 28 yaban hayatı yatkınlığı anlamak için PrP sıralama çabalarını iltifat olabilir.
CER tahlil hızlı, düşük maliyetli, in vitro TSE tür engellerin güvenilir değerlendirmesini sağlar. Hayvan biyoassay "altın standart" değil tam bir yedek olsa da, CER deneyi haklı veya yaşayan hayvanlarda ileri çalışmalar ortadan kaldırabilir TSE tür bariyer varlığının bir ilk değerlendirme olarak kullanılabilir. Bu nedenle, tahlil, sadece dayanır ve nedeniyledeneysel olmayan hayvanlardan elde edilebilir beyin dokusu üzerinde, CER hayvan deney prosedürleri 29, yerine azaltmak ve rafine çabaları ile uyumludur. Bir yanlış katlanmış forma normal, fonksiyonel PrP C dönüşüm: türler engelleri değerlendirmenin yanı sıra, CER deneyi de prion hastalığı biyoloji tanımlayan temel olay mekanizmaları araştırmak için bir basitleştirilmiş bir platform sağlayabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12% Bis-Tris SDS-PAGE gels | Life Technologies | NP0342 | |
| 0.5 mm Zirconium oxide beads | Next Advance | ZROB05 | Other varieties of beads are also effective |
| Antibodies | various suppliers | Select appropriate primary and secondary antibodies for immunoblot detection of PrPres from species of interest | |
| Bead homogenizer | Next Advance | BBY24M | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | 369434 | High speed with temperature control |
| Conical tubes | any brand | ||
| Cotton-tipped applicator | Uline | S-18991 | |
| Cuphorn sonicator | Heat Systems-Ultrasonics | W-380 | Heat Systems-Ultrasonics, Inc. is now Qsonica, LLC |
| Densitometry software program | UVP | Vision Works LS Image Acquisition and Analysis software | Other programs, such as NIH ImageJ, will also work |
| Dounce homogenizer | Kimble Chase | 885300 | |
| End-over-end mixer | Labnet International | H5600 | |
| Ethylenediaminetetra acetic acid | Boston Bioproducts | P-770 | Hazardous chemical: eye irritation |
| Guanidine hydrochloride, 8 M | Thermo Fisher Scientific | 24115 | Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye irritation |
| Heating block | Fisher Scientific | 11-718 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 435570 | Hazardous chemical: strong acid |
| Lithium dodecyl sulfate sample buffer, 4x | Life Technologies | NP0008 | Hazardous chemical: skin & respiratory irritation, serious eye damage, flammable solid |
| Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | Hazardous chemical: acute toxicity, flammable liquid |
| Microcentrifuge tubes | any brand | ||
| Mini-centrifuge | Labnet International | C1301 | |
| N-lauroyl-sarcosine (sarkosyl) | Sigma-Aldrich | L-5125 | Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye damage |
| Nonidet P-40 | Amresco | M158 | Hazardous chemical: skin irritation, eye damage |
| SDS-PAGE gel system | Life Technologies | NuPAGE electrophoresis system | Other SDS-PAGE systems will also work |
| PCR tubes (low-binding) | Axygen | PCR-02-L-C | |
| Pestle homogenizer | Fisher Scientific | 03-392-106 | |
| pH meter | Sentron | SI600 | |
| Polyvinyldifluoride membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Proteinase K | Promega | V3021 | Hazardous chemical: skin & eye irritation, respiratory sensitisation, organ toxicity |
| Reducing agent for SDS-PAGE samples, 10x | Life Technologies | NP0009 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | Hazardous chemical: acute toxicity |
| Sodium dodecyl sulfate | Thermo Fisher Scientific | 28364 | Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye damage, flammable solid |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | Hazardous chemical; strong base |
| Syringe | BD Biosciences | various | Use syringe size appropriate to volumes of substrate to be homogenized |
| Syringe needles | BD Biosciences | various | |
| Thermoshaker (PCR tube shaker) | Hangzhou All Sheng Instruments | MS-100 | |
| Tris base | Bio Basic | 77-86-1 | Hazardous chemical: skin, eye, respiratory irritation |
| Triton X-100 | Integra Chemical Company | T756.30.30 | Hazardous chemical: acute toxicity, eye irritation |
| Vortexer | Fisher Scientific | 12-812 |
References
- Colby, D. W., Prions Prusiner, S. B. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (1), a006833 (2011).
- Hill, A. F., Collinge, J. Prion strains and species barriers. Contrib Microbiol. 11, 33-49 (2004).
- Scott, M., et al. Transgenic mice expressing hamster prion protein produce species-specific scrapie infectivity and amyloid plaques. Cell. 59 (5), 847-857 (1989).
- Prusiner, S. B., et al. Transgenetic Studies Implicate Interactions between Homologous Prp Isoforms in Scrapie Prion Replication. Cell. 63, 673-686 (1990).
- Telling, G. C., et al. Prion Propagation in Mice Expressing Human and Chimeric Prp Transgenes Implicates the Interaction of Cellular Prp with Another Protein. Cell. 83, 79-90 (1995).
- Hill, A. F., et al. The same prion strain causes vCJD and BSE. Nature. 389 (6650), 448-450 (1997).
- Torres, J. M., et al. Elements modulating the prion species barrier and its passage consequences. PLoS One. 9 (3), e89722 (2014).
- Groschup, M. H., Buschmann, A. Rodent models for prion diseases. Vet Res. 39 (4), 32 (2008).
- Korth, C., et al. Abbreviated incubation times for human prions in mice expressing a chimeric mouse-human prion protein transgene. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (8), 4784-4789 (2003).
- Kocisko, D. A., et al. Species specificity in the cell-free conversion of prion protein to protease-resistant forms: a model for the scrapie species barrier. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (9), 3923-3927 (1995).
- Raymond, G. J., et al. Evidence of a molecular barrier limiting susceptibility of humans, cattle and sheep to chronic wasting disease. EMBO J. 19 (7), 4425-4430 (2000).
- Fernandez-Borges, N., de Castro, J., Castilla, J. In vitro studies of the transmission barrier. Prion. 3 (4), 220-223 (2009).
- Zou, W. Q., Cashman, N. R. Acidic pH and detergents enhance in vitro conversion of human brain PrPC to a PrPSc-like form. J Biol Chem. 277 (46), 43942-43947 (2002).
- Li, L., Coulthart, M. B., Balachandran, A., Chakrabartty, A., Cashman, N. R. Species barriers for chronic wasting disease by in vitro conversion of prion protein. Biochem Biophys Res Commun. 364 (4), 796-800 (2007).
- Morawski, A. R., Carlson, C. M., Chang, H., Johnson, C. J. In vitro prion protein conversion suggests risk of bighorn sheep (Ovis canadensis) to transmissible spongiform encephalopathies. BMC Vet Res. 9, 157 (2013).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page (2014).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot (2014).
- Chandler, R. L. Encephalopathy in mice produced by inoculation with scrapie brain material. Lancet. 1 (7191), 1378-1379 (1961).
- Browning, S. R., et al. Transmission of prions from mule deer and elk with chronic wasting disease to transgenic mice expressing cervid PrP. J Virol. 78 (23), 13345-13350 (2004).
- Hadlow, W. J., Race, R. E., Kennedy, R. C. Experimental infection of sheep and goats with transmissible mink encephalopathy virus. Can J Vet Res. 51 (1), 135-144 (1987).
- Rubenstein, R., et al. Immune surveillance and antigen conformation determines humoral immune response to the prion protein immunogen. J Neurovirol. 5 (4), 401-413 (1999).
- Castilla, J., et al. Crossing the species barrier by PrP(Sc) replication in vitro generates unique infectious prions. Cell. 134 (5), 757-768 (2008).
- Kubista, M., et al. The real-time polymerase chain reaction. Mol Aspects Med. 27, 95-125 (2006).
- Atarashi, R., Sano, K., Satoh, K., Nishida, N. Real-time quaking-induced conversion: a highly sensitive assay for prion detection. Prion. 5 (3), 150-153 (2011).
- Ladner-Keay, C. L., Griffith, B. J., Wishart, D. S. Shaking Alone Induces De Novo Conversion of Recombinant Prion Proteins to beta-Sheet Rich Oligomers and Fibrils. PLoS One. 9 (6), e98753 (2014).
- Mathiason, C. K., et al. Susceptibility of domestic cats to chronic wasting disease. J Virol. 87 (4), 1947-1956 (2013).
- Seelig, D. M., et al. Lesion Profiling and Subcellular Prion Localization of Cervid Chronic Wasting Disease in Domestic Cats. Vet Pathol. , (2014).
- Stewart, P., et al. Genetic predictions of prion disease susceptibility in carnivore species based on variability of the prion gene coding region. PLoS One. 7 (12), e50623 (2012).
- Russell, W. M., Burch, R. I. The Principles of Humane Experimental Technique. Metheun. , Methuen. (1959).
