Introduction
Encefalopatías espongiformes transmisibles (EET, enfermedades de priones) son un grupo de enfermedades neurodegenerativas fatales con periodos de incubación prolongados que afectan a una variedad de animales y seres humanos. El agente etiológico putativo de las EET se compone de un isómero mal plegada de la proteína priónica host (PrP) que es capaz de auto-propagación por conversión basado en plantillas de la forma celular normal de PrP (PrP C) en una, asociada a la enfermedad infecciosa forma (PrP TSE) que se acumula en los tejidos del sistema nervioso central del huésped infectado 1. Priones mamíferos infecciosas en general transmiten desde el host-a-host de una manera específica de la especie, lo que ha dado lugar al concepto de la "barrera de las especies TSE" limitar los eventos de transmisión entre especies 2. Los determinantes biológicos de la barrera de especies prión no se comprenden bien. Secuencia de aminoácidos similitud entre la infecciosa PrP TSE y el anfitrión PrP C cUna influencia fuertemente si la conversión tiene lugar 3-5, pero sigue siendo insuficiente para explicar todos los eventos de transmisión de priones observados in vivo 6,7.
Por lo tanto, la caracterización de las barreras de especies de EET se ha basado en gran medida en estudios de desafío de los animales: la exposición de los animales no tratados previamente de una especie dada a los priones de otro y midiendo el tiempo de incubación resultante de la aparición de la enfermedad y la tasa de ataque como indicadores de la eficacia de la transmisión. Los ratones que expresan PrP C a partir de especies heterólogas también se utilizan para este tipo de estudio 8. Los costos asociados a la producción de ratones transgénicos y bioensayos priónicas prolongadas, así como las consideraciones éticas del uso de los animales, son obstáculos para la investigación experimental de la EET barreras entre especies. Evaluación de la barrera de la especie humana a las EET se basa en ratones modificados para expresar humana PrP C. Estos ratones requieren largos períodos de incubación a sucumbir a las EET o modificaciones a T humanosél molécula PrP C humana de inicio rápido de la enfermedad 9. Los períodos de incubación de las EET no humana en estos ratones pueden extenderse más allá de la vida útil normal de ratón haciendo la interpretación de los resultados negativos desafiantes. Los primates no humanos también han sido utilizados como indicadores para el estudio de las barreras entre especies humanas, pero estos estudios están llenos de los mismos desafíos que otros tipos de experimentación con animales y primates no humanos pueden no recapitular precisamente la enfermedad a medida que avanza en el huésped humano.
Bioensayos animales siguen siendo el método "estándar de oro" para medir la susceptibilidad de una especie a dicha enfermedad, pero los obstáculos, los costos y la ética de estos estudios en animales vivos han obligado investigación sobre alternativas. Un número de ensayos in vitro, basados en la evaluación de la conversión de PrP C anfitrión a una proteinasa K (PK) estado resistentes (PrPres) cuando se sembró por PrP TSE, se han desarrollado y utilizado para investigar TSE spECIES barreras 10-12. Ejemplos de ensayos in vitro incluyen ensayos libres de células de conversión, la proteína misfolding amplificación cíclica (EPCP), y el ratio de eficiencia de conversión (CER) ensayo de 10-14. Aunque ninguno de estos ensayos tienen en cuenta los factores periféricos que intervienen en las barreras de especies después de la infección natural, todo puede ser útil para identificar hosts potencialmente susceptibles para las EET.
Aquí presentamos el protocolo para el ensayo CER, en el que dos desnaturalizados sustratos PrP C derivadas de homogeneizados cerebrales normales se utilizan en las principales reacciones de conversión del prión de banco (Figura 1) 13. PrP C en el sustrato desnaturalizado a pH 7,4 sólo se puede convertir en PrPres por PrP TSE se sembraron en la reacción en ausencia de una barrera de las especies 14. En contraste, la desnaturalización de PrP C en el otro sustrato a pH 3,5 permite que se convierte en PrP res después de la incubacióncon PrP TSE de cualquier especie y sirve como un control para la conversión. La relación de conversión de PrP C a PrP res en pH 7.4 sustrato con relación a la del sustrato pH 3.5 proporciona una medida de la barrera de especies. Hemos encontrado que el ensayo CER predice conoce barreras entre especies de ratones de laboratorio a diferentes EET y han utilizado el ensayo en los esfuerzos para predecir la barrera de las especies de numerosas especies de mamíferos, entre ellos el borrego cimarrón, a la caquexia crónica (CWD) y otras EET 14, 15. Los investigadores interesados en una herramienta que permite la detección rápida de la EET barreras entre especies o la evaluación de la conversión de PrP C -a-PrP res encontrarán esta metodología útil.
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Protocol
Trabajo Animal realizado en el Centro Nacional de Salud de la fauna de USGS fue realizado de acuerdo con la Oficina de NIH de directrices Laboratorio Animal Welfare y bajo cuidado de los animales institucional y el empleo protocolo # EP080716. Los tejidos de animales cazadores-cosechada fueron regalos de la Wisconsin o Michigan Departamentos de Recursos Naturales.
1. Preparación de la solución
NOTA: Las soluciones que se indican a continuación son necesarios para la preparación del sustrato de ensayo CER en la Sección 2 a continuación. Preparar cada una de estas soluciones de soluciones de concentración de valores más altos; concentraciones recomendadas para las soluciones madre se dan entre paréntesis después de cada nombre químico respectivo incluido. Preparar todas las soluciones frescas sobre la preparación del sustrato y se almacena a 4 ° C hasta su uso.
- Para tampón de lisis, preparar una solución de la siguiente en 10 mM Tris, pH 7,5 (Tris 1 M, pH 7,5 solución valores recomendados): 100 mM scloruro de odio (NaCl, 1 M de solución madre), ácido etilendiaminotetraacético 10 mM (EDTA, EDTA 500 mM, pH 8,0 solución stock), 0,5% NP-40 (solución madre 10%), 0,5% de desoxicolato (DOC, solución madre 10% ).
- Para tampón de conversión, preparar una solución de sulfato de 0,05% de dodecil de sodio (SDS, 10% de solución de stock) y 0,5% de Triton X-100 (solución al 10% de stock) en 1 salina tamponada con fosfato (PBS, 10, pH 7,4 solución madre).
- Para soluciones caotrópicas, preparar dos 3 M soluciones de clorhidrato de guanidina (GdnHCl, 8 M de valores) en 1x PBS (solución 10x). Ajustar el pH de una de las soluciones a 3,5 ± 0,05 con ácido clorhídrico concentrado (HCl). Comprobar que el pH de la segunda solución se mantiene a un pH de 7,4 ± 0,05 y ajustar usando HCl concentrado o hidróxido de sodio (NaOH) si es necesario.
2. Prepare pares CER ensayo de sustrato
- Obtener el tejido cerebral sano, no-TSE-infectado de especies de interés y preparar un volumen de peso-por-10%(W / v) de homogeneizado en tampón de lisis utilizando cualquiera de los siguientes métodos: Dounce, molino de bolas, o de homogeneización mortero y mano de mortero. Además refinar resultante homogeneizados sometiéndolos a homogeneización jeringa y aguja, el uso de agujas de calibre creciente hasta que el substrato puede ser aspirado y expulsado con facilidad a través de una aguja de la jeringa 27 G.
- Para sustratos preparados a partir de roedores y otros pequeños mamíferos, homogeneizar todo el cerebro (s); para sustratos preparados a partir de los mamíferos más grandes, use OBEX (tronco cerebral) para preparar los homogeneizados de tejido. Al seleccionar la cantidad de homogeneizado de cerebro, prepare no más de 50% de la capacidad de la centrífuga utilizada para la precipitación de proteínas en el paso 2.6.
- Si la calidad del tejido cerebral adquirido es cuestionable, evaluar los niveles de PrP C por SDS-PAGE e inmunoblot 16 17 antes de sustrato preparación.
- Divida homogeneizado de cerebro en dos volúmenes iguales en tubos cónicos de plástico etiquetadas separadas. Añadir GdnHCl (3 M soluciones en 1 PBS) a pH 3,5 o bien 7,4 a cada tubo en una proporción de 1: 1 volumen de homogeneizado de cerebro.
- Compruebe los valores de pH de las dos soluciones. Ajustar el pH de la pH 3,5 sustrato a pH ± 0,05 usando HCl concentrado. Asegúrese de que el pH de la otra sustrato se mantiene a un pH de 7,4 ± 0,05 y ajustar el pH si es necesario con HCl o NaOH según sea necesario. Evitar sobrepasar valores de pH mediante la adición juiciosa de ácido o base.
- Girar soluciones en un mezclador extremo sobre extremo a temperatura ambiente (RT) durante 5 h.
- Precipitado de proteína mediante la adición de cuatro volúmenes de metanol a las soluciones de sustrato en cada tubo cónico, vórtice para mezclar bien, y se incuba a -20 ° C durante 16-18 h.
- Las muestras de sedimentos por centrifugación a 13000 × g durante 30 min a 4 ° C. Decantar con cuidado y desechar el sobrenadante y dejar que el metanol se evapore de los pellets. Utilice bastoncillos de algodón para ayudar en la absorción de metanol aferrado a la parte interior del tubo. No permita bolitas a la sobre-dry, y una vez metanol ya no es visible, continúe con el siguiente paso.
- Bolitas de proteína Resuspender en tampón de conversión. Utilizar una cantidad de tampón de conversión igual a la cantidad de material de partida homogeneizado de cerebro dispensado en cada tubo en el paso 2.2.
NOTA: Es fundamental que el búfer de conversión utilizado para volver a suspender gránulos de proteína tanto de pH 3,5 y los preparativos de sustrato 7,4 tratados con la solución está definida en el paso 1.2 anterior (que contiene bajos niveles de detergentes y un pH fisiológico). - Soluciones brevemente con ultrasonidos sustrato en un aparato de ultrasonidos cuphorn (10 seg en ~ 30% de la potencia máxima), alícuota en 0,5 a 1,0 ml volúmenes de 1,5 ml tubos de microcentrífuga etiquetados. Realizar una inmunotransferencia de control de calidad (paso 2.9) en una parte alícuota de cada sustrato. Guarde otras alícuotas a -80 ° C hasta el momento de realizar el ensayo CER (Sección 4).
- Realizar el control de calidad en los pares de sustrato CER antes de su uso (Figura 2). Estos pasos aseguran que los sustratos CER provide óptimos resultados en los estudios de conversión.
- Asegurar cantidades comparables de PrP C en los dos sustratos. Comparar los niveles de PrP en el 10-25 l de cada sustrato por SDS-PAGE e inmunotransferencia 16 17. Si los niveles de proteína en el pH 7,4 y 3,5 son sustratos dentro de ~ 10% uno del otro, los pares de sustrato son apropiados para su uso en estudios de CER.
NOTA: Los inmunoblots PrP no deben mostrar evidencia de una extensa degradación PrP C. La inmunorreactividad de PrP debe ser principalmente> 20 kDa. Bandas de menos de esta masa molecular pueden ser productos de degradación. Patrones de bandas deben ser más o menos equivalente entre pares de sustrato. - A medida que la PrP C en ambos sustratos debe ser sensible PK, tratar 10-25 l de cada sustrato con PK a una concentración final de 100 mg / ml y digerir las muestras a 1000 rpm a 37 ° C durante 1 hora en el termo-agitador. Evaluar cualquier señal PrP restante por SDS-PAGE 16 y 17 de inmunotransferencia.Sustratos con PrP res no son apropiados para su uso en estudios de CER.
- Asegurar cantidades comparables de PrP C en los dos sustratos. Comparar los niveles de PrP en el 10-25 l de cada sustrato por SDS-PAGE e inmunotransferencia 16 17. Si los niveles de proteína en el pH 7,4 y 3,5 son sustratos dentro de ~ 10% uno del otro, los pares de sustrato son apropiados para su uso en estudios de CER.
3. Preparar Agente TSE Semillas
- Obtener el tejido cerebral infectado por el TSE a partir de especies de interés y preparar un 10% (w / v) de homogeneizado en 1X PBS pH 7,4 usando los métodos enumerados en el paso 2.1.
NOTA: Las semillas también podrían producirse a partir de otros tejidos infectados por el TSE fuera del sistema nervioso central, sin embargo, la eficiencia de la conversión de sustratos derivado del cerebro por semillas derivadas de tejidos periféricos infectadas por el TSE aún no se ha evaluado experimentalmente en la literatura publicada. - Alícuota resultante homogeneizado (s) en 100 a 300 volúmenes mu l en 0,5 ml tubos de microcentrífuga y se almacena a -80 ° C hasta el momento de realizar el ensayo CER.
Ensayo 4. CER
NOTA: El ensayo CER implica la adición de una cantidad relativamente pequeña de PrP TSE (siempre en la "semilla") de una especieen un exceso relativo de PrP C (proporcionado en el cerebro no infectada "sustrato") de otra especie que ha sido parcialmente desnaturalizadas, ya sea en pH 3,5 o 7,4. Tras un período de incubación prolongada agitación, la conversión basado en plantillas de PrP C en PrP TSE en cada reacción se evalúa la señal densitométrico de PrP res que queda después de la digestión PK y detección inmunoblot. La comparación de los niveles de PrP res en los sustratos previamente desnaturalizado a pH 3,5 vs. 7,4 proporciona una medida de la barrera de especies. Una visión general experimental de este procedimiento de ensayo se proporciona en la Figura 1.
- Lentamente se descongele pares de sustrato CER no infectadas (ensayo requiere volúmenes iguales de sustratos previamente desnaturalizado a ambos pH 3.5 y 7.4) y soluciones de semillas TSE-infectados por su inclusión en la parte superior de un lecho de hielo (aproximadamente 1 hr tiempo de descongelación).
- Una vez descongelado completamente, aspirado y luego expulsar a cada solución de sustrato a través de una27 G aguja de la jeringa varias veces para volver a homogeneizar. Tratar brevemente con ultrasonidos cada solución semilla infectada con TSE durante 10 segundos a ~ 30% de la potencia máxima. Mantenga todas las soluciones en hielo mientras se prepara reacciones de conversión.
- Label 5 tubos individuales bajos vinculantes, de paredes finas de PCR por agente de la EET están probando.
- Preparar reacciones de conversión en estos tubos mediante la adición de 5 l de solución de semilla infectada TSE-10% a 95 l de (a) sustrato CER preparados a pH 7,4 y (b) CER sustrato preparado a pH 3,5.
- Para cada muestra experimental, preparar reacciones paralelas en pares sustrato CER previamente desnaturalizado tanto a pH 3,5 y 7,4.
- Optimizar proporciones de semillas agente de la EET sustrato cerebral no infectada a través de la determinación empírica. Semilla común: relaciones de sustrato empleado mantener un volumen total de reacción de 100 l y l incluyen 1:99, 2:98 y 5:95 l l. Para la mayoría de aplicaciones, la semilla 5:95 l: relación de volumen de sustrato es apropiado y es lo que se presenta en ºes el protocolo.
- Preparar tres muestras de control por agente EET se ensayaron como sigue: (a) añadir 5 l de solución de semilla infectada TSE-10% a tampón de conversión de 95 l como control para la entrada de PrP res; añadir tampón de conversión de 5 l a 95 l de sustrato preparado en (b) pH 3,5 y (c) pH 7,4 como controles para la conversión no específica, no moldeado.
- En resumen vórtice cada muestra en su tubo de PCR cerrado para mezclar semillas y sustrato bien. Siga con un pulso momentáneo en una baja velocidad de banco mini-centrífuga para eliminar cualquier volumen de la mezcla de reacción atrapado en el tubo de la tapa PCR.
- Cargar las muestras en tubos de PCR individualmente etiquetados en un banco superior termo-agitador equipado para aceptar tubos de PCR. Agitar las muestras a 1.000 rpm a 37 ° C durante 24 horas.
- Después de agitación, añadir sarcosilo a una concentración final de 2% (w / v) y PK a una concentración final de 100 mg / ml. Muestras Digest en 1000 rpm a 37 ° C durante 1 hora en el termo-agitador.
NOTA: La adición de sarcosilo a muestras ayudas post-conversión en PK digestión de PrP C. Señales de falsos positivos en muestras no cabezas de serie (Paso 4.5) son virtualmente eliminados por adición de sarcosilo. - Añadir tampón de muestra de SDS-PAGE, las muestras de calor a 95 ° C durante 5 minutos y resolver restantes PrP res en cada muestra por SDS-PAGE seguido de inmunotransferencia 16 17.
NOTA: Después de la adición de tampón de muestra y calefacción, muestras podrá inmediatamente procesada o muestras se pueden almacenar a -20 ° C o -80 ° C antes de la inmunotransferencia. Todos los datos aquí presentados fueron generados usando los sistemas de gel y transferencia Novex NuPAGE. Las muestras individuales del ensayo de CER se trataron con tampón de muestra y el agente reductor de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Las muestras se calentaron a continuación a 95 ° C durante 5 min y 30 l de cada muestra se cargó en un 12% de bis-tris geles prefabricados. - Calcular el ratio de eficiencia de conversión (CER) como una medidade barrera de las especies. Medir los niveles de PrP res por densitometría 17 y dividen la densidad total de la muestra de pH 7,4 por la del pH 3.5 muestra. Multiplicar por 100 para producir un porcentaje.
- Recopilar datos de réplicas experimentales independientes para generar una media CER ± desviación estándar para una especie con un agente de la EET dado.
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Representative Results
El uso exitoso del ensayo CER es dependiente en gran medida de la calidad de los pares de sustrato utilizado en reacciones de conversión. Por esta razón, siguiendo los procedimientos para preparar pares sustrato CER, un inmunoblot de control de calidad debe llevarse a cabo (Figura 2). Para ambos sustratos, ensayo de 10-25 l por inmunotransferencia. PrP C debe ser fácilmente detectable en cada sustrato y los niveles de PrP C debe ser aproximadamente la misma entre los dos. Inmunoreactividad será principalmente visible por encima de 20 kDa, pero las bandas más pequeñas también puede ser evidente. En nuestra experiencia, la presencia de pequeñas bandas depende de la especie. Si se observan productos de menor peso molecular, su presencia debe ser confirmada en ambos pares de sustrato.
Es importante asegurarse de que los sustratos CER están libres de PrP res endógenos mediante el tratamiento de sustratos con PK (Figura 2). Si PrP res está presente, el animal utiliza para substpreparación tasa puede haber sido infectada por el TSE o infectados de forma subclínica. Alternativamente, la PrP C en el sustrato puede haber mal plegada a un estado resistente a PK durante los procedimientos de desnaturalización o de precipitación. Independientemente de la razón, el sustrato que contiene PrP res CER no es aceptable para uso en el ensayo de conversión.
Los ratones de laboratorio son uno de los animales experimentales más utilizadas en la investigación de las EET; como tal, su susceptibilidad a la mayoría de las EET es bien caracterizado 8, proporcionando un punto de referencia contra el cual in vivo para probar la fidelidad del ensayo CER. Figura 3A presenta los resultados de la conversión de ensayo CER de PrP C de ratón (cepa CD1) sustrato para PrP res por 1) la cepa RML de la tembladera de ratón-passaged, un agente adaptados para el anfitrión del ratón 18, 2) la tembladera ovina doméstica clásica, un agente que puede transmitir a los ratones después de un período de incubación largo 18, y 3) WHIvenado cola-te (Odocoileus virginianus) CWD y 263K cepa de scrapie de hámster-pases, los agentes a los que los ratones son mínimamente o no susceptibles 19,20. Resultantes niveles de PrP res fueron variables a través de sustratos ratón desnaturalizados a pH 7,4 y se sembraron con los distintos agentes de las EET mientras PrP res se encontró en todos los sustratos desnaturalizada a pH 3,5 y se sembró con un agente de la EET. Ratios de conversión que comparan los niveles de la PrP res en el pH de 7.4 y 3.5 sustratos se calculan de forma independiente por lo menos tres veces y los medios ± SD se muestra en la Figura 3B. Para las reacciones sembradas por RML, los coeficientes de conversión entre pH 7,4 y 3,5 sustratos fueron de aproximadamente 100%. Para aquellos sembrado por la tembladera, la conversión en el sustrato pH 7,4 fue de aproximadamente 75% de los que en el pH 3.5 sustrato. CWD o conversión inducida 263K-del sustrato pH 7.4 fue mínima. Un análisis unidireccional de la varianza no pudo distinguir una diferencia en las tasas de conversión de RML y scrapie o caquexia crónica y 263K, sin embargo las tasas de conversión de RML y la tembladera fueron significativamente diferentes de las de la caquexia crónica y 263K.
El ensayo CER puede ser adaptado para el uso con tejidos humanos o con las especies animales donde bioensayos son demasiado difícil o no, no se desea la producción ético y de ratón transgénico. Hemos estado utilizando este ensayo para caracterizar la susceptibilidad de diferentes especies de vida silvestre a la caquexia crónica. Como un ejemplo de la utilización de este ensayo, se presentan algunos resultados preliminares en la figura 4. Los cerebros de los linces del cazador-atrapado (Lynx rufus) resultaron todavía contienen niveles detectables de PrP C y productos de degradación PrP no eran extensas, lo que sugiere que estos tejidos podrían ser una fuente aceptable de sustrato CER (Figura 4A). Pares de sustrato generados a partir de lince cerebro mostraron PrP inmunoreactividad de un peso molecular apropiado y no contienen PrP res endógenos (Figura 4B). Cuando pares de sustrato CER bobcat generados a partir de dos animales distintos se incubaron con el mismo venado cola blanca agente CWD utilizado en el ensayo CER ratón descrito en la Figura 3, encontramos sustratos preparados a pH 7,4 habían niveles de PrP res en comparación con los sustratos preparados a pH 3.5 (Figura 4C), indicativo de una barrera de las especies mínima de lince PrP C a la conversión por la caquexia crónica. El CER para la conversión de venado cola blanca PrP C por el mismo CWD aislado de utilizar para convertir bobcat PrP C aquí, como control positivo, se había informado anteriormente como 95,2 ± 18,4% en Morawski et al. (2013) 15.
Figura 1:. Experimental visión general del ensayo CER dos sustratos de ensayo se preparan mediante la desnaturalización parcial PrP C en la no-tejido cerebral infectado por priones wsoluciones caotrópicos ITH, ya sea en pH 3,5 o pH 7,4. Los sustratos se siembran con PrP TSE de agente prión de interés y muestras experimentales se someten a 24 horas de incubación con agitación para permitir PrP C a la conversión de PrP TSE en tanto pH 3,5 y 7,4 sustratos. Después de la incubación, la conversión se evaluó por SDS-PAGE e inmunotransferencia. Densidades de señal son leídos por densitometría y el CER se calcula por la relación de pH 7,4 a pH 3,5 densidades de señal para cada muestra experimental.
Figura 2: Control de calidad de sustratos CER. (A) Antes de su uso en el ensayo CER, sustratos preparados de ratón, ya sea en pH 7.4 o 3.5 se ensayan mediante inmunotransferencia en ausencia de tratamiento PK 1) para evaluar el contenido de PrP C de cada par sustrato (niveles de PrP C deben ser equivalentes entre pH 7,4 y 3,5 Substra tes para su uso en el ensayo de CER) y 2) la presencia de PK (100 mg / ml) de tratamiento para la prueba de pre-existente PrP res en los tejidos utilizados para preparar sustratos (cualquier sustrato que muestran PrP res pre-existentes no son adecuados para su uso en el ensayo CER). (B) Para probar para la formación no específica PrP res durante el ensayo de conversión, los sustratos de ratón PrP C preparados en cualquiera de pH 7,4 o 3,5 se siembran con tampón de conversión, se agitó durante 24 horas a 1000 rpm, 37 ° C y, posteriormente, tratado-PK (100 g / ml) y se ensayó la PrPres por inmunotransferencia (derecha dos carriles). La no sacudido, sustratos ratón no PK tratados representan el contenido total de PrP C en reacciones de ensayo (izquierda dos carriles). Para (B), los carriles irrelevantes han sido recortadas para mayor claridad, pero cada panel de inmunotransferencia se deriva del mismo gel, la membrana y la exposición. Las inmunotransferencias en todos los paneles utilizados anticuerpo monoclonal SAF 83.
Figura 3:. Ensayo CER utilizando sustrato ratón de laboratorio sustrato de ensayo (A) del ratón CER preparado, ya sea en pH 7.4 o 3.5 se incubó con RML adaptada a ratón tembladera, ovejas tembladera clásica doméstica, el venado cola blanca caquexia crónica (CWD) o 263K cepa de scrapie de hámster-adaptado en el ensayo de CER. Las muestras de control (la etiqueta "ninguno") sólo contenían la misma cantidad de agente infeccioso y ningún sustrato ratón. Las muestras fueron analizadas para detectar la presencia de la proteína prión PK-resistente (PrP res) por inmunoblot con anticuerpo monoclonal SAF 83. primas valores densitométricos para cada muestra se muestran debajo de cada carril. (B) Gráfico de barras que indica las razones promedio (± desviación estándar) entre pH 7,4 y 3,5 sustratos de ratón para cada agente infeccioso basado en al menos 3 carreras de ensayo independientes. Letras minúsculas se refieren a estadísticamentesubconjuntos homogéneos (análisis de varianza con el método de Tukey-Kramer diferencias de significación mínimo; p <0,05). Esta cifra ha sido modificado desde Morawski et al., 2013 15.
Figura 4: Ejemplo de uso de ensayo de CER para investigar la susceptibilidad lince para CWD Bobcat homogeneizado de cerebro (A) y sustrato de ensayo CER (B) se ensayó mediante inmunotransferencia en ausencia y presencia de PK (100 g / ml) para evaluar existente PrP C. los niveles y la presencia de PrP res pre-existentes, respectivamente. (C) sustratos Bobcat se sembraron con tampón de conversión y se ensayaron en el ensayo de CER para evaluar la formación no específica PrP res (dejaron dos carriles). La no sacudido, sustratos bobcat no PK tratados representan el contenido total de PrP C en reacciones de ensayo (derecha dos carriles).Sustrato (D) Bobcat preparado, ya sea en pH 7.4 o 3.5 se incubó con cola blanca ciervos CWD utilizando el ensayo de CER. La muestra de control (con la etiqueta "ninguno") contenía la misma cantidad de agente de la caquexia crónica, pero sin sustrato lince. Se muestran debajo de cada carril valores densitométricos primas para cada muestra. Las inmunotransferencias en todos los paneles de anticuerpo monoclonal 3F4 utilizado, que reacciona con la proteína priónica felino 21.
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Discussion
Para completar con éxito de este protocolo, se debe prestar atención a los niveles de PrP C en el tejido cerebral infectado utilizado para la preparación del sustrato (paso 2.1.2) y la semilla al sustrato ratio para reacciones de conversión (paso 4.4.2). En nuestra experiencia, los cerebros pueden ser extraídos para su uso como sustrato CER luego de un período sustancial post-mortem, siempre que la PrP C está presente por inmunotransferencia (Figura 4). De hecho, algunos autolisis se observó en los cerebros de los linces utilizados para estudios CER. Sin embargo, la incubación de sustratos derivados de estos cerebros aún resultó en la formación de PrP res. Especulamos que, en parte, la robustez del ensayo de CER se deriva de la desnaturalización de sustratos CER en 1,5 M GdnHCl, que inactivará muchas proteasas.
Semilla al sustrato relaciones puede necesitar ser determinado empíricamente para obtener señal aceptable PrP res por inmunotransferencia. Demasiado o muy lPrP res poco caras para realizar la densitometría, alto niveles de fondo PrP res en las muestras de control que carece de sustrato y ratios de conversión inconsistentes son todas razones para optimizar la semilla: proporciones de sustrato. Variaciones mantener un volumen total de reacción de 100 l y l incluyen 1:99, 2:98 y 5:95 l l. En casi todas las ocasiones, hemos encontrado que 5:95 l de semillas: relación de volumen de sustrato es óptima. No importa qué proporción se emplea, se utilizan las mismas cantidades de agente de la EET y el ensayo es internamente consistente. Sin embargo, la concentración de semilla de homogeneizado de cerebro de priones infectados utilizado para reacciones de plantilla probablemente afecta el resultado del ensayo de CER en que los títulos o diluciones de semillas diferentes podría dar lugar a niveles de conversión de PrP C -a-PrP res variable. Este efecto ha sido demostrado en otros en ensayos de 22 de conversión de priones in vitro y puede complicar la comparación de los diferentes aislamientos de prión. Para abordar esta en el ensayo de CER, semillas de cOuld titularse en cada sustrato PrP C preparado a pH 3.5 y 7.4 para identificar una serie de diluciones esa plantilla conversión PrP C. Diluciones de semillas Ideal evitar saturar la solución con priones exceso de semillas y sin embargo proporcionan información sobre la sensibilidad de la reacción de conversión. Alternativamente, la conversión de PrP C -a-PrP res en reacciones de ensayo CER podría medirse al múltiple, puntos de tiempo regulares durante toda la duración del ensayo y se representa como de tasa de conversión curvas, similar a las lecturas de la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real ( qPCR) 23 y temblando conversión inducida (RT-QuIC) 24 ensayos en tiempo real. Tales lecturas podrían permitir interpretaciones más amplias de las barreras entre especies y son un foco interesante de desarrollo futuro de esta metodología.
En el protocolo presentado aquí, usamos tubos bajos de unión, de paredes finas de PCR, pero también hemos utilizado estándar tubos de 1,5 ml en un termo-agitador equipado paraeste tipo de tubo. No se necesitan otras variaciones en el protocolo a utilizar los tubos de mayor tamaño. En nuestra experiencia, sin embargo, hemos tenido una producción más PrP res y resultados más reproducibles en tubos bajos vinculante de PCR en comparación con los tubos de 1,5 ml. Mientras explicaciones para la mejora del rendimiento del ensayo en tubos de PCR son sólo especulativo en este momento, en base a los resultados que indican que la interfase aire-agua es fundamental para la PrP fibrillization 25, que postula que los tubos más pequeños proporcionan una tensión superficial más óptimo para PrP conversión.
Tal vez la principal limitación para el uso del ensayo CER está en entender qué ratios de conversión representan en términos de in vivo barreras de las especies determinantes, como la penetrancia de la enfermedad o la duración del período de incubación. Aunque actualmente se desconoce, la traducción entre in vitro e in vivo factores barrera de las especies debería ser más clara con el uso continuo del ensayo CER en las pruebas Additional EET barreras entre especies que ya han sido establecidos en vivo y le ayudarán a calificar los resultados de las especies en las que no se dispone de datos de bioensayo. Una ventaja del ensayo de CER en comparación con EPCP es la presencia de un control interno para la conversión de PrP, es decir, el sustrato pH 3,5, que se puede convertir por cualquier agente EET. Este control es de valor cuando no está claro que, en su caso, los agentes de EET deberían causar mal plegamiento de de un host exótico PrP C. La incapacidad de un sustrato determinado host para amplificar un agente específico EET en EPCP podría interpretarse como evidencia de una barrera de las especies o podría ser debido a fallas técnicas. Desventajas del ensayo CER en comparación con EPCP incluyen amplificación de PrP res, pasos adicionales en la preparación del sustrato CER y no infectividad conocida en las PrP res producidos por reacciones CER limitados. Es de señalar que en un estudio previo, sin embargo, encontramos el ensayo CER dio lugar a un patrón similar de PrP res formación como la de EPCP 15. Los resultados presentados aquí indican también que el ensayo CER predice correctamente las barreras entre especies para la transmisión de las EET a varios ratones de laboratorio (Figura 3) y sugieren que los linces pueden tener susceptibilidad a la caquexia crónica (Figura 4), de acuerdo con informes de que los gatos domésticos (Felis Felis) puede adquirir la enfermedad priónica después del desafío CWD experimental 26,27. Los estudios que utilizan el ensayo CER podrían complementar los esfuerzos de secuenciación de PrP de entender la susceptibilidad de vida silvestre para la caquexia crónica 28.
El ensayo CER permite una rápida y de bajo costo, evaluación fiable de las barreras entre especies EET in vitro. Aunque no es un reemplazo completo para el "estándar de oro" de bioensayo animal, el ensayo CER se puede utilizar como una evaluación inicial de la existencia de una barrera de las especies EET que pueden justificar o prevenir nuevos estudios en animales vivos. Por esta razón, y debido a que el ensayo se basa sóloen el tejido cerebral que se puede adquirir a partir de animales no experimentales, el CER está en consonancia con los esfuerzos para reemplazar, reducir y refinar los procedimientos experimentales con animales 29. Además de evaluar las barreras entre especies, el ensayo CER también puede proporcionar una plataforma simplificada con el que investigar los mecanismos del acontecimiento fundamental definir la biología de la enfermedad por priones: la conversión de lo normal, funcional PrP C a una forma mal plegada.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12% Bis-Tris SDS-PAGE gels | Life Technologies | NP0342 | |
| 0.5 mm Zirconium oxide beads | Next Advance | ZROB05 | Other varieties of beads are also effective |
| Antibodies | various suppliers | Select appropriate primary and secondary antibodies for immunoblot detection of PrPres from species of interest | |
| Bead homogenizer | Next Advance | BBY24M | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | 369434 | High speed with temperature control |
| Conical tubes | any brand | ||
| Cotton-tipped applicator | Uline | S-18991 | |
| Cuphorn sonicator | Heat Systems-Ultrasonics | W-380 | Heat Systems-Ultrasonics, Inc. is now Qsonica, LLC |
| Densitometry software program | UVP | Vision Works LS Image Acquisition and Analysis software | Other programs, such as NIH ImageJ, will also work |
| Dounce homogenizer | Kimble Chase | 885300 | |
| End-over-end mixer | Labnet International | H5600 | |
| Ethylenediaminetetra acetic acid | Boston Bioproducts | P-770 | Hazardous chemical: eye irritation |
| Guanidine hydrochloride, 8 M | Thermo Fisher Scientific | 24115 | Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye irritation |
| Heating block | Fisher Scientific | 11-718 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 435570 | Hazardous chemical: strong acid |
| Lithium dodecyl sulfate sample buffer, 4x | Life Technologies | NP0008 | Hazardous chemical: skin & respiratory irritation, serious eye damage, flammable solid |
| Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | Hazardous chemical: acute toxicity, flammable liquid |
| Microcentrifuge tubes | any brand | ||
| Mini-centrifuge | Labnet International | C1301 | |
| N-lauroyl-sarcosine (sarkosyl) | Sigma-Aldrich | L-5125 | Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye damage |
| Nonidet P-40 | Amresco | M158 | Hazardous chemical: skin irritation, eye damage |
| SDS-PAGE gel system | Life Technologies | NuPAGE electrophoresis system | Other SDS-PAGE systems will also work |
| PCR tubes (low-binding) | Axygen | PCR-02-L-C | |
| Pestle homogenizer | Fisher Scientific | 03-392-106 | |
| pH meter | Sentron | SI600 | |
| Polyvinyldifluoride membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Proteinase K | Promega | V3021 | Hazardous chemical: skin & eye irritation, respiratory sensitisation, organ toxicity |
| Reducing agent for SDS-PAGE samples, 10x | Life Technologies | NP0009 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | Hazardous chemical: acute toxicity |
| Sodium dodecyl sulfate | Thermo Fisher Scientific | 28364 | Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye damage, flammable solid |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | Hazardous chemical; strong base |
| Syringe | BD Biosciences | various | Use syringe size appropriate to volumes of substrate to be homogenized |
| Syringe needles | BD Biosciences | various | |
| Thermoshaker (PCR tube shaker) | Hangzhou All Sheng Instruments | MS-100 | |
| Tris base | Bio Basic | 77-86-1 | Hazardous chemical: skin, eye, respiratory irritation |
| Triton X-100 | Integra Chemical Company | T756.30.30 | Hazardous chemical: acute toxicity, eye irritation |
| Vortexer | Fisher Scientific | 12-812 |
References
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