تقييم المنقولة جنون الأنواع دماغي الحواجز مع<em> في المختبر</em> بريون تحويل البروتين الفحص
Summary
Measuring the barrier to the interspecies transmission of prion diseases is challenging and typically involves animal challenges or biochemical assays. Here, we present an in vitro prion protein conversion assay with the ability to predict species barriers.
Abstract
Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they typically rely upon lengthy and costly in vivo animal challenge studies. A number of in vitro assays have been developed to aid in measuring prion species barriers, thereby reducing animal use and providing quicker results than animal bioassays. Here, we present the protocol for a rapid in vitro prion conversion assay called the conversion efficiency ratio (CER) assay. In this assay cellular prion protein (PrPC) from an uninfected host brain is denatured at both pH 7.4 and 3.5 to produce two substrates. When the pH 7.4 substrate is incubated with TSE agent, the amount of PrPC that converts to a proteinase K (PK)-resistant state is modulated by the original host’s species barrier to the TSE agent. In contrast, PrPC in the pH 3.5 substrate is misfolded by any TSE agent. By comparing the amount of PK-resistant prion protein in the two substrates, an assessment of the host’s species barrier can be made. We show that the CER assay correctly predicts known prion species barriers of laboratory mice and, as an example, show some preliminary results suggesting that bobcats (Lynx rufus) may be susceptible to white-tailed deer (Odocoileus virginianus) chronic wasting disease agent.
Introduction
الاعتلال الإسفنجي للانتقال (TSEs، وأمراض بريون) هي مجموعة من الأمراض العصبية القاتلة مع فترات الحضانة الطويلة التي تؤثر على مجموعة متنوعة من الحيوانات والبشر. وتتألف العامل المسبب للمرض من المفترض TSEs من أيزومر تتجمع من بروتين بريون المضيف (بي ار بي) التي هي قادرة على التكاثر الذاتي التي يحركها قالب تحويل شكل الخلوي الطبيعي للبي ار بي (بي ار بي C) إلى معدية، ويرتبط مرض شكل (بي ار بي TSE) التي تتراكم في أنسجة الجهاز العصبي المركزي للمضيف المصاب 1. البريونات المعدية نقل الثدييات عموما من المضيف إلى المضيف بطريقة أنواع محددة، والتي أدت إلى مفهوم "الحواجز القائمة بين الأنواع بورصة طوكيو" الحد من انتقال الأحداث بين الأنواع 2. ليست مفهومة جيدا المحددات البيولوجية للالحواجز القائمة بين الأنواع بريون. الأحماض الأمينية تشابه تسلسل بين المعدية بي ار بي بورصة طوكيو والمضيف بي ار بي C جوتؤثر بقوة سواء التحويل يأخذ مكان 3-5، ولكن لا يزال غير كاف لتفسير كل الأحداث انتقال بريون لوحظ في الجسم الحي 6،7.
وبالتالي، فقد اعتمد توصيف حواجز الأنواع بورصة طوكيو إلى حد كبير على دراسات التحدي الحيوان: تعريض الحيوانات ساذجة من نوع معين لالبريونات من آخر وقياس الناتجة فترة حضانة ظهور المرض ومعدل الهجوم كمؤشرات للكفاءة الإرسال. وتستخدم أيضا الفئران معربا عن بي ار بي C من الأنواع مغاير لهذا النوع من الدراسة 8. التكاليف المرتبطة بإنتاج المعدلة وراثيا الماوس واختبارات بيولوجية بريون التي طال أمدها، فضلا عن الاعتبارات الأخلاقية للاستخدام الحيواني، هي العقبات التي تحول دون تحقيق التجريبي الحواجز الأنواع بورصة طوكيو. تقييم الحواجز القائمة بين الأنواع البشرية لTSEs يعتمد على الفئران المهندسة للتعبير عن الإنسان بي ار بي C. هذه الفئران تتطلب فترات حضانة طويلة الرضوخ لTSEs الإنسان أو تعديلات على رانه البشري جزيء بي ار بي C لبدء المرض السريع 9. فترات حضانة TSEs غير البشرية في هذه الفئران قد تمتد إلى ما بعد عمر الفأر العادي مما يجعل تفسير النتائج السلبية الصعبة. كما استخدمت الرئيسيات غير البشرية كوكلاء لدراسة حواجز الجنس البشري، ولكن هذه الدراسات لا محفوف نفس التحديات التي تواجهها أنواع أخرى من التجارب على الحيوانات والرئيسيات غير البشرية قد لا ألخص بالضبط المرض لأنها تسير في الإنسان المضيف.
لا تزال اختبارات بيولوجية الحيوان "المعيار الذهبي" طريقة لقياس قابلية الأنواع إلى بورصة طوكيو، ولكن أجبرت العقبات والتكاليف والأخلاق من هذه الدراسات على الحيوانات الحية التحقيق في البدائل. وهناك عدد من فحوصات في المختبر، استنادا إلى تقييم تحويل المضيفة بي ار بي C إلى بروتين K (PK) دولة مقاوم لل(احتياط PRP) عند المصنف من قبل بي ار بي بورصة طوكيو، وقد وضعت واستخدامها لتحقيق TSE SPecies الحواجز 10-12. أمثلة لفحوصات في المختبر وتشمل فحوصات خالية من الخلايا التحويل، البروتين misfolding التضخيم دوري (PMCA)، ونسبة كفاءة التحويل (CER) فحص 10-14. في حين أن أيا من هذه المقايسات تأخذ في الاعتبار العوامل المحيطية المشتركة في حواجز الأنواع بعد العدوى الطبيعية، وكلها يمكن أن تكون مفيدة لتحديد المضيفين يحتمل أن تكون عرضة للTSEs.
هنا نقدم بروتوكول للمقايسة CER، التي تستخدم اثنين من التشويه والتحريف ركائز بي ار بي C المستمدة من الخليط المخ المعتادة في مقاعد البدلاء الأعلى ردود الفعل تحويل بريون (الشكل 1) 13. بي ار بي C في الركيزة التشويه والتحريف في درجة الحموضة 7.4 لا يمكن تحويلها إلى الدقة PRP التي كتبها بي ار بي TSE المصنفة في رد الفعل في حالة عدم وجود الحواجز القائمة بين الأنواع 14. في المقابل، تمسخ من بي ار بي C في الركيزة الأخرى في درجة الحموضة 3.5 يسمح ليتم تحويلها إلى بي ار بي الدقة حضانة التاليةمع بي ار بي TSE من أي نوع من الأنواع وبمثابة الرقابة على التحويل. فإن نسبة التحويل من بي ار بي C إلى الدقة PRP في درجة الحموضة 7.4 الركيزة نسبة إلى أن الركيزة درجة الحموضة 3.5 يوفر قدرا من الحواجز القائمة بين الأنواع. لقد وجدنا أن الفحص CER يتنبأ يعرف الحواجز الأنواع من الفئران المخبرية لمختلف TSEs واستخدمت مقايسة في الجهود الرامية إلى التنبؤ الحواجز القائمة بين الأنواع العديد من أنواع الثدييات، بما في ذلك كبش الجبال الصخرية، إلى مرض الهزال المزمن (CWD) وغيرها من TSEs 14، 15. المحققون ترغب في أداة السماح الفحص السريع للحواجز الأنواع TSE أو تقييم تحويل بي ار بي C -to-بي ار بي احتياط سوف تجد هذه المنهجية مفيدة.
Protocol
Representative Results
Discussion
لالانتهاء بنجاح من هذا البروتوكول، ينبغي إيلاء الاهتمام لمستويات بي ار بي C في غير المصابة أنسجة المخ تستخدم لإعداد الركيزة (الخطوة 2.1.2) والبذور إلى الركيزة نسبة للتفاعلات التحويل (الخطوة 4.4.2). في تجربتنا، والعقول يمكن استخراجها لاستخدامها بوصفها الركيزة CER بعد …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank John Olsen (Wisconsin Department of Natural Resources), Tom Cooley, Daniel O’Brien and Steve Schmitt (Michigan Department of Natural Resources) and Dr. Daniel Walsh (USGS National Wildlife Health Center) for assistance with tissue acquisition. We also thank the Wisconsin State Laboratory of Hygiene for diagnostic testing services, and Dr. Tonie Rocke and her staff (USGS National Wildlife Health Center) for use of equipment. Any use of trade, product, or firm names is for descriptive purposes only and does not imply endorsement by the U.S. Government.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 12% Bis-Tris SDS-PAGE gels | Life Technologies | NP0342 | |
| 0.5 mm zirconium oxide beads | Next Advance | ZROB05 | Other varieties of beads are also effective |
| Antibodies | various suppliers | Select appropriate primary and secondary antibodies for immunoblot detection of PrPres from species of interest | |
| Bead homogenizer | Next Advance | BBY24M | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | 369434 | High speed with temperature control |
| Conical tubes | any brand | ||
| Cotton-tipped applicator | Uline | S-18991 | |
| Cuphorn sonicator | Heat Systems-Ultrasonics | W-380 | Heat Systems-Ultrasonics, Inc. is now Qsonica, LLC |
| Densitometry software program | UVP | Vision Works LS Image Acquisition and Analysis software | Other programs, such as NIH ImageJ, will also work |
| Dounce homogenizer | Kimble Chase | 885300 | |
| End-over-end mixer | Labnet International | H5600 | |
| Ethylenediaminetetra acetic acid | Boston Bioproducts | P-770 | Hazardous chemical: eye irritation |
| Guanidine hydrochloride, 8M | Thermo Fisher Scientific | 24115 | Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye irritation |
| Heating block | Fisher Scientific | 11-718 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 435570 | Hazardous chemical: strong acid |
| Lithium dodecyl sulfate sample buffer, 4X | Life Technologies | NP0008 | Hazardous chemical: skin & respiratory irritation, serious eye damage, flammable solid |
| Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | Hazardous chemical: acute toxicity, flammable liquid |
| Microcentrifuge tubes | any brand | ||
| Mini-centrifuge | Labnet International | C1301 | |
| N-lauroyl-sarcosine (sarkosyl) | Sigma-Aldrich | L-5125 | Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye damage |
| Nonidet P-40 | Amresco | M158 | Hazardous chemical: skin irritation, eye damage |
| SDS-PAGE gel system | Life Technologies | NuPAGE electrophoresis system | Other SDS-PAGE systems will also work |
| PCR tubes (low-binding) | Axygen | PCR-02-L-C | |
| Pestle homogenizer | Fisher Scientific | 03-392-106 | |
| pH meter | Sentron | SI600 | |
| Polyvinyldifluoride membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Proteinase K | Promega | V3021 | Hazardous chemical: skin & eye irritation, respiratory sensitisation, organ toxicity |
| Reducing agent for SDS-PAGE samples, 10X | Life Technologies | NP0009 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | Hazardous chemical: acute toxicity |
| Sodium dodecyl sulfate | Thermo Fisher Scientific | 28364 | Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye damage, flammable solid |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | Hazardous chemica; strong base |
| Syringe | BD Biosciences | various | Use syringe size appropriate to volumes of substrate to be homogenized |
| Syringe needles | BD Biosciences | various | |
| Thermoshaker (PCR tube shaker) | Hangzhou All Sheng Instruments | MS-100 | |
| Tris base | Bio Basic | 77-86-1 | Hazardous chemical: skin, eye, respiratory irritation |
| Triton X-100 | Integra Chemical Company | T756.30.30 | Hazardous chemical: acute toxicity, eye irritation |
| Vortexer | Fisher Scientific | 12-812 |
References
- Colby, D. W., Prions Prusiner, S. B. . Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (1), a006833 (2011).
- Hill, A. F., Collinge, J. Prion strains and species barriers. Contrib Microbiol. 11, 33-49 (2004).
- Scott, M., et al. Transgenic mice expressing hamster prion protein produce species-specific scrapie infectivity and amyloid plaques. Cell. 59 (5), 847-857 (1989).
- Prusiner, S. B., et al. Transgenetic Studies Implicate Interactions between Homologous Prp Isoforms in Scrapie Prion Replication. Cell. 63, 673-686 (1990).
- Telling, G. C., et al. Prion Propagation in Mice Expressing Human and Chimeric Prp Transgenes Implicates the Interaction of Cellular Prp with Another Protein. Cell. 83, 79-90 (1995).
- Hill, A. F., et al. The same prion strain causes vCJD and BSE. Nature. 389 (6650), 448-450 (1997).
- Torres, J. M., et al. Elements modulating the prion species barrier and its passage consequences. PLoS One. 9 (3), e89722 (2014).
- Groschup, M. H., Buschmann, A. Rodent models for prion diseases. Vet Res. 39 (4), 32 (2008).
- Korth, C., et al. Abbreviated incubation times for human prions in mice expressing a chimeric mouse-human prion protein transgene. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (8), 4784-4789 (2003).
- Kocisko, D. A., et al. Species specificity in the cell-free conversion of prion protein to protease-resistant forms: a model for the scrapie species barrier. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (9), 3923-3927 (1995).
- Raymond, G. J., et al. Evidence of a molecular barrier limiting susceptibility of humans, cattle and sheep to chronic wasting disease. EMBO J. 19 (7), 4425-4430 (2000).
- Fernandez-Borges, N., de Castro, J., Castilla, J. In vitro studies of the transmission barrier. Prion. 3 (4), 220-223 (2009).
- Zou, W. Q., Cashman, N. R. Acidic pH and detergents enhance in vitro conversion of human brain PrPC to a PrPSc-like form. J Biol Chem. 277 (46), 43942-43947 (2002).
- Li, L., Coulthart, M. B., Balachandran, A., Chakrabartty, A., Cashman, N. R. Species barriers for chronic wasting disease by in vitro conversion of prion protein. Biochem Biophys Res Commun. 364 (4), 796-800 (2007).
- Morawski, A. R., Carlson, C. M., Chang, H., Johnson, C. J. In vitro prion protein conversion suggests risk of bighorn sheep (Ovis canadensis) to transmissible spongiform encephalopathies. BMC Vet Res. 9, 157 (2013).
- Chandler, R. L. Encephalopathy in mice produced by inoculation with scrapie brain material. Lancet. 1 (7191), 1378-1379 (1961).
- Browning, S. R., et al. Transmission of prions from mule deer and elk with chronic wasting disease to transgenic mice expressing cervid PrP. J Virol. 78 (23), 13345-13350 (2004).
- Hadlow, W. J., Race, R. E., Kennedy, R. C. Experimental infection of sheep and goats with transmissible mink encephalopathy virus. Can J Vet Res. 51 (1), 135-144 (1987).
- Rubenstein, R., et al. Immune surveillance and antigen conformation determines humoral immune response to the prion protein immunogen. J Neurovirol. 5 (4), 401-413 (1999).
- Castilla, J., et al. Crossing the species barrier by PrP(Sc) replication in vitro generates unique infectious prions. Cell. 134 (5), 757-768 (2008).
- Kubista, M., et al. The real-time polymerase chain reaction. Mol Aspects Med. 27, 95-125 (2006).
- Atarashi, R., Sano, K., Satoh, K., Nishida, N. Real-time quaking-induced conversion: a highly sensitive assay for prion detection. Prion. 5 (3), 150-153 (2011).
- Ladner-Keay, C. L., Griffith, B. J., Wishart, D. S. Shaking Alone Induces De Novo Conversion of Recombinant Prion Proteins to beta-Sheet Rich Oligomers and Fibrils. PLoS One. 9 (6), e98753 (2014).
- Mathiason, C. K., et al. Susceptibility of domestic cats to chronic wasting disease. J Virol. 87 (4), 1947-1956 (2013).
- Seelig, D. M., et al. Lesion Profiling and Subcellular Prion Localization of Cervid Chronic Wasting Disease in Domestic Cats. Vet Pathol. , (2014).
- Stewart, P., et al. Genetic predictions of prion disease susceptibility in carnivore species based on variability of the prion gene coding region. PLoS One. 7 (12), e50623 (2012).
- Russell, W. M., Burch, R. I. . The Principles of Humane Experimental Technique. Metheun. , (1959).
