Het beoordelen van overdraagbare spongiforme encefalopathie Soort Barrières met een<em> In Vitro</em> Prioneiwit Conversie Assay
Summary
Measuring the barrier to the interspecies transmission of prion diseases is challenging and typically involves animal challenges or biochemical assays. Here, we present an in vitro prion protein conversion assay with the ability to predict species barriers.
Abstract
Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they typically rely upon lengthy and costly in vivo animal challenge studies. A number of in vitro assays have been developed to aid in measuring prion species barriers, thereby reducing animal use and providing quicker results than animal bioassays. Here, we present the protocol for a rapid in vitro prion conversion assay called the conversion efficiency ratio (CER) assay. In this assay cellular prion protein (PrPC) from an uninfected host brain is denatured at both pH 7.4 and 3.5 to produce two substrates. When the pH 7.4 substrate is incubated with TSE agent, the amount of PrPC that converts to a proteinase K (PK)-resistant state is modulated by the original host’s species barrier to the TSE agent. In contrast, PrPC in the pH 3.5 substrate is misfolded by any TSE agent. By comparing the amount of PK-resistant prion protein in the two substrates, an assessment of the host’s species barrier can be made. We show that the CER assay correctly predicts known prion species barriers of laboratory mice and, as an example, show some preliminary results suggesting that bobcats (Lynx rufus) may be susceptible to white-tailed deer (Odocoileus virginianus) chronic wasting disease agent.
Introduction
Overdraagbare spongiforme encefalopathieën (TSE's, prionziekten) zijn een groep van fatale neurodegeneratieve ziekten met uitgebreide incubatie periodes die een verscheidenheid aan dieren en mensen beïnvloeden. De vermeende etiologische agens van TSE bestaat uit een verkeerd gevouwen isomeer van de gastheer prioneiwit (PrP), dat in staat is zichzelf voortplant sjabloongerichte omzetting van de normale cellulaire vorm van PrP (PrP C) in een besmettelijke, ziekte-geassocieerde vorm (PrP TSE) dat zich ophoopt in het centrale zenuwstelsel weefsels van de geïnfecteerde gastheer 1. Besmettelijke zoogdieren prionen algemeen uitzenden van host-to-host in een soort-specifieke manier, die aanleiding heeft gegeven tot het concept van de "TSE soort barrière" het beperken van interspecies transmissie gebeurtenissen 2. De biologische determinanten van het prion soort barrière zijn niet goed begrepen. Aminozuurvolgorde gelijkenis tussen de besmettelijke PrP TSE en de gastheer PrP C ceen sterke invloed op de vraag of conversie plaatsvindt 3-5, maar blijft onvoldoende om alle prion transmissie gebeurtenissen waargenomen in vivo 6,7 verklaren.
Zo heeft de karakterisering van TSE soorten barrières grotendeels ingeroepen dier challenge studies: blootstellen naïeve dieren van een bepaalde soort te prionen van een ander en het meten van de resulterende incubatietijd van de ziekte ontstaan en de attack rate als indicatoren van de transmissie-efficiëntie. Muizen die PrP C van heterologe species worden ook gebruikt voor dit type onderzoek 8. De kosten in verband met transgene muis productie en langdurige prion bioassays, evenals ethische overwegingen van het gebruik van dieren, zijn belemmeringen voor experimenteel onderzoek van TSE soorten barrières. Beoordeling van de menselijke soort barrière voor TSE's is gebaseerd op gemanipuleerde muizen met menselijke PrP C te drukken. Deze muizen vereisen lange incubatieperiode te bezwijken voor de menselijke TSE of aanpassingen aan tHet menselijke PrP C molecule voor snelle ziektebegin 9. Incubatieperiode van de niet-menselijke TSE's bij deze muizen kunnen buiten de normale muis levensduur waardoor interpretatie van negatieve resultaten uitdagend. Niet-menselijke primaten zijn ook gebruikt als proxies voor het bestuderen soortbarrières mens, maar deze studies zijn beladen met dezelfde problemen als andere soorten dierproeven en niet-menselijke primaten niet precies ziekte herhalen terwijl het zich in de menselijke gastheer.
Animal bioassays blijven de "gouden standaard" methode voor het meten van de gevoeligheid van een soort van een TSE, maar de obstakels, kosten en ethische deze levende dierstudies onderzoek naar alternatieven gedwongen. Een aantal in vitro assays, gebaseerd op de beoordeling van de omzetting van PrP c gastheer een proteïnase K (PK) resistente toestand (PrP res) na enting van PrP TSE, ontwikkeld en gebruikt om TSE species barrières 10-12. Voorbeelden van in vitro assays omvatten celvrije conversie testen eiwit misfolding cyclische amplificatie (PMCA) en de conversie efficiency ratio (CER) test 10-14. Hoewel geen van deze tests rekening worden gehouden met betrokken bij soorten barrières na natuurlijke infectie perifere factoren, kan alle nuttige om potentieel gevoelig hosts identificeren voor TSE's zijn.
Hier presenteren we het protocol voor de CER assay, waarbij twee gedenatureerd PrP C substraten afgeleid van normaal hersenweefsel homogenaten worden in tafelmodel prion omzettingsreacties (figuur 1) 13. PrP c in het substraat gedenatureerd bij pH 7,4 kan alleen PrP res worden omgezet PrP TSE gezaaid in de reactie in de afwezigheid van een soort barrière 14. Daarentegen denaturatie van PrP c in het andere substraat bij pH 3,5 het geschikt maakt omgezet PrP res na incubatiemet PrP TSE van elke soort en dient als controle voor conversie. De verhouding van de omzetting van PrP c naar PrP res in pH 7.4 substraat ten opzichte van die van de pH 3,5 substraat een maat van de soort barrière. Wij hebben gevonden dat de CER test voorspelt bekende species barrières van laboratoriummuizen verschillende TSE en de assay gebruikt in pogingen om de soort dam van vele zoogdiersoorten, waaronder bighornschapen, chronische wasting disease (CWD) en andere TSE 14 voorspellen, 15. Onderzoekers geïnteresseerd in een tool waardoor een snelle screening van TSE soorten barrières of beoordeling van PrP C to-PrP-res conversie zal deze methodiek nuttig vindt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Voor een succesvolle afronding van dit protocol, moet aandacht worden besteed aan PrP C niveaus in niet-geïnfecteerde hersenweefsel gebruikt voor voorbereiding van de ondergrond (stap 2.1.2) en het zaad tot ratio voor conversie reacties (stap 4.4.2) substraat. In onze ervaring, kunnen de hersenen worden gewonnen voor gebruik als CER substraat na een aanzienlijke periode post-mortem, zolang PrP C aanwezig door immunoblotting (figuur 4) is. In feite werd enige autolyse waargenomen i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank John Olsen (Wisconsin Department of Natural Resources), Tom Cooley, Daniel O’Brien and Steve Schmitt (Michigan Department of Natural Resources) and Dr. Daniel Walsh (USGS National Wildlife Health Center) for assistance with tissue acquisition. We also thank the Wisconsin State Laboratory of Hygiene for diagnostic testing services, and Dr. Tonie Rocke and her staff (USGS National Wildlife Health Center) for use of equipment. Any use of trade, product, or firm names is for descriptive purposes only and does not imply endorsement by the U.S. Government.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 12% Bis-Tris SDS-PAGE gels | Life Technologies | NP0342 | |
| 0.5 mm zirconium oxide beads | Next Advance | ZROB05 | Other varieties of beads are also effective |
| Antibodies | various suppliers | Select appropriate primary and secondary antibodies for immunoblot detection of PrPres from species of interest | |
| Bead homogenizer | Next Advance | BBY24M | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | 369434 | High speed with temperature control |
| Conical tubes | any brand | ||
| Cotton-tipped applicator | Uline | S-18991 | |
| Cuphorn sonicator | Heat Systems-Ultrasonics | W-380 | Heat Systems-Ultrasonics, Inc. is now Qsonica, LLC |
| Densitometry software program | UVP | Vision Works LS Image Acquisition and Analysis software | Other programs, such as NIH ImageJ, will also work |
| Dounce homogenizer | Kimble Chase | 885300 | |
| End-over-end mixer | Labnet International | H5600 | |
| Ethylenediaminetetra acetic acid | Boston Bioproducts | P-770 | Hazardous chemical: eye irritation |
| Guanidine hydrochloride, 8M | Thermo Fisher Scientific | 24115 | Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye irritation |
| Heating block | Fisher Scientific | 11-718 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 435570 | Hazardous chemical: strong acid |
| Lithium dodecyl sulfate sample buffer, 4X | Life Technologies | NP0008 | Hazardous chemical: skin & respiratory irritation, serious eye damage, flammable solid |
| Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | Hazardous chemical: acute toxicity, flammable liquid |
| Microcentrifuge tubes | any brand | ||
| Mini-centrifuge | Labnet International | C1301 | |
| N-lauroyl-sarcosine (sarkosyl) | Sigma-Aldrich | L-5125 | Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye damage |
| Nonidet P-40 | Amresco | M158 | Hazardous chemical: skin irritation, eye damage |
| SDS-PAGE gel system | Life Technologies | NuPAGE electrophoresis system | Other SDS-PAGE systems will also work |
| PCR tubes (low-binding) | Axygen | PCR-02-L-C | |
| Pestle homogenizer | Fisher Scientific | 03-392-106 | |
| pH meter | Sentron | SI600 | |
| Polyvinyldifluoride membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Proteinase K | Promega | V3021 | Hazardous chemical: skin & eye irritation, respiratory sensitisation, organ toxicity |
| Reducing agent for SDS-PAGE samples, 10X | Life Technologies | NP0009 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | Hazardous chemical: acute toxicity |
| Sodium dodecyl sulfate | Thermo Fisher Scientific | 28364 | Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye damage, flammable solid |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | Hazardous chemica; strong base |
| Syringe | BD Biosciences | various | Use syringe size appropriate to volumes of substrate to be homogenized |
| Syringe needles | BD Biosciences | various | |
| Thermoshaker (PCR tube shaker) | Hangzhou All Sheng Instruments | MS-100 | |
| Tris base | Bio Basic | 77-86-1 | Hazardous chemical: skin, eye, respiratory irritation |
| Triton X-100 | Integra Chemical Company | T756.30.30 | Hazardous chemical: acute toxicity, eye irritation |
| Vortexer | Fisher Scientific | 12-812 |
References
- Colby, D. W., Prions Prusiner, S. B. . Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (1), a006833 (2011).
- Hill, A. F., Collinge, J. Prion strains and species barriers. Contrib Microbiol. 11, 33-49 (2004).
- Scott, M., et al. Transgenic mice expressing hamster prion protein produce species-specific scrapie infectivity and amyloid plaques. Cell. 59 (5), 847-857 (1989).
- Prusiner, S. B., et al. Transgenetic Studies Implicate Interactions between Homologous Prp Isoforms in Scrapie Prion Replication. Cell. 63, 673-686 (1990).
- Telling, G. C., et al. Prion Propagation in Mice Expressing Human and Chimeric Prp Transgenes Implicates the Interaction of Cellular Prp with Another Protein. Cell. 83, 79-90 (1995).
- Hill, A. F., et al. The same prion strain causes vCJD and BSE. Nature. 389 (6650), 448-450 (1997).
- Torres, J. M., et al. Elements modulating the prion species barrier and its passage consequences. PLoS One. 9 (3), e89722 (2014).
- Groschup, M. H., Buschmann, A. Rodent models for prion diseases. Vet Res. 39 (4), 32 (2008).
- Korth, C., et al. Abbreviated incubation times for human prions in mice expressing a chimeric mouse-human prion protein transgene. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (8), 4784-4789 (2003).
- Kocisko, D. A., et al. Species specificity in the cell-free conversion of prion protein to protease-resistant forms: a model for the scrapie species barrier. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (9), 3923-3927 (1995).
- Raymond, G. J., et al. Evidence of a molecular barrier limiting susceptibility of humans, cattle and sheep to chronic wasting disease. EMBO J. 19 (7), 4425-4430 (2000).
- Fernandez-Borges, N., de Castro, J., Castilla, J. In vitro studies of the transmission barrier. Prion. 3 (4), 220-223 (2009).
- Zou, W. Q., Cashman, N. R. Acidic pH and detergents enhance in vitro conversion of human brain PrPC to a PrPSc-like form. J Biol Chem. 277 (46), 43942-43947 (2002).
- Li, L., Coulthart, M. B., Balachandran, A., Chakrabartty, A., Cashman, N. R. Species barriers for chronic wasting disease by in vitro conversion of prion protein. Biochem Biophys Res Commun. 364 (4), 796-800 (2007).
- Morawski, A. R., Carlson, C. M., Chang, H., Johnson, C. J. In vitro prion protein conversion suggests risk of bighorn sheep (Ovis canadensis) to transmissible spongiform encephalopathies. BMC Vet Res. 9, 157 (2013).
- Chandler, R. L. Encephalopathy in mice produced by inoculation with scrapie brain material. Lancet. 1 (7191), 1378-1379 (1961).
- Browning, S. R., et al. Transmission of prions from mule deer and elk with chronic wasting disease to transgenic mice expressing cervid PrP. J Virol. 78 (23), 13345-13350 (2004).
- Hadlow, W. J., Race, R. E., Kennedy, R. C. Experimental infection of sheep and goats with transmissible mink encephalopathy virus. Can J Vet Res. 51 (1), 135-144 (1987).
- Rubenstein, R., et al. Immune surveillance and antigen conformation determines humoral immune response to the prion protein immunogen. J Neurovirol. 5 (4), 401-413 (1999).
- Castilla, J., et al. Crossing the species barrier by PrP(Sc) replication in vitro generates unique infectious prions. Cell. 134 (5), 757-768 (2008).
- Kubista, M., et al. The real-time polymerase chain reaction. Mol Aspects Med. 27, 95-125 (2006).
- Atarashi, R., Sano, K., Satoh, K., Nishida, N. Real-time quaking-induced conversion: a highly sensitive assay for prion detection. Prion. 5 (3), 150-153 (2011).
- Ladner-Keay, C. L., Griffith, B. J., Wishart, D. S. Shaking Alone Induces De Novo Conversion of Recombinant Prion Proteins to beta-Sheet Rich Oligomers and Fibrils. PLoS One. 9 (6), e98753 (2014).
- Mathiason, C. K., et al. Susceptibility of domestic cats to chronic wasting disease. J Virol. 87 (4), 1947-1956 (2013).
- Seelig, D. M., et al. Lesion Profiling and Subcellular Prion Localization of Cervid Chronic Wasting Disease in Domestic Cats. Vet Pathol. , (2014).
- Stewart, P., et al. Genetic predictions of prion disease susceptibility in carnivore species based on variability of the prion gene coding region. PLoS One. 7 (12), e50623 (2012).
- Russell, W. M., Burch, R. I. . The Principles of Humane Experimental Technique. Metheun. , (1959).
