Summary
توضح هذه المقالة منهجية لإدارة فترات قصيرة من نقص الأكسجين المتقطع للما بعد الولادة يوم 08/01 الماوس أو الفئران الجراء. هذا النهج يثير بشكل فعال على مستوى الأنسجة قوي "فتيلة تأثير" على الخلايا الاصلية العصبية مثقف التي يتم حصادها خلال 30 دقيقة من التعرض نقص الأكسجين.
Introduction
والهدف من هذه الطريقة هو تقديم بتكاثر وفعالية نوبات متقطعة من الأكسجين النظامية المحيطة خفضت إلى القوارض حديثي الولادة. الأساس المنطقي لاستخدام نقص الأكسجين المتقطع (IH) لمعالجة بيولوجيا الخلايا الجذعية تنبع من في المختبر تجارب زراعة الخلية التي يتم تبديل O 2 محتوى وسائط النمو. على وجه التحديد، بالمقارنة مع الظروف "القياسية" من 20٪ O 2، ثقافة ممتدة من الجذعية / السلف السكان الخلية الخلايا في 3٪ O 2 النتائج في زيادة انتشار، وانخفاض الخلايا وزيادة الخلايا العصبية 1،2 الغلة.
هذه المجموعة لديها خبرة كبيرة مع إدارة IH النظامية، وأجرت دراسات مستفيضة حول دور IH في اللدونة الجهاز التنفسي 3-7. هذا العمل، وهذا الاكتشاف الأخير الذي IH المزمن زيادة تكوين الخلايا العصبية في الجهاز العصبي المركزي القوارض 10/08، يشكل الأساس لاستكشاف الحادة في الجسم الحينقص الأكسجة كحافز شروط مسبقة (أي قبل الحصاد الأنسجة) على ثقافة اللاحقة من الخلايا الجذعية / السلف العصبية (الشخصيات) 11. بشكل ملحوظ، عندما تعرضت الجراء الماوس إلى وجيزة (<1 ساعة) فترة من نقص الأكسجين الحاد المتقطع (AIH)، والخلايا التي تم حصادها من منطقة subventricular (SVZ) قد ارتفع بدرجة كبيرة القدرة على التوسع كما neurospheres أو خلايا أحادي الطبقة ملتصقة. ارتبط بروتوكول AIH أيضا مع التعبير زيادة من "مصير الخلايا العصبية" عامل النسخ (Pax6).
وفقا لذلك، في الجسم الحي قد توفر بروتوكولات AIH وسيلة ل"رئيس الوزراء" الشخصيات قبل الثقافة. على سبيل المثال، يمكن لتطبيقات هذا النهج تشمل توسيع السكان الخلية قبل الزرع في النظام العصبي المركزي المصاب، أو مجرد زيادة تمايز الخلايا العصبية من الخلايا المستنبتة قبل التجارب في المختبر. وعلاوة على ذلك، لأن هذا هو تسليم النظامية، أيالجهاز، الأنسجة أو الخلايا مرشحة لدراسة مماثلة. ولذلك، فإن البروتوكول كما هو مكتوب ينطبق المحتمل لمجموعة واسعة من الدراسات حول التلاعب الأكسجين المتقطع في الثدييات الصغيرة.
هناك بعض المزايا لهذا النهج. في الأعمال المنشورة آخرين، تم علاج حديثي الولادة كما القمامة مع السد في غرف منخفض الضغط، والذي يسمح لجرعات المزمنة، وأقل معالجة قبل العلاج، وعلى اتصال الأمهات أثناء العلاج 9. النهج الحالي يتجاوز العلاجات المتكررة إلى الأنثى تربية، أو استخدام سد مختلفة لكل تجربة. هذا البروتوكول يسمح أيضا دراسة حديثي الولادة المطابقة القمامة والعمر المتطابقة دقيقة. وتظهر بيانات تمثيلية قوة رئيسية أخرى من هذا البروتوكول، وهي السرعة التي AIH، وتسليمها، ويتسبب استجابة بيولوجية قوية ومتناسقة في البيولوجيا العصبية للخلايا الجذعية. هذا يضع سابقة لهذا البروتوكول للحصول بيولوجيا نسيجيا وعلى المستوى الخلويتغييرات كال أن يغير بيولوجيا الخلية.
سيعرض هذا التقرير الإجراءات التفصيلية استخدامها لتعريض الجراء القوارض إلى AIH فضلا عن التحليل السكاني الخلايا SVZ كما نمت neurospheres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وتجرى جميع الإجراءات الحيوانية في هذا البروتوكول بموافقة جامعة فلوريدا رعاية الحيوان المؤسسية واللجنة الاستخدام (IACUC) وتكون في الامتثال مع 'دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية': ملاحظة.
1. مجموعة التجريبية الأساسية حتى قبل إدارة المتقطع نقص الأكسجة
- فضح الجراء 12 إلى يمزج الغاز المختلفة باستخدام كامل الجسم غرف الماوس مخطاط التحجم بنفس الطريقة التي القوارض الكبار لأغراض تجريبية أخرى 5،13،14. الدوائر ويبلغ قطرها 4 بوصة (حجم = 450 مل)، والذي هو من حجم كاف لاستيعاب 3-4 الجراء الماوس أو 1-2 الفئران الوليدة. هنا، يتم تسليم بروتوكولات AIH لحديثي الولادة الذين تتراوح أعمارهم بين 1-8 يوم بعد الولادة (P1-P8).
- استخدام خزانات الغاز الهواء المضغوط لتسليم 21٪ "الأساس" الغاز، التي تحافظ على غرفة الأوكسجين بنسبة 21٪. لتحقيق "نقص الأكسجين النسبي"، استخدم / 90٪ خزان غاز النيتروجين 10٪ من الأكسجين.
ليسE: أنابيب البلاستيك (3/16 "قطر) يربط خزانات الغاز إلى تدفق متر. وهكذا، فإن مساهمة في تدفق متر ويتألف من أنبوب واحد لكل من خط الأساس ونقص الأكسجة تدفق الهواء. - تكوين أنابيب الغاز على النحو التالي.
- تشغيل أنابيب البلاستيك (1/8 "قطر) من تدفق متر إلى منظم تدفق التحيز، والتي تمكن تدفقات 1 لتر / دقيقة لكل غرفة (أي 4 لتر / دقيقة إذا تم استخدام 4 غرف).
- تشغيل أنابيب البلاستيك (1/8 "قطر) من منظم تدفق التحيز إلى غرف تخطيط التحجم. تدفق الهواء في 1 لتر / دقيقة لكل غرفة هو معدل تدفق محددة سلفا الذي يعتبر تبادل الغازات أن يكون لهذه الحيوانات على أساس الملاحظات الفسيولوجية والسلوكية حمل غير الإجهاد.
- اغلاق كافة الاتصالات غير المستخدمة من وإلى وحدة تدفق التحيز وجميع الفتحات غير المستخدمة إلى غرف مع قبعات بحيث لا يهرب تدفق الغاز إلى غرف أخرى لا تكون قيد الاستعمال، أو الخروج من دوائر تخطيط التحجم خلال البروتوكول.
- مكان الغرفة (ق) في حاضنة قبل وضع الحيوانات في غرفة للسماح للموازنة إلى 37 درجة مئوية، أو درجة حرارة الجسم.
2. معايرة دورة تايمز لالمتقطع نقص الأكسجة
- فحص جميع الأنابيب، وبين خزانات الهواء وتدفق متر، تدفق متر وحدة تدفق التحيز، وتدفق التحيز الوحدة وغرفة تخطيط التحجم (ق) للاتصالات المناسبة. يتم تعيين الاتصالات تصل كما هو موضح في الخطوة 1. تحقق من الاتصال عن طريق متدرج الاختيار من كافة خطوط صفها والإغلاق: على سبيل المثال، والتحقق من الخطوط غير المستخدمة من وحدة تدفق التحيز وأي فتحات غرفة لا تكون قيد الاستعمال.
- توصيل المحيطة O 2 الاستشعار مع باليد O 2 متر ثم نعلق أجهزة الاستشعار لغطاء غرفة تخطيط التحجم.
- فتح كل من خزانات الغاز وإرفاق زوج واحد من العمليات الجراحية، المرقأة معالجة طويلة معزولة مع أنابيب بلاستيكية لكبح تدفق خارج دائرة الغاز. وبهذه الطريقة، خزان غاز واحدة فقط في كل مرة هو تقديم 1 لتر / دقيقة تدفق الغاز في الغرفة. المشبك "الأساس" مزيج الغاز في حين يتم تسليم "ميتة" مزيج الغاز إلى الغرفة، والعكس بالعكس.
- تسجيل الوقت اللازم لغرفة O 2 للوصول إلى المستويات المستهدفة من 10٪ والعائد إلى 21٪. الاستفادة من الأوقات المسجلة لتسليم بروتوكول لاحق.
3. إدارة الحاد المتقطع نقص الأكسجة
- فحص جميع الأنابيب والاتصالات كما هو موضح في الخطوة 2.1.
- وضع حديثي الولادة في غرفة تخطيط التحجم (ق) وإيواء الأغطية غرفة تخطيط التحجم في قاعدة الغرفة. تأكيد ختم الصحيح لختم يا الدائري هو كذلك إغلاق أية اتصالات غرفة غير مستخدمة. هذه خطوات حاسمة لضمان إيصال المناسب يمزج الغاز.
- وضع الدوائر عقد الجراء في أن يعامل في الحاضنة 37 درجة مئوية وإغلاق الباب. السماح الغرفة لكي تتوازن إلى 37 درجة مئوية قبل البدء في البروتوكول. الحفاظ على الحيوانات السيطرة على 37 درجة مئوية في incubatأو في غرفة الأوكسجين الجوي.
- فتح كل من خزانات الغاز واستخدام زوج واحد من العمليات الجراحية، المرقأة معالجة طويلة معزولة مع أنابيب بلاستيكية لكبح تدفق خارج دائرة الغاز. وبهذه الطريقة، خزان غاز واحدة فقط في كل مرة هو تقديم 1 لتر / دقيقة تدفق الغاز في الغرفة.
- استخدام جهاز توقيت باليد لوجه التحديد الدورات الزمنية والإشارة إلى الوقت لتبديل المرقأة بين الأنابيب، مما أدى إلى اختلاف تدفق الغاز إلى غرف.
- تسجيل الانتهاء من كل دورة باستخدام سجل المعاملة مثل واحد المقدمة في الشكل 1 إلى علامة إيقاف كل الخطوات في 2-الخطوة، 20 بروتوكول الدورة.
- رصد درجات الحرارة حاضنة في كل تغيير دورة لضمان الحفاظ على الحيوانات في مجموعة معينة (33-35 درجة مئوية، وهو الإعداد على الحاضنة التي ينتج عنها 37 ° C).
- عن كثب مراقبة نشاط الجرو في جميع أنحاء بروتوكول للتأكد من أن الحيوانات تتسامح دورات دون ضيق مرئية مثل الالفاظ، ومستوى تغير منالنشاط أطرافهم أو المتداول.
4. العزلة وثقافة الجذعية / خلايا السلف من المنطقة Subventricular
ملاحظة: التغيير في تشكيل neurosphere التالية AIH مقارنة مع الضوابط هي مثال لنقطة النهاية أن يدل على فعالية هذا البروتوكول للحصول تغييرات نسيجيا وعلى المستوى الخلوي.
- لعزل neurospheres تشكيل الخلايا، وإزالة الماوس أو الفئران الجراء من الغرفة على الفور بعد اكتمال AIH. التضحية الحيوانات وفقا لبروتوكولات IACUC غضون 30 دقيقة من انتهاء البروتوكول.
- حصاد الأنسجة SVZ، ضع في الثقافة neurosphere وإجراء مرور القياسية والتوسع في neurospheres المشتقة، كما نشرت سابقا في وسائل الفصول 15،16 وبروتوكول فيديو منفصل 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
التجارب الأولية، استنادا إلى بيانات تاريخية أجريت باستخدام أطوال دورة 1 دقيقة. على أساس المعايرة اللاحقة التي أجريت في الخطوة 2 أعلاه، تقرر أن مستوى O 2 في غرفة كان 13٪ في 1 دقيقة التنظيف بعد نقص الأكسجين، وأنه استغرق وقتا مماثلا للعودة إلى خط الأساس 21٪. ومع ذلك، كانت دورة 2 دقيقة كافية لكلا تحقيق 10٪ من الأكسجين والعودة إلى 21٪ خلال دورة "خط الأساس". وفي وقت لاحق، وقد تم استخدام أطوال دورة 2 دقيقة. وتألفت لمدة بروتوكول 20 دورات بالتناوب بين خط الأساس ونقص الأكسجة (80 دقيقة وقت العلاج الشاملة). وتم اختيار مدة 20 دورة بسبب الأعمال السابقة تبين أن هذه مدة دورة كافية للحصول تغييرات في الجهاز التنفسي نتيجة يقيس 11. باستخدام وصف إعداد (الشكل 2)، وكان حديثي الولادة يتعرضون لAIH أي أحداث سلبية واضحة، ولم يحمل السلوكيات تدل على الألم وعدم الراحة أثناء 80دقيقة البروتوكول. على وجه التحديد، لم يلاحظ أي توقف التنفس أثناء مرئية، أطرافهم أو الرأس الحركات المفرطة، أو الالفاظ. بعد AIH، مثقف subventricular العصبي السكان الخلايا الجذعية / السلف المستمدة من المنطقة كما neurospheres لمدة 14 يوما (والسكان أحادي الطبقة أيضا ملتصقة، لا تظهر البيانات) تبدي زيادة ما يقرب من شقين في قطر، مما يدل على زيادة التوسع في كل مجال تشكيل (الشكل 3). الخلايا التي يتم مطلي المقبل في ظروف متساهلة (أي غياب عوامل مولد للتفتل) تسفر عن خلايا بيتا 3-إيجابية أكثر بكثير (زيادة من <10٪ إلى> 45٪) مما يدل على تمايز الخلايا العصبية أكثر شمولا بالمقارنة مع الخلايا التي تحصد من normoxic المعالجة (السيطرة) الجراء (الشكل 4).
الشكل 1. يستخدم هذه الورقة سجل IH حادة لتوثيق الحيوان وتفاصيل التجريبية، تقديم قائمة الاختيار قبل البدء وبعد الانتهاء من بروتوكول IH، وتكون بمثابة وثيقة للاحصاء دقيق لجميع دورات الانتهاء تتبع.
تعيين الرقم 2. نقص الأكسجين المتقطع تصل للقوارض حديثي الولادة. (A) حاضنة للحفاظ على البيئة عند 37 درجة مئوية. وأظهرت غرفة تخطيط التحجم داخل الحاضنة، ومرة أخرى مع الباب مواربا غرفة (B). (C) الحق، وتدفق متر تعديلها ل1 لتر / دقيقة لكل غرفة. يتم توجيه تدفق الغاز عبر تدفق التحيز وحدة وحدة الخائن (الوسط) إلى أي غرفة متصلة (من اليسار، داخل الحاضنة). (D) مراقبة المرقأة من خط الأساس (الروتين) ونقص الأكسجة (الشريط الأصفر) خطوط الإدخال. عنخ "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. neurospheres تحكم (A) يبرهن على وجود قطرها أصغر من AIH neurospheres (B). الصور التي التقطت في 10X الهدف، شريط النطاق = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4. neurospheres تحكم (A) تثبت neuroblasts أقل بيتا 3 تويولين إيجابية من neurospheres AIH (B). الصور التي التقطت في 20X الهدف، شريط النطاق = 50 ميكرومتر.ز "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse plethysmography chambers | Buxco | PLY4211 | |
| Flow meter | Porter | F150 | |
| Bias flow unit | AFPS | ||
| Baseline Gas Mix | Airgas | AIZ300 | Compressed Air |
| Hypoxic Gas Mix | Airgas | X03NI72C2000189 | 10% Oxygen, balance nitrogen |
| Oxygen Meter | Teledyne | AX-300 |
References
- Studer, L., et al. Enhanced proliferation, survival, and dopaminergic differentiation of CNS precursors in lowered oxygen. J Neurosci. 20 (19), 7377-7383 (2000).
- Chen, H. L., et al. Oxygen tension regulates survival and fate of mouse central nervous system precursors at multiple levels. Stem Cells. 25 (9), 2291-2301 (2007).
- Ling, L., et al. Chronic intermittent hypoxia elicits serotonin-dependent plasticity in the central neural control of breathing. J Neurosci. 21 (14), 5381-5388 (2001).
- Mitchell, G. S., et al. Invited review: Intermittent hypoxia and respiratory plasticity. J Appl Physiol. 90 (6), 2466-2475 (2001).
- Fuller, D. D., Zabka, A. G., Baker, T. L., Mitchell, G. S. Phrenic long-term facilitation requires 5-HT receptor activation during but not following episodic hypoxia. J Appl Physiol. 90 (5), 2001-2006 (2001).
- Fuller, D. D., Johnson, S. M., Olson, E. B., Mitchell, G. S. Synaptic pathways to phrenic motoneurons are enhanced by chronic intermittent hypoxia after cervical spinal cord injury. J Neurosci. 23 (7), 2993-3000 (2003).
- Baker-Herman, T. L., et al. BDNF is necessary and sufficient for spinal respiratory plasticity following intermittent hypoxia. Nat Neurosci. 7 (1), 48-55 (2004).
- Zhu, L. L., et al. Neurogenesis in the adult rat brain after intermittent hypoxia. Brain Res. 1055, 1-6 (2005).
- Zhang, J. X., Chen, X. Q., Du, J. Z., Chen, Q. M., Zhu, C. Y. Neonatal exposure to intermittent hypoxia enhances mice performance in water maze and 8-arm radial maze tasks. Journal of neurobiology. 65 (1), 72-84 (2005).
- Zhu, L. L., Wu, L. Y., Yew, D. T., Fan, M. Effects of hypoxia on the proliferation and differentiation of NSCs. Mol Neurobiol. 31 (1-3), 231-242 (2005).
- Ross, H. H., et al. In vivo intermittent hypoxia elicits enhanced expansion and neuronal differentiation in cultured neural progenitors. Exp Neurol. 235 (1), 238-245 (2012).
- Fuller, D. D., et al. Induced recovery of hypoxic phrenic responses in adult rats exposed to hyperoxia for the first month of life. J Physiol. 536 (Pt 3), 917-926 (2001).
- Fuller, D. D., Fregosi, R. F. Fatiguing contractions of tongue protrudor and retractor muscles: influence of systemic hypoxia. J Appl Physiol. 88 (6), 2123-2130 (2000).
- Baker, T. L., Fuller, D. D., Zabka, A. G., Mitchell, G. S. Respiratory plasticity: differential actions of continuous and episodic hypoxia and hypercapnia. Respir Physiol. 129 (1-2), 25-35 (2001).
- Marshall, G. P. 2nd, et al. Production of neurospheres from CNS tissue. Methods Mol Biol. 438, 135-150 (2008).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. (45), (2010).
