Summary
本文介绍了管理间歇性缺氧的短期产后1-8天的小鼠或大鼠幼仔的方法。这种方法有效地引起上都在低氧暴露30分钟收获培养的神经祖细胞的一个强大的组织水平“启动效应”。
Introduction
该方法的目标是可重复地提供全身降低环境氧的间歇发作新生儿啮齿动物。使用间歇性缺氧（1H）操纵干细胞生物学的基本原理源于体外细胞培养实验，其中的 O 2含量的生长培养基被改变。具体地，当相比于20％O 2，干/祖细胞群的细胞的扩展培养在3％ 的 O 2的结果增加的增殖的“标准”的条件下，降低的细胞凋亡和增加的产量神经1,2。
本组有全身IH的管理显著的经验，并已在呼吸可塑性3-7进行了IH的作用，广泛的研究。这项工作，最近发现，即慢性IH在啮齿动物的CNS 8-10增加神经发生，形成基础急性在体内的勘探缺氧作为预处理刺激（ 即 ，之前的组织收获）与神经干/祖细胞（NPC的）11的随后的培养。值得注意的是，当小鼠幼仔暴露于一个简短（<1小时）期间的急性间歇性缺氧（AIH），从室下区（SVZ）收获该细胞已经显著增加了对扩张为神经球或贴壁单层细胞的能力。该AIH协议也与一个“神经元命运的”转录因子（Pax6的）表达增加有关。
因此 ，在体内 AIH协议可能以“素”之前筹备文化提供了一种方法。例如，对于这种方法的应用可包括在移植之前扩大细胞群体进损伤的中枢神经系统，或者简单地增加培养细胞的神经元分化之前在体外实验 。另外，由于这是一种全身递送，任何器官，组织或细胞是类似的研究的候选者。因此，书面协议是可能适用于范围广泛的间歇氧操纵小型哺乳动物的研究。
有一定的优势，以这种方式。在其他发表的作品，新生儿被视为与大坝低压室 ，其中在治疗之前允许长期给药，少搬运垃圾，并维持治疗9时产妇接触。目前的方法绕过重复治疗，以繁殖雌性，或使用不同的坝每个实验。该协议还允许精确垫料匹配和年龄匹配的新生儿研究。有代表性的数据证明这种协议的另一个关键力量，即迅速与AIH在交付时，引发神经干细胞生物学的强大和一致的生物反应。这将建立一个先例，该协议引起组织特异性和细胞水平biologi从而改变细胞生物学CAL变化。
本报告将勾勒出详细的程序用于揭露啮齿动物幼仔AIH和SVZ细胞群体分析生长为神经球。
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Protocol
注：在本协议中的所有动物的程序都与佛罗里达州的机构动物护理和使用委员会（IACUC）的大学进行审批，并符合“指南实验动物的护理和使用”。
1.基本实验装置在间歇性低氧管理
- 暴露幼仔12使用全身体积描记鼠标腔中大致相同的方式作为成年啮齿类动物的其他实验目的5,13,14的不同的气体混合物。该腔室具有4英寸直径（体积= 450ml）中，这是足够的尺寸以容纳3-4小鼠幼仔或1-2幼鼠。在这里，AIH协议交付给1-8岁的日龄（P1-P8）新生儿。
- 使用压缩空气储气罐，提供了21％的“基线”气体，保持室内的氧合21％。为了实现“相对缺氧”，用10％的氧气/ 90％氮气罐。
不E：塑料管材（“直径的3/16）的气罐连接到一个流量计。因此，输入到流量计包括每个用于基线和缺氧气流一个管的。 - 配置气体管道如下。
- 运行来自流量计的塑料管（直径为1/8“），以一个偏压流量调节器，它使1升/分钟流过每个腔室（即，4升/ 4，如果腔室采用分钟）。
- 运行从偏压流量调节器的体积描记法室塑料管（直径为1/8“）。气流以1L /分钟到各室是在该气体交换被认为是在非胁迫诱导基于生理和行为观察动物的预定流速。
- 密封所有未使用的连接，并从偏压流动单元和所有未使用的开口，以与瓶盖的腔室，使得没有气流逸出到其它腔不使用时，或流出的体积描记腔的协议期间。
- 放置室（S）成之前将动物室中，以允许平衡到37℃，或体温的培养箱。
2.校准周期时间的间歇性低氧
- 检查所有管道，空气坦克和流量计之间，进行正确连接流量计和偏置流动单元，和偏流单位和体积描记法室（S）。在连接建立后，如步骤1所述验证通过的所有所述行和关闭的逐步检查的连接：例如，检查未使用的线路出来的偏流单元和任何腔室开口在不使用。
- 连接环境氧传感器与手持式氧气计和再装上传感器的体积描记室盖。
- 打开两个煤气瓶，并附上一对绝缘的塑料管钳气体的非周期流手术，长柄止血的。通过这种方式，在同一时间只有一个煤气罐正在提供每室1升/分钟的气流。夹紧“基线”混合气体而“缺氧”气体混合物被输送到腔室，并且反之亦然。
- 记录达到10％的目标水平，并返回到21％所需的腔室的 O 2所需的时间。利用记录的时间为后续协议交付。
3.管理急性间歇性低氧
- 检查所有管道和连接如步骤2.1中所述。
- 发生在体积描记室（S）新生儿和容纳体积描记室盖到腔基地。确认一个适当的密封的任何未使用的腔室连接到所述O形密封圈是以及闭合。这些步骤是确保混合气体的合适的交付至关重要。
- 将抱着幼崽腔来对待到37℃培养箱并关上门。允许腔室平衡至37℃开始协议之前。在incubat维持对照动物在37℃下或在室内空气氧化。
- 打开两个气舱和使用一对绝缘的塑料管手术，长柄的止血钳的气体的关断周期的流动。在这种方式中，只有一个在时间煤气罐正在提供每室中的1升/分钟的气流。
- 使用一个手持计时器精确时间周期和以指示切换管之间的止血的时间，从而导致气体流动到腔室的交替。
- 记录完成使用治疗日志每个周期如设置在图1中以标记过的两步骤，20循环协议的所有步骤之一。
- 监视培养箱温度在每个周期改变，以确保动物都保持在指定的范围（33-35℃，这是在其导致37℃的孵化器设置）。
- 密切监控整个协议小狗的活动，以确保动物耐受周期没有明显的窘迫，如发声，改变的水平肢体活动或滚动。
从下区4分离干/祖细胞的文化
注：以下AIH的神经球形成的变化与对照组相比的是，演示了该协议的有效性，以引起组织特异性和细胞水平的变化端点的一个例子。
- 为了分离神经球形成细胞，从AIH完成后立即室取出小鼠或大鼠幼仔。根据内部协议终止30分钟IACUC协议牺牲的动物。
- 收获的SVZ组织，放入神经 球文化，并进行标准的通道和扩张衍生神经球，以前发表的方法章节15,16和一个独立的视频协议8。
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Representative Results
在最初的实验中，根据历史数据，用1分钟周期的长度进行的。基于在上述步骤2中进行随后的校准，它被确定在腔室中的O 2的水平为13％，在1分钟后缺氧冲洗和，它采取了类似的时间，返回到21％的基线。但是，2分钟周期足以达到10％的氧气和一个返回到21％时的“基线”循环两者。随后，2分钟周期长度已被使用。该协议期限由20个循环基线和缺氧（80分钟总的治疗时间）之间交替。甲20周期的持续时间被选择，由于以前的工作显示，这种循环持续时间是足以引起变化呼吸结局测量11。使用所描述的设置（图2），新生儿进行AIH没有明显的不良事件，并且在80没有表现出行为暗示的疼痛和不适的分协议。具体而言，没有明显的呼吸暂停观察，过多的肢体或头部运动或发声。以下AIH，室下区衍生的神经干/祖细胞群培养神经球14天（也可作为贴壁单层种群，数据未显示）显示在直径几乎增加两倍，每个成形范围内表现出膨胀增加 （图3）。这是在允许的条件下一个铺的细胞（ 即没有促有丝分裂因子）产生显著更多的β-3阳性细胞（增加从<10％> 45％），这表明更广泛的神经元的分化相比，细胞含氧量正常的收获处理（对照）幼仔（图4）。
图1.急性IH记录表是用来记录动物和实验细节，提供了一个对照表开始，并按照IH协议完成前，并作为所有已完成的周期精确吻合的跟踪文件。
图2.间歇性低氧成立了新生儿啮齿动物。（A）孵化器，以保持环境在37℃。体积描记术室的房门虚掩着（B）所示的孵化器内，并再次。 （C）的右，流量计调节至1升/分的每个室中。气流通过偏流单元分路器单元（中心）的任何连接的室（左，中孵化器）执导。 （D）的基线（繁琐）和缺氧（黄色胶带）输入线的止血控制。 ANK“>点击此处查看该图的放大版本。
图3.控制神经球（A）中表明的直径小于AIH神经球（B）。图片拍摄于10倍的目标，比例尺= 100微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4.控制神经球（A）中表明更少的β-3微管蛋白阳性的神经母细胞比AIH神经球（B）。拍摄的图像在20X物镜，比例尺= 50微米。G“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse plethysmography chambers | Buxco | PLY4211 | |
| Flow meter | Porter | F150 | |
| Bias flow unit | AFPS | ||
| Baseline Gas Mix | Airgas | AIZ300 | Compressed Air |
| Hypoxic Gas Mix | Airgas | X03NI72C2000189 | 10% Oxygen, balance nitrogen |
| Oxygen Meter | Teledyne | AX-300 |
References
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