Summary
Dieser Artikel beschreibt die Methodik für die Verwaltung von kurzen Perioden intermittierender Hypoxie zu postnatalen Tag 1-8 Maus oder Ratte Welpen. Dieser Ansatz effektiv löst eine robuste Gewebeniveau "Priming-Effekt" an kultivierten neuralen Vorläuferzellen, die innerhalb von 30 Minuten von Hypoxie Exposition geerntet werden.
Introduction
Das Ziel dieser Methode ist es, reproduzierbar und effizient zu liefern intermittierende Anfälle von systemischen abgesenkt Umgebungssauerstoff zu neonatalen Nagetiere. Der Grund für die Verwendung intermittierender Hypoxie (IH) Stammzellen biology manipulieren stammt von in vitro Zellkulturexperimente, in denen O 2 -Gehalt des Wachstumsmediums verändert wird. Insbesondere im Vergleich zu "normalen" Bedingungen von 20% O 2, verlängerte Kultur von Stammzellen / Vorläuferzellpopulationen Zellen in 3% O 2 führt zu einer erhöhten Proliferation, Apoptose verringert und erhöhte neuronale Ausbeute 1,2.
Diese Gruppe hat umfangreiche Erfahrungen mit der Verabreichung von systemischen IH und hat umfangreiche Studien über die Rolle der IH in Atem Plastizität 3-7 durchgeführt. Diese Arbeit und die jüngste Entdeckung, dass chronische IH erhöhte Neurogenese im Nagetier CNS 8-10, bildet die Grundlage für die Erforschung der akuten in vivoHypoxie als Vorkonditionierung Stimulus (dh., vor der Gewebeernte) auf die anschließende Kultur von neuronalen Stammzellen / Vorläuferzellen (NPC) 11. Bemerkenswert ist, wenn die Maus Jungtiere wurden auf eine kurze (<1 Stunde) Zeit der akute intermittierende Hypoxie (AIH) ausgesetzt sind, Zellen, die aus der Subventrikularzone (SVZ) geerntet wurden, hatten signifikant erhöhte Kapazität für die Expansion als Neurosphären oder anhaftenden Monolayer-Zellen. AIH Protokoll wurde auch mit einer erhöhten Expression eines "neuronalen Schicksals" Transkriptionsfaktor (Pax6) zugeordnet ist.
Dementsprechend wird in vivo AIH Protokolle kann ein Mittel zur "prime" NPCs vor der Kultur zu schaffen. Beispielsweise könnten Anwendungen für diesen Ansatz sind die Erweiterung Zellpopulationen vor der Transplantation in das verletzte Zentralnervensystems, oder einfach die Erhöhung der neuronalen Differenzierung von kultivierten Zellen vor der in vitro-Experimente. Ferner kann, da dies eine systemische Verabreichung, jedeOrgan, Gewebe oder Zellen, ist ein Kandidat für ähnliche Studie. Daher ist das Protokoll geschrieben potenziell für eine breite Palette von Studien über intermittierende Sauerstoff Manipulation in kleinen Säugetieren.
Es gibt bestimmte Vorteile für diese Vorgehensweise. In anderen veröffentlichten Arbeiten wurden Neugeborenen als ein Wurf mit der Staumauer in Unterdruckkammern, die für die Langzeitanwendung vor der Behandlung ermöglicht, weniger Handling behandelt und gepflegt mütterlichen Kontakt während der Behandlung 9. Der derzeitige Ansatz umgeht wiederholten Behandlungen zu einer Zuchthündin, oder die Verwendung einer anderen Damm für jedes Experiment. Dieses Protokoll erlaubt auch Studium der präzisen Wurf abgestimmt und altersangepassten Neugeborenen. Repräsentative Daten zeigen eine weitere wesentliche Stärke dieses Protokolls, nämlich die Schnelligkeit, mit der AIH, wie geliefert, löst eine leistungsstarke und einheitliche biologische Reaktion in neuronalen Stammzellbiologie. Dies schafft einen Präzedenzfall für dieses Protokoll, um Gewebe- und Zellebene biologi entlockencal Änderungen, die Zellbiologie zu ändern.
Dieser Bericht wird die detaillierten Verfahren zur Belichtung von Nagetier Welpen zur AIH sowie die Populationsanalyse der SVZ-Zellen als Neurosphären verwendet gewachsen zu skizzieren.
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Protocol
HINWEIS: Alle tierischen Verfahren in diesem Protokoll sind mit Zustimmung der University of Florida Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) durchgeführt und sind in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren.
1. Grundversuchsaufbau Bevor intermittierende Hypoxie Verwaltung
- Expose Welpen 12 zu den verschiedenen Gasmischungen unter Verwendung eines Ganzkörper-Maus Plethysmographen Kammern in der gleichen Weise wie erwachsenen Nagetieren für andere experimentelle Zwecke 5,13,14. Die Kammern haben einen Durchmesser von 4 Inch (Volumen = 450 ml), die eine ausreichende Größe ist, um 3-4 Maus Welpen oder 1-2 Rattenjungen zubringen. Hier werden AIH Protokolle Neugeborenen im Alter von postnatalen Tag 1-8 (P1-P8) geliefert.
- Verwenden Sie Druckluft Gastanks, die 21% "Baseline" Gas, das Sauerstoffkammer mit 21% unterhält zu liefern. Um "relative Hypoxie" zu erzielen, verwenden Sie ein% Sauerstoff 10/90% Stickstoffgastank.
NICHTE: Kunststoffschlauch (3/16 "Durchmesser) verbindet die Gastanks mit einem Durchflussmesser. Somit wird der Eingang zu dem Durchflussmesser besteht aus jeweils zur Grundlinie und Hypoxie Luftstrom einen Röhre. - Konfigurieren Sie den Gasschlauch wie folgt.
- Laufen Kunststoffschlauch (1/8 "Durchmesser) von dem Durchflußmesser zu einem Spannungsströmungsregler, der Ströme von 1 l / min ermöglicht, jede Kammer (dh 4 L / min bei 4 Kammern verwendet werden).
- Führen Kunststoffschlauch (1/8 "Durchmesser) von der Bias-Stromregler auf die Plethysmographie Kammern. Luftstrom bei 1 l / min zu jeder Kammer ist eine vorbestimmte Strömungsrate, mit der der Gasaustausch als Nicht verspannungsinduzierenden der Tiere basierend auf physiologische und Verhaltensbeobachtungen können.
- Verschließen Sie alle nicht verwendeten Verbindungen zu und von der Bias-Flow-Einheit und alle nicht verwendeten Öffnungen zu den Kammern mit Kappen, damit kein Gasstrom entweicht, um anderen Kammern nicht in Gebrauch ist, oder aus den Plethysmographie Kammern während des Protokolls.
- Setzen Sie die Kammer (n) In einem Inkubator vor der Inbetriebnahme Tiere in der Kammer, um Äquilibrierung auf 37 ° C, oder Körpertemperatur zu ermöglichen.
2. Kalibrierung der Zykluszeiten für intermittierende Hypoxie
- Prüfen Sie die Verschlauchung zwischen Luftbehälter und Durchflussmesser, Durchflussmesser und Bias-Flow-Einheit und Bias-Flow-Einheit und Plethysmographie Kammer (n) für die richtigen Verbindungen. ZB ungenutzte Leitungen aus dem Bias-Flow-Einheit und keine Raumöffnungen Überprüfung nicht in Gebrauch: Die Anschlüsse sind wie in Schritt 1 beschrieben, Überprüfen Sie die Verbindung durch eine schrittweise Überprüfung aller beschriebenen Linien und Schließungen gesetzt.
- Schließen Sie eine Umgebungs O 2 -Sensor mit einem Handheld-O 2 Meter und bringen Sie dann den Sensor mit dem Plethysmographie Kammerdeckel.
- Öffnen Sie beide Gastanks und bringen ein Paar chirurgische, langstieligen hemostats mit Kunststoffschlauch isoliert, um die Off-Cycle-Gasstrom zu klemmen. Auf diese Weise wird nur ein Gastank zu einer Zeit liefert die 1 l / min Gasfluss pro Kammer. Klemmen Sie den "Baseline" Gasgemisch, während die "Hypoxie" Gasgemisch in die Kammer geliefert wird, und umgekehrt.
- Notieren Sie sich die Zeit für die Kammer O 2 erforderlich, um die Zielwerte von 10% zu erreichen und zurück zu 21%. Nutzen Sie die aufgezeichneten Zeiten für nachfolgende Protokoll Lieferung.
3. Verwaltung von akuter intermittierender Hypoxie
- Überprüfen Sie alle Schläuche und Anschlüsse, wie in Schritt 2.1 beschrieben.
- Zeigen Neugeborenen in der Plethysmographie Kammer (n) und das Haus des Plethysmographie Kammerdeckel in die Kammer Basis. Bestätigen Sie eine ordnungsgemäße Abdichtung zu der O-Ringdichtung ist, sowie Schließung von nicht genutzten Kammer Verbindungen. Diese Schritte sind entscheidend für die Gewährleistung der entsprechenden Lieferung von Gasgemischen.
- Zeigen die Kammern halten die Welpen in die 37 ° C-Inkubator behandelt werden und die Tür schließen. Ermöglichen Kammer auf 37 ° C vor dem Beginn des Protokolls äquilibrieren. Aufrechtzuerhalten Kontrolltieren bei 37 ° C im INCUBAToder bei Raumluftsauerstoffversorgung.
- Öffnen Sie beide Gastanks und verwenden Sie ein Paar chirurgische, langstieligen hemostats mit Kunststoffschlauch isoliert, um die Off-Cycle-Gasstrom zu klemmen. Auf diese Weise wird nur ein Gastank zu einer Zeit liefert die 1 l / min Gasstrom pro Kammer.
- Verwenden eines Handauslöser auf präzise Zeitzyklen und die Zeit, um die blutstillende Mittel zwischen den Rohren Schalters anzuzeigen, wodurch der Wechsel der Gasströmung zu den Kammern.
- Nehmen Sie den Abschluss eines jeden Zyklus mit einem Behandlungsprotokoll, wie in Abbildung 1 zur Verfügung gestellt, um zu kennzeichnen Sie alle Schritte in der 2-Stufen, 20-Zyklus-Protokoll.
- Überwachen Sie den Inkubator Temperatur in jedem Zyklus ändern, um sicherzustellen Tiere werden an der vorgesehenen Bereich (33 bis 35 ° C, was die Einstellung auf dem Inkubator, in 37 ° C ergibt, ist) gehalten.
- Pup Tätigkeit während des Protokolls genau überwachen, um sicherzustellen, dass die Tiere vertragen Zyklen ohne sichtbare Not wie Laute, veränderten NiveauGliedmaßentätigkeit oder Walzen.
4. Isolierung und Kultur der Stamm- / Vorläuferzellen aus dem Subventrikularzone
HINWEIS: Die Veränderung der Neurosphäre Bildung nach AIH Vergleich zu Kontrollen ist ein Beispiel für einen Endpunkt, die die Wirksamkeit des Protokolls zeigt den Gewebe- und Zellebene Veränderungen hervorzurufen.
- Um Neurosphären bildenden Zellen zu isolieren, zu entfernen Maus oder Ratte Welpen aus der Kammer unmittelbar nach AIH ist abgeschlossen. Opfern die Tiere nach IACUC Protokolle innerhalb von 30 Minuten von Protokoll-Terminierung.
- Ernten Sie die SVZ Gewebe, legen Sie in die Neurosphärenkultur und Verhalten Standarddurchgang und Expansion von derivativen Neurosphären, wie zuvor im Verfahren Kapiteln 15,16 und einem separaten Video-Protokoll 8 veröffentlicht.
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Representative Results
Die ersten Versuche, basierend auf historischen Daten, wurden unter Verwendung von 1 min Zykluslängen durchgeführt. Auf der Grundlage der nachfolgenden Kalibrierungen in Schritt 2 durchgeführt wird, wurde bestimmt, dass das O 2 in der Kammer, betrug 13% nach 1 min nach dem Spülen und Hypoxie, sie habe eine ähnliche Zeit, um die 21% Grundlinie zurück. Allerdings war eine 2 Minuten-Zyklus aus, um beides zu erreichen 10% Sauerstoff und eine Rückkehr zu 21% während des "Baseline" Zyklus. Anschließend 2 min Zykluslängen verwendet wurden. Das Protokoll Dauer bestand aus 20 Zyklen abwechselnd zwischen Baseline und Hypoxie (80 min Gesamtbehandlungsdauer). A 20 Zyklusdauer war aufgrund von früheren Arbeiten zeigen, dass solche Zyklusdauer ist ausreichend, um zu entlocken Veränderungen in Atem OUTCOME 11 ausgewählt. Mit der beschriebenen Einrichtung (Abbildung 2), Neugeborenen, um AIH zogen hatte keine offensichtlichen Nebenwirkungen und hatte während der 80 nicht Verhaltensweisen suggestive von Schmerzen und Beschwerden zeigenmin-Protokoll. Insbesondere wurde kein sichtbares Apnoe beobachtet, übermäßige Körper oder Kopfbewegungen oder Lautäußerungen. Folgende AIH Subventrikularzone neurale Stammzellen / Vorläuferzellpopulationen als Neurosphären kultiviert für 14 Tage (und auch als adhärente Monolayer-Populationen, Daten nicht gezeigt) zeigen eine beinahe zweifache Zunahme im Durchmesser, zeigen erhöhte Expansion innerhalb jeder Form Kugel (Fig 3). Zellen, die als nächstes in permissiven Bedingungen plattiert sind (dh Abwesenheit von mitogenen Faktoren) zu liefern deutlich beta-3-positiven Zellen (eine Zunahme von <10% auf> 45%), weitergehende neuronale Differenzierung zeigt, im Vergleich zu Zellen von normoxischen geerntet behandelt (Kontrolle) Welpen (Abbildung 4).
Abbildung 1. Dieses akute IH Schaublatt verwendet werden, um Tier dokumentieren und experimentelle Details, eine Checkliste für die vor Beginn und nach Abschluss der IH-Protokoll, und dienen als Tracking-Dokument für genaue tally aller abgeschlossenen Zyklen.
Abbildung 2. intermittierende Hypoxie für Neugeborenen-Nagetieren festgelegt. (A) Incubator zur Umgebung bei 37 ° C zu halten. Plethysmographie Kammer in den Inkubator mit der Kammer Tür offen (B) dargestellt ist, und wieder. (C) mit der rechten, Durchflussmesser, um 1 l / min für jede Kammer eingestellt. Gasstrom wird über die Bias-Flow-Einheit Splittereinheit (Mitte) zu jedem angeschlossenen Kammer (links, im Inkubator) gerichtet ist. (D) Hemostat Kontrolle der Basislinie (Bürokratie) und Hypoxie (gelbes Band) Eingangsleitungen. ank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Steuerneurosphären (A) zeigen einen kleineren Durchmesser als AIH Neurosphären (B). Bilder bei 10X-Objektiv, Maßstab = 100 & mgr; m gemacht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Steuerneurosphären (A) zeigen, weniger Beta-3-Tubulin-positive Neuroblasten als AIH Neurosphären (B). Bilder bei 20X Ziel, Maßstab = 50 & mgr; m gemacht.g "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse plethysmography chambers | Buxco | PLY4211 | |
| Flow meter | Porter | F150 | |
| Bias flow unit | AFPS | ||
| Baseline Gas Mix | Airgas | AIZ300 | Compressed Air |
| Hypoxic Gas Mix | Airgas | X03NI72C2000189 | 10% Oxygen, balance nitrogen |
| Oxygen Meter | Teledyne | AX-300 |
References
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