Genome editing tools such as the CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) system have greatly improved gene targeting efficiency in human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). This manuscript describes a protocol for generating lineage specific hiPSC reporter using CRISPR/Cas system assisted homologous recombination.
जीन लक्ष्यीकरण आधुनिक जैव चिकित्सा अनुसंधान में जीन कार्यों निस्र्पक के लिए एक महत्वपूर्ण तरीका है। हालांकि, मानव कोशिकाओं में लक्षित जीन की दक्षता में एक वांछित दर पर मानव कोशिका लाइनों की पीढ़ी से बचाता है, जो कम कर दिया गया है। पिछले दो साल में इस तरह के CRISPR (interspaced लघु मुरजबंध संबंधी पुनर्प्रसारण नियमित रूप से संकुल) / कैस (CRISPR जुड़े) प्रणाली के रूप में जीनोम संपादन उपकरण द्वारा आनुवंशिक गड़बड़ी की दक्षता में सुधार लाने पर एक तेजी से प्रगति हुई है। इस पांडुलिपि मुताबिक़ पुनर्संयोजन सहायता प्रदान की CRISPR / कैस प्रणाली का उपयोग वंश विशिष्ट मानव प्रेरित स्टेम सेल (hiPSC) संवाददाताओं पैदा करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। , CRISPR / कैस प्रणाली का उपयोग तंत्रिका वंश संवाददाता लाइनों बनाने के लिए आवश्यक घटक प्राप्त करने को लक्षित वैक्टर और एक गाइड RNAs के निर्माण पर ध्यान केंद्रित करने के लिए प्रक्रिया, वर्णित हैं। इस प्रोटोकॉल hiPSCs में मंच स्थापना और उत्परिवर्तन सुधार करने के लिए बढ़ाया जा सकता है।
CRISPR (interspaced लघु मुरजबंध संबंधी पुनर्प्रसारण नियमित रूप से संकुल) / कैस (CRISPR जुड़े) प्रणाली है, साथ में अन्य जीनोम संपादन उपकरण के साथ हाल के वर्षों 1-7 में मानव जीनोम हेरफेर क्रांति ला दी है। CRISPR / Cas9 प्रणाली में प्रमुख घटक एकल गाइड आरएनए (sgRNA) और Cas9 हैं। Cas9 एक शाही सेना निर्देशित प्रकार द्वितीय डीएनए endonuclease है। यह अगले एक protospacer आसन्न मूल भाव के लिए एक विशिष्ट जीनोमिक क्षेत्र में डीएनए डबल असहाय टूटता है (DSBs) बनाने के लिए जिम्मेदार हैं, जो दो nuclease डोमेन, HNH और RuvC है, (पीएएम) 7-10 .An sgRNA की है कि की एक संयुक्त कार्य किया है crRNA और tracrRNA, (जैसे कि स्ट्रैपटोकोकस pyogenes के रूप में) बैक्टीरिया और आर्किया में पहचान की दो अनुकूली उन्मुक्ति आरएनए अणुओं बहिर्जात स्रोतों 9-11 के डीएनए आक्रमण के खिलाफ लड़ने के लिए। उचित रूप से डिजाइन किए हैं और स्तनधारी कोशिकाओं को सह पेश किया, sgRNA लक्ष्य डीएनए के पूरक कतरा साथ पीएएम अनुक्रम, बेस जोड़े पहचानता है, और गाइड और फोड़ना Cas9 transactivatesपीएएम 7 के तुरंत नदी के ऊपर दोनों किस्में डीएनए पर। इसके बाद, मुताबिक़ DSBs की मरम्मत के लिए घटित होगा या गैर मुताबिक़ अंत में शामिल होने (NHEJ) (एक लक्षित कर वेक्टर की उपस्थिति में, एचडीआर) पुनर्संयोजन का निर्देश दिया। ऐसे cDNAs, संवाददाता कैसेट, या एंटीबायोटिक प्रतिरोधी टुकड़े के रूप में transgenes एकीकृत किया जा सकता है, और ट्रांसजेनिक या Knockin लाइनों बनाया है।
CRISPR / Cas9 प्रणाली अत्यधिक कुशल और अपेक्षाकृत विशिष्ट, अवांछित है हालांकि बंद लक्ष्य गतिविधियों 12-15 सूचना दी गई है। बंद लक्ष्य की घटनाओं को कम करने के लिए, Cas9 nickases (Cas9n) भी 9,10,14,16,17 इंजीनियर किया गया है। Cas9n (Cas9 D10A या Cas9 H840A) केवल डीएनए का एक कतरा में एक निक elicits जो दो nuclease डोमेन, में से एक में परिवर्तन के साथ Cas9 एंजाइम है। दोनों किस्में में दरार को प्राप्त करने के लिए, दो sgRNAs दो अलग-अलग किस्में डीएनए के पास loci में अलग से जो कटौती nickases की एक जोड़ी, मार्गदर्शन करने के लिए तैयार कर रहे हैं। "डबल Nicking" रणनीति एक mor की आवश्यकता हैई कड़े पारंपरिक Cas9 मंच से डिजाइन, और जीन संपादन प्रयोगों के लिए उच्च दक्षता और उच्च विशिष्टता दोनों प्रदान करता है।
इस पांडुलिपि मुताबिक़ पुनर्संयोजन सहायता प्रदान की CRISPR / कैस प्रणाली का उपयोग वंश विशिष्ट मानव प्रेरित स्टेम सेल (hiPSC) संवाददाता पैदा करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। CRISPR का उपयोग कर तंत्रिका वंश संवाददाता लाइनों बनाने के लिए आवश्यक घटक प्राप्त करने के लिए कदम / कैस प्रणाली मध्यस्थता जीनोम संपादन को लक्षित वैक्टर और sgRNAs के निर्माण पर ध्यान देने के साथ, वर्णित हैं। इस प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक स्वस्थ व्यक्तियों से और सीएनएस रोगों के साथ रोगियों से ली गई उन सहित कई hiPSC लाइनों में दोहराया गया है। हमारी प्रयोगशाला में लक्षित जीन OLIG2, HB9 (MNX1), NEUROG2, SOX1, ALDH1L1 और SOD1 शामिल हैं। HiPSCs में मुताबिक़ पुनर्संयोजन मध्यस्थता CRISPR / कैस सिस्टम से दक्षता लक्ष्य निर्धारण पिछली रिपोर्टों 1,18,19 के साथ संगत है, जो 20-40% से पर्वतमाला। एक typica की तुलनापारंपरिक जीन को लक्षित प्रयोगों में 1-2% की एल दक्षता को निशाना बनाकर दक्षता में काफी सुधार हुआ है।
Gene targeting is an essential tool in characterizing gene functions. However, the relatively low efficiency demands labor-intensive and time-consuming work. Recently development on genome editing tools such as the CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) system has greatly improved the targeting efficiency. This manuscript describes a protocol for generating lineage specific human induced pluripotent stem cell (hiPSC) reporter using CRISPR/Cas system assisted homologous recombination. Steps …
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Department of Neurosurgery, Memorial Hermann Foundation Staman Ogilvie Fund, the Bentsen Stroke Center at the University of Texas Health Science Center at Houston, and Mission Connect TIRR Foundation.
Name of Material/Equipment | Vendor | Catalog no. |
pStart-K | Addgene | 20346 |
pWS-TK6 | Addgene | 20350 |
pKD3 | Addgene | 45604 |
pKD46 | The Coli Genetic Stock Center, CGSC | 7634 |
PGK-neo-bpA sequence | Addgene | 13442 |
Human BAC clones of target genes | https://bacpac.chori.org | |
JDS246 (Cas9-003), Mammalian codon-optimized streptococcus pyogenes Cas9-3X Flag | Addgene | 43861 |
MLM3636, Human-gRNA-ExpressionVector with U6 promoter | Addgene | 43860 |
pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n(D10A) | Addgene | 42335 |
sgRNA design, ZiFit | http://zifit.partners.org/ZiFiT/ | |
Off target prediction tool CasOT | http://eendb.zfgenetics.org/casot/download.php | |
Perl | http://www.perl.org/get.html | |
NCBI | http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ | |
BLAT | https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start | |
sgRNA Primer synthesis | Sigma | |
One shot Top10 Electrocomp E. Coli Competent cells | Life Technologies | C4040-50 |
AccuPrime Pfx SupperMix | Life Technologies | 12344-040 |
Restriction enzymes | NEB and Life Technologies | |
Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo Researech | D4007 |
DNA quick extraction buffer | Epicentre | QE0905T |
Herculase II Fusion DNA Polymerases | Agilent Technologies | 600675 |
Digestion buffer 2 | New England Biolab | |
6X DNA Loading Dye | Thermo Scientific | R0611 |
TeSR-E8 Kit for hESC/hiPSC Maintenance | Stem Cell Technologies | 05940 |
UltraPure Agarose | Life Technologies | 16500-100 |
50xTAE | Life Technologies | B49 |
Essential 8 medium | Life Technologies | A1517001 |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline without Calcium and Magnesium | Life Technologies | A12856-01 |
D-MEM/F12 with Glutamax | Life Technologies | 10565018 |
D-MEM with Glutamax | Life Technologies | 10566040 |
Fetal Bovine Serum-ES cell qualified | Life Technologies | 10439 |
Knockout serum replacement | Life Technologies | 10828010 |
2-mercaptoethanol 1000X | Life Technologies | 21985023 |
Non Essential Amino Acid | Life Technologies | 11140050 |
Stempro Accutase | Life Technologies | A1110501 |
Dispase | Life Technologies | 17105-041 |
0.25% Trypsin- EDTA solution | Life Technologies | 25200-056 |
Geltrex | Life Technologies | 12760-013 |
ROCK inhibitor Y-27632 | Millipore | SCM075 |
SMC4 reagent | BD | 354357 |
Neomycin resistant MEF | Millipore | PMEF-NL |
Hygromycin resistant MEF | Millipore | PMEF-HL |
G418 (Geneticin) | LifeTechnologies | 11811 |
Hygromycin B | Life Technologies | 10687010 |
FIAU (Fialuridine, 1-2-Deoxy-2-fluoro-ß-D-arabinofuranosyl-5-iodouracil | Moravek Biochemicals and Radiochemicals | M251 |
Electroporator: Gene Pulser Xcell | Bio-Rad | |
0.4 cm electroporation cuvette | Bio-Rad | 165-2088 |
DIG-High prime DNA labeling and detection starter kit II | Roche | 11585614910 |
Hybridization denature solution | VWR | 82021-478 |
PCR DIG probe synthesis kit | Roche | 11636090910 |
DIG wash set | Roche | 11585762001 |
Anti-Digoxigenin (DIG-AP) | Roche | 11093274910 |
CSPD chemiluminescence system | Roche | 11755633001 |
DIG wash and block buffer set | Roche | 11585762001 |
50X TAE buffer | Life Technologies | 24710030 |
Blotting buffer (25 mM Tris pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.1% Tween20) | ||
Hoefer Ultraviolet Crosslinker | Fisher Scientific | 03-500-308 |
Spermidine | Fisher | AC13274-0010 |
Tris HCl 2M ( pH 7.5 ) | VWR | 200064-506 |
Denville Scientific blue bio film 8×10 | Fisher | nc9550782 |
DNA molecular weight marker II ( DIG-labeled ) | Roche | 11218590910 |
Amersham Blotting membrane Hybond-N+ | Roche | 95038-400 |
Pyrex glass drying tray | Fisher | 15-242A |
Kimberly-Clark C-fold paper towels | Fisher | 06-666-32B |
Whatman 3MM paper ( 26X41) | Fisher | 05-713-336 |
Hybridization bag | Roche | 11666649001 |
Hybridization tubes | Fisher | 13-247-300 |
Hybridization oven rotisserie Shake 'n' Stack | Fisher | HBMSOV14110 |