Introduction
Un infarto del miocardio (MI) è definito come l'interruzione di sangue ad una regione del cuore causata dalla occlusione di un'arteria coronaria. Il danno derivante da un MI è dovuto al rimodellamento del tessuto cardiaco vitale in tessuto cicatriziale non funzionale, che diminuisce la capacità del cuore o, più specificamente, il ventricolo sinistro, per battere correttamente. Ciò si traduce in una diminuzione del volume di sangue che può essere consegnato al corpo ad ogni battito cardiaco, chiamata volume ictus, e la percentuale di sangue che viene pompato dal cuore ad ogni battito cardiaco, noto come frazione di eiezione 6. Questi, insieme ad altre funzioni diminuita, aumenta la tensione sul resto del cuore per mantenere la funzione adeguata. Spesso, questo aumento ceppo può diventare così grave che provoca un secondo attacco cardiaco, un fenomeno visto in circa il 10% degli individui 7.
Mentre le pratiche mediche si sono evoluti per trattaresubito dopo un infarto miocardico, nessuna tecnica è stata sviluppata per fermare, rallentare o invertire gli effetti collaterali negativi di rimodellamento tissutale. Terapie con cellule staminali sono emersi come una possibile via per un tale trattamento, tuttavia, nonostante il loro potenziale promettente, le cellule staminali non hanno dimostrato con successo in ambito clinico. Una teoria le loro carenze è l'incapacità di garantire le cellule benefiche rimangono nella sede dell'infarto abbastanza lungo per generare risultati favorevoli 5. È stato dimostrato che non più del 24% di cellule che sono semplicemente iniettato nel sito di infarto sopravvissuto, rimanendo al primo danneggiata sito: 1 giorno post-parto 2. Una possibile prospettiva per affrontare la questione della conservazione delle cellule è quello di sviluppare sistemi di idrogel biocompatibile che incapsulano sia cellule o terapeutica, che possono essere consegnati al sito danneggiato. L'idrogel di scelta in questo protocollo è un poli (glicole etilenico) dimetacrilato grazie al suo impiego precedente incapsulamento della pila procedures, tuttavia, qualsiasi idrogel grado di incapsulamento può essere utilizzato 8. La consegna della patch direttamente al sito di lesione assicura il contatto cellula-tessuto per un periodo prolungato di tempo, aumentando la lunghezza di tempo le cellule possono fornire fattori positivi al miocardio sottostante.
Un collo di bottiglia per l'approccio patch è la difficoltà di aderire il cerotto alla superficie del cuore. Molti gruppi hanno superato questo attraverso una varietà di tecniche, i più diffusi essendo una semplice sutura per legare il costrutto alla superficie cardiaca 9,10. Questo si è dimostrato efficace in un numero di casi in cui il costrutto è fatto di un materiale più rigido, ma non riesce quando tentato su un sistema idrogel, a causa della concentrazione di acqua ad alta e delicata natura del costrutto patch. Per ovviare a questo, abbiamo utilizzato una colla di fibrina sistema adesivo esterno che imita la chimica di formazione del coagulo. Colla di fibrina è stata utilizzata in numerosi studi medici, incLuding lacrime Dura, fistole bronchiali, e trapianto di cornea, mettendo in evidenza la biocompatibilità del prodotto come sigillante ferita 11-13. Inoltre, la fibrina è stato utilizzato per una varietà di scopi cardiache, compreso il trattamento chirurgico delle fratture del ventricolo sinistro e coronarici chirurgia di bypass, tuttavia, il suo uso come una colla adesione per una patch cardiaca non è comunemente usato 14-17. Una semplice formulazione di trombina e fibrinogeno risultati in una colla biocompatibile che può essere posizionato direttamente sulla parte esterna di un cerotto cardiaco esterno, fornendo un sistema di aderenza sostenibili in modo cerotto all'interazione cuore.
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Protocol
La procedura è in piena compatibilità con numero di protocollo IACUC 13302 ed è stato approvato dalla divisione delle risorse animali.
1. Strumento Preparazione
- Autoclavare tutti gli strumenti non monouso utilizzati prima della procedura chirurgica per garantire la sterilità.
- Sterilizzare gli strumenti utilizzati più volte in una sessione con una sterilizzatrice perle di vetro tra usi.
2. Hydrogel Preparazione
- Scongelare e le cellule staminali piatto almeno 24 ore prima della creazione del costrutto idrogel.
- Preparate patch un giorno prima l'intervento chirurgico utilizzando un apparato stereolitografia (o uno strumento simile) che è stato descritto in dettaglio in precedenti pubblicazioni 8,18.
- Per creare l'idrogel, prima di generare una progettazione assistita da computer (CAD) modello del patch desiderato ed esportare il design in formato stereolitografia (STL).
- Creare una soluzione pre-gel per dissolving di poli (etilenglicole) dimetacrilato (PEGDMA) in PBS sterile 1x per ottenere 20% w / v soluzione. Contemporaneamente, sciogliere il fotoiniziatore 1- [4- (2-idrossi etossi) fenil] -2-idrossi-2-metil-1-propan-1-one in DMSO. Aggiungere il fotoiniziatore alla soluzione PEGDMA ad una finale w / v di 0,5%. Direttamente prima reticolazione, aggiungere 100 ml di densità di celle desiderato. Nota: Una densità delle cellule tra 2,0 x 10 5 -2.0 x 10 6 cellule / ml è raccomandato.
- Pipettare la soluzione pre-gel in un piatto al centro della piattaforma SLA ed eseguire il software SLA con la STL formattato disegno già caricato.
- Rimuovere le patch dall'apparato incubare idrogel O / N a modificata mezzo di Eagle Dulbecco (DMEM) supplementato con siero 5% bovino fetale (FBS), 100 U / ml di penicillina, e 100 mg / ml di streptomicina per consentire cellule per regolare per l'ambiente all'interno della patch.
3. Preparazione degli animali e intubati oralesu
- Valutare ogni mouse prima della procedura per garantire che l'animale è in buona salute, come determinato dalle loro abitudini di toelettatura e le interazioni con i loro compagni di gabbia. Nota: femmina 8-10 settimane di età C57BL / 6J sono stati usati per questa procedura, però, può essere utilizzato qualsiasi età mouse o tipo.
- Inserire animali in una camera anestetico ed esporre al 5% isofluorano con un supporto 1 L / min O 2. Monitorare il livello di anestesia da pizzico piedi reflex.
- Una volta che l'animale sia adeguatamente anestetizzato, pesare e metterli sul supporto intubazione.
- Dirigere una sorgente di luce verso cavità toracica dell'animale e utilizzare pinze per ritrarre la superficie della laringe ed esporre le corde vocali. Guidare con attenzione un G angiocath 20 tra le corde vocali, e senza intoppi inserire nella trachea. Controllo corretto inserimento da un movimento meccanico della cavità toracica una volta che il catetere è collegato al piccolo ventilatore animali.
- Regolare le impostazioni di ventilazione a the peso dell'animale base alle linee guida del produttore.
- Una volta intubato, mettere l'animale in posizione supina su una piastra elettrica per evitare l'ipotermia. Assicurarsi che il pad di riscaldamento non superi i 40 ° C. Se necessario, posizionare una barriera tra l'animale e il pad di riscaldamento per ridurre al minimo il rischio di ustioni.
- Rimuovere capelli dal sito chirurgico attraverso l'uso di una crema depilatoria. Sterilizzare il sito da 3 scrub alternati di betadine e il 75% di etanolo per garantire una corretta sterilizzazione. Posizionare un drappo per esporre solo il sito chirurgico e posizionare veterinario pomata sugli occhi per prevenire la secchezza durante la procedura.
4. Procedura chirurgica
- La toracotomia viene eseguita sul lato sinistro dell'animale, quindi, fare una incisione cutanea circa 1 cm a sinistra dello sterno, che corre lungo sterno.
- Utilizzare pinze per separare lo strato muscolare della gabbia toracica sottostante in due fasi. Osservare una DelineLinea DELL'INDICE DI che rappresenta gran pettorale muscoli dell'animale. Sollevare questo muscolo un po ', separarlo dal sottostante muscolo obliquo esterno e ritrarre mediale. Poi, liberare il muscolo obliquo esterno dalla gabbia toracica sottostante nello stesso modo, e retrarre lateralmente, fornendo una vista accessibile del secondo, terzo, e quarto costole.
- Eseguire la toracotomia tra la terza e la quarta costola. Sollevare delicatamente la quarta costola e utilizzare un cauterizer per aprire la cavità toracica tra la terza e quarta costola. Posizionare divaricatori per aprire ulteriormente la cavità ed esporre il cuore.
- Utilizzare pinze per rompere il sottile pericardio del cuore.
- Legare l'arteria coronaria sinistra con una sutura in nylon 8-0 monofilamento. Posizionare la sutura circa 4 mm dalla punta del cuore, direttamente sotto la punta inferiore dell'atrio sinistro. Determinare il corretto posizionamento di sutura da un pallore del miocardio ventricolare ed un aumento delle dimensioni dell'atrio sinistro dopo la Suture è stato legato.
5. Patch Placement e colla
- Mantenere patch a 37 ° C e 5% CO 2 condizioni fino al momento dell'uso.
- Sollevare delicatamente la patch con una spatola ended piana e posizionare delicatamente sulla superficie del cuore, nel sito di infarto.
Nota: per evitare di scivolare fuori dal ventricolo sinistro, la patch può essere tenuto in posizione da mantenere leggermente contatto utilizzando la spatola o la punta di un paio di pinze. - Preparare la colla mescolando un rapporto 4: 1 di fibrinogeno in trombina. Miscelare la soluzione pipettando ripetutamente finché comincia ad addensarsi, di solito entro 1 minuto dopo l'inizio della preparazione.
- Una volta che la viscosità della soluzione raggiunge il livello desiderato, trasferire rapidamente circa 10 ml alla superficie patch. Nota: Il tempo di coagulazione della colla di fibrina è rapido, fornendo una piccola finestra di opportunità per un efficiente trasferimento della colla.
6. sutura
- Chiudere lo strato costola con 3-4 singoli punti staccati.
- Prima chiusura completa dello strato intercostali, inserire una cannula PE-10 nell'incisione per evacuare la cavità toracica dopo la chiusura è completa e ristabilire la corretta pressione intrapleurica.
- Chiudere i muscoli pettorali con 3-4 singoli punti staccati.
- Sigillare lo strato di pelle con una sutura continua.
- Dopo completa chiusura, collegare una siringa 1,0 ml al termine della cannula e utilizzarlo per evacuare la cavità toracica.
- Applicare un tessuto adesivo al sito di incisione per rinforzare il sito di sutura.
Trattamento 7. post-chirurgico
- Dare topi un'iniezione di buprenorfina (0,05-1,0 mg / kg) e carprofen (2,2 mg / kg) per via sottocutanea immediatamente dopo la legatura coronarica e almeno 20 minuti prima del risveglio. Somministrare entrambi i farmaci 6-8 ore dopo l'intervento chirurgico, E poi dare due volte al giorno per un massimo di tre giorni per controllare il dolore e angoscia.
- Monitorare costantemente gli animali fino consapevole e ogni ora, per la prima dopo l'intervento di 4 ore. Eseguire un secondo controllo la sera della chirurgia (2-4 ore più tardi) per somministrare una seconda dose di analgesico.
- Monitorare gli animali ogni giorno dopo il secondo giorno dopo la procedura, fino a quando gli animali appaiono stabili.
8. Analisi di funzionamento del cuore e Istologia
- Eseguire ecocardiografi sui topi 4 settimane dopo la procedura per determinare l'entità del danno a seguito del MI.
- Anestetizzare topi con 4-5% isoflurano in una camera di anestesia per l'induzione di anestesia per inalazione, e poi 2% isoflurano via maschera per l'anestesia di mantenimento.
- Eliminare l'area di esposizione con una crema depilatoria e utilizzare un piccolo animale ultrasuoni per ottenere un 2D M-mode dell'ecocardiografia scansione del cuore pulsante e registrare i parametri funzionali associato con esso.
- Euthanize i topi in una camera di anidride carbonica, quindi raccogliere i cuori dagli animali e posto in una soluzione di formalina al 10% per 24 ore. Dopo 24 ore, trasferire i cuori al 70% di etanolo e conservare a 4 ° C fino al trattamento dei tessuti.
- Elaborare i cuori e li incorpora in blocchi di paraffina.
- Tagliare 5 millimetri sezioni attraverso la regione ventricolare del cuore, partendo all'apice e terminando l'atrio.
- Stain fette con entrambi tricromica di Masson e ematossilina e eosina utilizzando protocolli standard sezionato.
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Representative Results
Durante la procedura chirurgica, legatura dell'arteria coronarica sinistra può essere identificato da un marcato blanching valle dell'arteria occlusa. Come test prima di sposarsi, la sutura può essere stretto per breve tempo per verificare se è in un luogo adeguato. Inoltre, poiché occlusione delle arterie risultati in diminuzione quasi istantanea nella capacità dell'atrio sinistro per battere correttamente, l'atrio sinistro si allargherà in risposta ad un riflusso di sangue nel sistema.
M-mode misurazioni ecocardiografia prese fin da due giorni post-infarto mostrano una cessazione di movimento parete sinistra, indicativa della ricostruzione muscolare. Calcoli qualitativi realizzati con i dati mostrano una diminuzione della frazione di eiezione e gittata sistolica nei cuori infartuati. Al termine della sperimentazione, quando i cuori sono raccolti per scopi istologiche, una chiara dilatazione del ventricolo sinistro può essere visto, insieme con un assottigliamento del ventricolo sinistroparete, e la deposizione di collagene che denota deposizione di tessuto cicatriziale in luogo dei cardiomiociti funzionamento (Figura 1).
Visto anche all'analisi istologica è la presenza del idrogel costruire grazie alla somministrazione del gel di fibrina (Figura 2). Per i nostri scopi, il sistema adesivo deve essere sufficiente per consentire un controllo preciso posizionamento e minimizzare conseguente deflusso in organi circostanti viscoso, ma non abbastanza malleabile interferire con la funzione del cuore. Test preliminari sono stati eseguiti per calcolare la viscosità, tempo di gelificazione, e la rigidità di vari rapporti fibrinogeno / trombina, per determinare la combinazione corretta che si adatta alle nostre esigenze. In vivo analisi è stata effettuata per testare la capacità della colla di fibrina mantenere Adesivo- di tessuti adesione pur consentendo per la funzione cuore pieno (dati non riportati). Va notato che la colla di fibrina non danneggia il miocardio, come dimostra il lack di rimodellamento tissutale o ventricolare assottigliamento al sito (Figura 2). I cardiomiociti rimangono intatte nonostante l'aggiunta di un cerotto sia cardiaco e la sua colla accompagnamento. Inoltre, test di capacità ha confermato che la somministrazione di colla di fibrina sulla superficie esterna di un cerotto idrogel cellulare incapsulare non influenzava la sopravvivenza cellulare nel patch (figura 3).
Figura 1:. Sinistra coronariche Risultati legatura dell'arteria in una diminuzione della funzione cardiaca misurata mediante ecocardiografia M-mode l'ecocardiografia di (a) sana e infartuati (b) i cuori. Cuori infartuati mostrano una chiara mancanza di movimento della parete dove il tessuto vitale è stato sostituito con tessuto cicatriziale. Questo è correlato con una diminuzione misurabile della frazione di eiezione ventricolare sinistra (EF), ictus cardiacaVolume (SV), e gittata cardiaca (CO). Analisi istologica dei sani (c) e (d) infartuati cuori mostra dilatazione del ventricolo sinistro e assottigliamento della parete del ventricolo sinistro del miocardio infartuato, entrambi i segni di rimodellamento tissutale e deposito di tessuto cicatriziale. Immagini istologiche sono fette sezione trasversale catturando il diritto (camera più piccola) ventricoli sinistro (camera più grande) e.
Figura 2:. Applicazione di fibrina fumaria Assicura Patch Adesione al Cuore La patch è posto sulla superficie del cuore, mentre la cavità toracica è esposto durante il procedimento (a). Una volta posizionato, una colla a base di fibrina viene aggiunto sulla parte superiore del cuore e lasciato asciugare. La patch può essere visto chiaramente su sezioni istologiche di tessuto cardiaco che sono stati raccolti in 1 settimana dopo la procedura (b).La dissociazione della patch dalla superficie cardiaca in immagini istologiche è un artefatto del processo di raccolta e sezionamento. I risultati sono coerenti fino a 8 settimane di adesione.
Figura 3: a base di colla di fibrina non danneggia incapsulati tessuti vitalità cellulare è stata misurata mediante analisi MTT 1 settimana dopo la somministrazione di una colla a base di fibrina che utilizzano protocolli descritti in dettaglio in precedenti pubblicazioni 8.. La vitalità delle cellule all'interno del patch non è stata influenzata dall'aggiunta di colla sulla superficie del costrutto.
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Discussion
Con questo approccio al modello MI murino, abbiamo sviluppato un sistema che riduce al minimo il danno alle zone non miocardio che sono associati con altre tecniche MI murine. Queste aree includono danni causati da tracheostomia, il taglio dello strato muscolare, e la rottura delle nervature per esporre la cavità toracica. Crediamo che questi cambiamenti migliorare le generali chirurgici risultato grazie alla cura di mantenere il più delle grandi strutture, comprese le costole e strati muscolari, intatto durante la procedura chirurgica.
Va notato che ci sono alcune limitazioni a questa tecnica, con il più grande è la sua natura richiede tempo, con conseguente solo 8-10 procedure chirurgiche complete in un giorno. Per ovviare a questo, un secondo ventilatore può essere utilizzato, consentendo la procedura da eseguire su due animali contemporaneamente. Inoltre, grandi vasi, come i vasi intercostali einterno arteria toracica, dovrebbe essere evitato quando si esegue la toracotomia. Se vicino a uno di questi vasi, una cauterizer deve essere usato per prevenire le emorragie a causa di una rottura di un'arteria.
Colla di fibrina è noto sia nel laboratorio e impostazioni cliniche, grazie alla sua capacità di aiutare rapidamente in formazione del coagulo, così come la sua capacità di fornire e MSC ospitanti 14-17,19. Per i nostri scopi, colla di fibrina servito come un approccio biocompatibile ad aderire un idrogel a base di acqua costrutto alla superficie del cuore. L'uso di una colla a base di fibrina è dimostrata efficace nel mantenere il costrutto idrogel al sito danneggiato per 8 settimane, con la possibilità di contatto del tessuto di un tempo più lungo. L'utilizzo di questo sistema di aderenza permesso di controllo per il posizionamento del delicato costrutto senza la necessità di suture supplementari che danneggiano il miocardio nonché il costrutto stesso. Abbiamo trovato che la colla stessa è non tossico per le cellule incapsulate unnd non influenza negativamente il tessuto sottostante. L'idrogel e sistema di colla a base di fibrina possono essere applicati a una varietà di altri scopi ingegneria dei tessuti che desiderano cellule o contatto terapeutico per un periodo di tempo prolungato. Inoltre, con l'uso del metodo SLA fabbricazione, disegni e strutture possono essere incorporati nel cerotto per creare un sistema più complesso per la consegna cella 18.
Una battuta d'arresto per l'uso della colla a base di fibrina, è il fatto che più di un ricercatore deve essere presente in sala chirurgica durante il posizionamento di patch e colla aggiunta. È compito del primo ricercatore per assicurarsi che il cerotto rimane in posizione e non si perde nella cavità toracica, mentre il secondo ricercatore mescola la soluzione e la applica alla patch dopo il raggiungimento viscosità adeguata. Per ottimizzare i tempi di consegna colla, si suggerisce che la seconda ricercatore verifica anche e tempi di gelificazione della colla prima del posizionamento patch,poiché la corretta gelificazione della colla è fondamentale per l'adesione di patch.
Ci sono un certo numero di passaggi critici e di errore zone soggette nell'ambito del protocollo, con il primo è l'induzione di infarto miocardico. È indispensabile per verificare eventuali segni, come la scottatura della parete ventricolare sinistra e l'allargamento dell'atrio sinistro, per garantire l'occlusione dell'arteria coronaria sinistra. Questo può essere fatto prima della aggiunta del punto attraversando semplicemente e stringendo la fine delle corde sutura. Se si determina che l'arteria coronaria sinistra non è racchiuso da sutura, la stringa può essere tolto e riapplicato. Una seconda misura fondamentale è quello di continuare a monitorare il tubo di intubazione durante tutta la procedura, per garantire che rimanga all'interno della trachea e non viene tirato fuori metà chirurgia. Infine, per tutta la chirurgia, tutti i tentativi dovrebbero essere fatti per evitare il contatto con i polmoni, come qualsiasi contatto ha il potenziale per portare ad un polmone collassato.Se, durante l'intervento, si verifica collasso polmonare, semplicemente bloccare il tubo di efflusso della intubator fino a 3 sec nel tentativo di rigonfiare tormentate regioni polmoni.
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Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dal US Army Grant (W81XWH-08-1-0701) e una borsa di studio da Carle Foundation Hospital.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Harvard Model 687 Mouse Ventilator | Harvard Apparatus | 55-0001 | |
| Inintech Biosciences LLC Dry Glass Bead Sterilizer | Fisher Scientific | NC9531961 | |
| Leica MZ6 surgical microscope | Leica | ||
| Cautery Kit | Gemini | GEM 5917 | |
| Delicate Forceps - 0.4 mm Tips Angled | Fine Science Tools | 11063-07 | |
| Agricola Retractor - 3.5 cm Spread | Fine Science Tools | 17005-04 | |
| Spring Scissors - 2.5 mm Blades Straight | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Castroviejo Needle Holder - w/Lock Tungsten Carbide 14 cm | Fine Science Tools | 12565-14 | |
| Iris Scissors - Delicate Straight 10.5 cm | Fine Science Tools | 14060-10 | |
| 8-0 monofilament suture | Ethicon | 8730P | |
| 6-0 Silk suture | Ethicon | 639G | |
| Thrombin | Sigma | T7009 | |
| Fibrinogen | Sigma | F3879 | |
| Vetbond Tissue Adhesive | 3M | 1469SB |
References
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