Bir Hidrojel Construct ve Fare Miyokard Enfarktüsü Modeli Therapeutics sunun için Tutkal Yaklaşım Fibrin tabanlı.

Introduction

Bir miyokard enfarktüsü (MI) büyük bir koroner arter tıkanmasına neden olduğu kalp bölgeye kan kesintisiz olarak tanımlanır. Bir MI kaynaklanan hasar nedeniyle ya da daha spesifik olarak, sol ventrikül düzgün yenmek için kalp yeteneğini azaltır fonksiyonel olmayan skar dokusu içine canlı kalp dokusunun yeniden, etmektir. Bu vuruş hacmi olarak bilinir, her kalp atışı, ve ejeksiyon fraksiyonu ⁶ olarak bilinen her kalp atışında kalp dışarı pompalanır, bir kan yüzdesi, gövdeye teslim edilebilir kan hacminde bir azalma ile sonuçlanır. Bunlar, diğer azalmış fonksiyonları ile birlikte, yeterli işlevini korumak için kalbin geri kalanı üzerinde gerginlik artar. Ikinci bir kalp krizi, bireylerin ⁷ yaklaşık% 10'unda görülen bir fenomen neden sık sık bu artış suş çok şiddetli olabilir.

Tıbbi uygulamalar tedavisinde geliştiğini ikenBir MI hemen sonrasında, hiçbir teknik, yavaş, durdurmak veya doku yeniden olumsuz yan etkilerini tersine çevirmek için geliştirilmiştir. Kök hücre terapileri da umut verici etkisine karşın, bununla birlikte, böyle bir tedavi için, olası bir yol olarak ortaya çıkmıştır kök hücreler klinik başarılı kanıtlanmamıştır. Onların eksikliklerini bir teori yararlı hücreler olumlu sonuçlar üretmek için ⁵ yeterince uzun enfarktüsü yerinde kalmasını sağlamak için yetersizliğidir. Bu sadece enfarktüs sitesi içine enjekte edilir hücrelerin en fazla% 24 hayatta kaldı ve zarar görmüş Alanı 1 gün sonrası teslimat ² de kaldığı gösterilmiştir. Hücre tutma, bu konuyu ele için olası bir ihtimal hücreleri veya hasarlı siteye teslim edilebilir terapötikleri ya saklanması biyouyumlu hidrojel sistemleri geliştirmektir. Bu protokolde seçim hidrojel nedeniyle hücre encapsulation pr önceki kullanımına bir poli (etilen glikol) dimetakrilattırocedures Bununla birlikte, kapsülleme yeteneğine sahip herhangi bir hidrojel ⁸ kullanılabilir. yaralanmanın sitesine yama dağıtım hücreleri yatan miyokard yararlı faktörler sağlayabilir süreyi artırmak, uzun bir zaman süresi boyunca hücreden doku teması sağlar.

Yama yaklaşımına bir darboğaz kalp yüzeyine yapışan yama zorluğudur. Birçok grup teknikleri, kalp yüzeyine ^9,10 için yapı kravat basit bir dikiş olmanın en yaygın çeşitli aracılığıyla bunun üstesinden gelmiş. Bu yapı, daha sert bir malzemeden imal edildiği durumlarda, bir dizi başarılı olduğu kanıtlanmıştır, ancak, yüksek su konsantrasyonu ve yama yapısının hassas doğası, bir hidrojel sistemi üzerinde çalışırken başarısız olmuştur. Bunun üstesinden gelmek için, biz pıhtı oluşumu kimyası taklit eden bir fibrin yapıştırıcı dış yapıştırıcı sistemini kullanmışlardır. Fibrin yapıştırıcı inc, çok sayıda tıbbi ameliyatlarında kullanılmaktadırBir yara dolgu ^11-13 olarak ürünün biyouyumluluk vurgulayarak, dura gözyaşları, bronşiyal fistül ve kornea nakli luding. Buna ek olarak fibrin Bununla birlikte, kalp yama için bir yapışma yapıştırıcı olarak kullanımı yaygın olarak ^14-17 kullanılmaz sol ventrikül kopmalar ve koroner arter by-pass ameliyatları cerrahi tedavisi de dahil olmak üzere kalp amacıyla, çeşitli kullanılmıştır. Kalp etkileşim yama sağlamak için uygun bir yapıştırma sisteminin sağlanması, harici kalp yama dışında doğrudan yerleştirilebilir, bir biyo-uyumlu yapıştırıcı Trombin ve fibrinojen sonuçları basit bir formülasyon.

Protocol

Prosedür IACUC protokolü numarası 13302 ile tam uyumluluk içindedir ve hayvan kaynaklarının bölünmesi tarafından onaylandı.

1. Enstrüman Hazırlık

1. Sterilite sağlamak için cerrahi işlem öncesinde kullanılan tüm olmayan tek kullanımlık aletleri otoklavlayın.
2. Kullanımlar arasında bir cam boncuk sterilizatör bir oturumda birden çok kez kullanılan aletleri sterilize edin.

2. Hidrojel Hazırlık

1. Çözülme ve hidrojel yapının oluşturulması için en az 24 saat önce plaka kök hücreler.
2. Önceki yayınlarda ^8,18 detaylı bir şekilde tarif edilmiş bir stereolitografi aparatı kullanılarak cerrahi (ya da benzer bir alet), bir gün önce, yamalar hazırlayın.
3. Hidrojel oluşturmak için, ilk olarak istenen yama bir bilgisayar destekli tasarım (CAD) modeli oluşturmak ve stereolitografik biçimi (STL) tasarımını ihracat.
4. Dissolvin bir ön jel çözeltisi oluşturmakSteril 1x PBS g poli (etilen glikol) dimetakrilat (PEGDMA)% 20 ağırlık / hacim solüsyonu elde etmek için. Aynı zamanda, foto-başlatıcı 1- [4- (2-hidroksi-etoksi) -fenil] -2-hidroksi-2-metil-1-propan-1-on, DMSO içinde çözülür. / 0.5 hacimce% nihai olarak PEGDMA çözeltisine foto-başlatıcı ekleyin. Doğrudan çapraz bağlama öncesi hücrelerin istenen yoğunlukta 100 ml. Not: hücre / ml önerilir ⁶ 10 x -2.0 ⁵ 10 x 2.0 arasında bir hücre yoğunluğuna.
5. SLA platformun ortasında bir çanak içine önceden jel çözümü Pipet ve önceden yüklenmiş STL formatlı tasarımı ile SLA yazılımını çalıştırın.
6. Aletinden yamalar çıkarın ve Dulbecco modifiye edilmiş Eagle ortamı,% 5 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş (DMEM), 100 U / ml penisilin hidrojeller göre O / N inkübe ve hücreler, ayarlamak için 100 mg / ml streptomisin izin vermek için yama içinde çevreye.

3. Hayvan Hazırlama ve Sözlü intubatiüzerinde

1. Onların kafes arkadaşları ile onların tımar alışkanlıkları ve etkileşimleri belirlenen hayvan, sağlık durumunun iyi olduğundan emin olmak için prosedür öncesinde her fare değerlendirin. Not: Bayan 8-10 haftalık C57BL / 6J fareler bu işlem için kullanılan, ancak, herhangi bir fare yaş ve tipi kullanılabilir.
2. Bir anestezik odasına hayvanları yerleştirin ve 1 L / dk O ₂ desteği ile% 5 isofluorane maruz. Ayak tutam refleks ile anestezi düzeyini izleyin.
3. Hayvan düzgün uyuşturulduktan sonra, tartmak ve entübasyon standı üzerine koyun.
4. Hayvanın göğüs boşluğuna doğru bir ışık kaynağı yönlendirin ve ses tellerini laringeal yüzeyini geri çekin ve ortaya çıkarmak için forseps kullanabilir. Dikkatle ses tellerinin arasında 20 G angiocath rehberlik ve sorunsuz trakea içine yerleştirin. Kateter küçük hayvan ventilatöre bağlı bir kez göğüs boşluğunun mekanik hareketi ile uygun ekleme algılar.
5. Inci havalandırma ayarlarını yapınüreticinin yönergelerine göre hayvanın e ağırlığı.
6. Entübe sonra hipotermi önlemek için ısıtma pedi üzerinde yatar pozisyonda hayvan yerleştirin. Isıtma yastığı 40 ° C'yi aşmaması emin olun. Gerekirse, yanık şansını en aza indirmek için hayvan ve ısıtma yastığı arasında bir bariyer yerleştirin.
7. Bir epilasyon kremi kullanılarak cerrahi bölgeden saç çıkarın. Doğru sterilizasyon sağlamak için Betadin ve% 75 etanol 3 alternatif scrubs tarafından siteyi sterilize edin. Sadece cerrahi siteyi açığa ve işlem sırasında kuruluğunu önlemek için gözleri veteriner merhem yerleştirmek için bir örtü yerleştirin.

4. Cerrahi Prosedür

1. torakotomi nedenle, sternum uzunluğu çalışan sternum sol, bir cilt kesisi yaklaşık 1 cm yapmak, hayvanın sol tarafında yapılır.
2. Iki adımda yatan göğüs kafesi arasında kas tabakası ayrı forseps kullanın. Bir Deline'a gözlemleyinhayvan pektoralis majör kaslarını gösteren ating hattı. Altta yatan dış eğik kas ayırmak ve mediale geri, biraz bu kası kaldırın. Ardından, aynı şekilde yatan göğüs kafesi dış oblik kas özgür ve ikinci, üçüncü ve dördüncü kaburga bir unobscured görünüm sağlayan, yanal geri çekin.
3. Üçüncü ve dördüncü kaburga arasındaki torakotomi gerçekleştirin. Yavaşça dördüncü kaburga kaldırın ve üçüncü ve dördüncü kaburgalar arasındaki göğüs boşluğunu açmak için bir cauterizer kullanın. Ayrıca boşluğu açmak ve kalp maruz Ekartörleri yerleştirin.
4. Kalbin ince perikard rüptürü için forseps kullanabilir.
5. Bir 8-0 monofilament naylon sütür ile sol koroner arter Arter. Doğrudan sol atrium alt ucu altında, yaklaşık 4 mm kalbin apeks gelen dikiş yerleştirin. Ventriküler miyokard bir blanching ve Sutu sonra sol atrium boyutunda bir artış ile doğru dikiş yerleştirme belirleyinYeniden bağladı edilmiştir.

5. Patch Yerleştirme ve Tutkal

1. Kullanılana kadar _CO2 şartları, 37 ° C'de tutun yamalar ve% 5.
2. Yavaşça düz uçlu spatula ile yama kaldırın ve yavaşça infarktüsü yerinde, kalbin bir yüzeye yerleştirin.
   Not: Sol ventrikül kaymasını önlemek için, yama hafifçe spatula ya da forseps bir çift ucu kullanarak kişiyi koruyarak yerinde tutulabilir.
3. Trombin, fibrinojenin: 1 oranını 4 karıştırılarak tutkal hazırlayın. Bu hazırlık başladıktan sonra genellikle 1 dakika içinde, kalınlaştırmak başlayana kadar tekrarlanan pipetleme çözüm karıştırın.
4. Çözelti viskozitesi istenen seviyeye ulaştığında, hızla yama yüzeyine yaklaşık 10 ml aktarın. Not: fibrin yapıştırıcı pıhtılaşma zamanı hızlıdır, tutkal verimli transferi için küçük bir fırsat penceresi sağlar.

6. Dikiş

1. 3-4 ayrı kesintiye dikişlerle kaburga katmanı kapatın.
2. Interkostal katmanın tam kapanmasından önce, kapatma işlemi tamamlandıktan sonra göğüs boşluğuna tahliye ve uygun intraplevral basınç yeniden kurmak için kesi içine PE-10 kanül yerleştirin.
3. 3-4 ayrı kesintiye dikişlerle göğüs kasları kapatın.
4. Sürekli dikiş ile cilt katmanı mühür.
5. Tam kapatılması sonrasında, kanül sonuna 1.0 ml şırınga takmak ve göğüs boşluğunu tahliye için kullanabilirsiniz.
6. Dikiş sitesini güçlendirmek için kesi sitesine doku yapıştırıcısı sürün.

7. Post-cerrahi tedavi

1. Fareler buprenorfin (0.05-1.0 mg / kg) ve deri altından hemen önce canlanma koroner ligasyon ve en az 20 dakika, aşağıdaki karprofen (2.2 mg / kg) enjeksiyonu ver. Her iki ilaç da ameliyattan sonra 6-8 saat yönetmeVe sonra ağrı ve sıkıntı kontrolü üç gün süreyle günde iki kez vermek.
2. Sürekli ilk 4 saat aşağıdaki ameliyat için bilinçli ve her saatte kadar hayvanları izlemek. Analjezik ikinci bir dozunu vermek için ikinci bir sağlık kontrolü ameliyat (2-4 saat sonra) gecesini gerçekleştirin.
3. Hayvanlar kararlı görünen kadar prosedürü izleyerek ikinci günden sonra her gün hayvanları izleyin.

Kalp Fonksiyonu ve Histoloji 8. Analiz

1. MI Aşağıdaki hasarın boyutunu belirlemek için prosedür izlenerek fareler 4 hafta echocardiographs gerçekleştirin.
2. Inhalasyon anestezi indüksiyonu için bir anestezi odasının içinde% 4-5 izofluran ile fareler anestezi ve bakım anestezi için yüz maskesi aracılığıyla daha sonra% 2 izofluran.
3. Bir tüy dökücü krem ​​ile görüntüleme alanını temizleyin ve kalpte bir 2B M-mod ekokardiyografi tarama elde etmek için küçük bir hayvan ultrason kullanımı ve fonksiyonel parametreler asso kayıtonunla anılmaktadır.
4. Daha sonra 24 saat boyunca bir% 10 formalin çözeltisi içinde hayvanlar ve yerden kalpleri toplamak, bir karbon diyoksit odasında fareler öldürülür. 24 saat sonra,% 70 etanol kalpleri aktarmak ve doku işlenene kadar 4 ° C'de tutun.
5. Kalpleri işlemek ve parafin bloklar onları gömmek.
6. Apeks başlayan ve atrium biten, kalbin ventriküler bölgesi boyunca 5 mm bölümleri kesin.
7. Leke Masson trikrom ve hematoksilen ve standart protokoller kullanılarak eozin leke hem dilimleri kesitli.

Representative Results

Cerrahi işlem sırasında, sol koroner arter ligasyonu bir Tıkalı arterin alt beyazlatma işaretlenmiş tarafından tespit edilebilir. Düğüm atarak önce bir test olarak, dikiş uygun yerde olup olmadığını kontrol etmek için kısa bir süre sıkılır olabilir. Ayrıca, düzgün yenmek için sol atrium yeteneği neredeyse anlık azalma arter sonuçlarının tıkanması beri, sol atrium sisteminde kan geri akışının cevaben büyütmek olacaktır.

M-mod ekokardiyografi ölçümleri sonrası enfarktüs kas yeniden göstergesidir sol duvar hareketinin durdurulması, göstermek gibi erken 2 gün olarak alınmıştır. Verilerinden yapılan niteliksel hesaplamalar enfarkte kalplerinde bir ejeksiyon fraksiyonunda azalma ve inme hacmini göstermektedir. Kalpleri histolojik amaçlar için toplanan deney, bitiminde, sol ventrikül net bir dilatasyon sol ventrikül bir incelme ile birlikte görülebilirDuvar ve kardiyomiyositlerde (Şekil 1) işleyen yerine skar dokusu birikimi gösterir kollajen birikimi.

Ayrıca (Şekil 2) histolojik analiz üzerine hidrojel varlığı fibrin jel idaresi sayesinde inşa olduğu görülmektedir. Bizim amaçlarımız için, yapıştırıcı sistem, kalp fonksiyonu ile müdahale hassas yerleştirme denetime izin ve çevresindeki organlara sonraki ikinci tur en aza indirmek için yeterli viskoz, ama yeterince uysal olmamalıdır. Ön testler gereksinimlerine uygun kombinasyonunu belirlemek amacıyla, viskozite, jelleşme süresi ve çeşitli fibrinojen / trombin oranları sertliğini hesaplamak için yapıldı. In vivo analiz patch- korumak için fibrin yapıştırıcı kabiliyetini test etmek için gerçekleştirilmiştir için doku yapışması hala tam kalp işlevi için izin verirken (veriler gösterilmemiştir). Bu l kanıtladığı fibrin yapıştırıcı, miyokardiyumu zarar vermedi unutulmamalıdıryerinde doku yeniden veya ventriküler inceltme ack (Şekil 2). Kardiyomiyositlerde kardiyak yama ve beraberindeki tutkal hem eklenmesi rağmen değişmeden kalır. Buna ek olarak, canlılık testi, bir hücre içine alıcı hidrojel yama dış yüzeyine fibrin yapıştırıcı uygulaması (Şekil 3) yama içinde hücre yaşamını etkilemediğini doğruladı.

Şekil 1:. (A) sağlıklı ve enfarkte (b) kalplerin Kalp Fonksiyonu bir azalış Sol Koroner Arter Ligasyonu Sonuçları Ekokardiyografi ile ölçülür M-mod ekokardiyografi. Enfarkte kalpler canlı doku skar dokusu ile değiştirilmiştir duvar hareketinin açık bir eksikliği gösteriyor. Bu sol ventrikül ejeksiyon fraksiyonunda bir ölçülebilir bir azalma (EF), kalp inme ile ilişkilidirhacmi (SV) ve kardiyak output (CO). Sağlıklı (C) ve enfarkte (d) kalplerin histolojik analiz sol ventrikül ve enfarkte miyokardın sol ventrikül duvar incelmesi, doku tekrar modellemesinde ve yara dokusu birikmesi iki işaretlerinin dilatasyon gösterir. Histolojik görüntüleri sol (büyük hazne) ve sağ (küçük odacık) ventriküller yakalama kesit dilimleri vardır.

Şekil 2:. Heart fibrin Baca Sağlar yama yapıştırma uygulaması göğüs boşluğu işlemi sırasında maruz kaldığı sürece yama kalbin yüzeyi üzerine yerleştirilir (a) dır. Okuyun sonra, bir fibrin tabanlı yapışkan, kalbin üst kısmında ilave edildi ve kurumaya bırakılır. Yama açıkça 1 hafta sonra (B) prosedürüne toplandı kalp dokusunun histolojik bölümler üzerinde görülebilir.Histolojik görüntülerde kalp yüzeyinden yama Ayrılma toplanması ve kesit sürecinin bir eserdir. Sonuçlar yapışma kadar 8 hafta boyunca tutarlıdır.

Şekil 3: fibrin bazlı tutkal Encapsulated dokulara zarar Not Hücre canlılığı Önceki yayınlarda ^8'de detaylı olarak tarif edilen protokoller kullanılarak bir fibrin tabanlı yapışkan uygulandıktan sonra 1 hafta MTT analizi ile ölçülmüştür.. yama içinde hücrelerin canlılığı yapının yüzeyine tutkal ilave edilmesi ile etkilenmemiştir.

Discussion

Fare MI modeline Bu yaklaşımla, diğer kemirgen MI teknikleri ile ilişkili olmayan miyokard alanlara zarar en aza indiren bir sistem geliştirdik. Bu alanlar trakeostomi yol açtığı hasarı, kas tabakasının kesilmesi, ve göğüs boşluğunu maruz kaburga kırılması sayılabilir. Biz bu değişikliklerin cerrahi işlem sırasında olduğu gibi, kaburga ve kas tabakaları dahil, önemli yapıların çok sağlam tutmak için alınan bakım genel cerrahi sonuç sayesinde artırmak inanıyoruz.

Bu bir günde sadece 8-10 tam cerrahi prosedürlerinde elde edilen bazı sınırlamalar büyük olması da zaman alıcı bir doğa ile bu tekniğe olduğu not edilmelidir. Bunun üstesinden gelmek için, ikinci bir havalandırma işlemi aynı anda, iki hayvan üzerinde gerçekleştirilebilir için izin kullanılabilir. Ek olarak, interkostal damarlar gibi önemli gemiler, vetorakotomi yaparken iç torasik arter, kaçınılmalıdır. Bu damarların birinin yakınında ise, cauterizer rüptüre artere üzerinden kanamayı önlemek için kullanılmalıdır.

Fibrin yapıştırıcı hızlı pıhtı oluşumuna yardımcı kabiliyeti, hem de potansiyeli sağlamak için ve bir ev sahibi MSC ^14-17,19 laboratuar ve klinik ortamlarda hem sayesinde bilinmektedir. Bizim için, fibrin yapıştırıcı su bazlı hidrojel kalp yüzeyine inşa yapışan bir biyo-uyumlu bir yaklaşım olarak görev yaptı. bir fibrin bazlı yapıştırıcı kullanımı uzun bir miktarda doku temas imkanı ile, 8 haftaya kadar hasarlı yerinde hidrojel yapısı tutarak başarılı olduğunu kanıtlamıştır. Bu yapışma sisteminin kullanımı miyokardiyumu yanı sıra yapı kendisine zarar ek sütürler gerek kalmadan hassas yapının yerleştirilmesi için kontrolünü sağladı. Bu tutkalın kendisi kapsüllenmiş hücreler, toksik olduğunu bulduknd olumsuz altta yatan dokuyu etkilemez. hidrojel ve fibrin bazlı tutkal sistemi uzun bir süre boyunca bir hücre ya da terapötik temas arzu diğer doku mühendisliği çeşitli amaçlar için uygulanabilir. Ayrıca, SLA, imalat yöntemi kullanılması ile, tasarım ve yapı hücre teslim ¹⁸ için daha karmaşık bir sistem oluşturmak için yama içine dahil edilebilir.

Fibrin esaslı yapıştırıcı kullanımı için bir gerileme fazla bir araştırmacı yama yerleştirme ve tutkal ilave edilmesi sırasında cerrahi odasında mevcut olmalıdır olmasıdır. İlk araştırmacının işi ikinci araştırmacı çözümü karıştırır ve uygun viskozite ulaşıldıktan sonra yama uygular ise yama, yerinde kalır ve göğüs boşluğunda kaybolmak değil emin olmaktır. Tutkal teslim zamanlamasını optimize etmek için, o, ikinci araştırmacı da yama yerleştirme öncesinde yapıştırıcı jelleşme test ve saatleri ileri sürülmektedirtutkal uygun jelasyonu beri yama yapışması için kritik öneme sahiptir.

İlk miyokard infarktüsü indüksiyon olmak protokolü kapsamında önemli adımlar ve hata eğilimli alanlarda bir dizi vardır. Bu sol koroner arter tıkanıklığı sağlamak için, bu tür sol ventrikül duvarının blanching ve sol atrium genişlemesi olarak belirtileri, kontrol etmek için şarttır. Bu sadece geçiş ve dikiş dizeleri sonuna sıkarak dikiş ilavesinden önce yapılabilir. Sol koroner arter sütür çevrili olmadığı tespit edilirse, dize alınabilir ve yeniden başvurdu. İkinci kritik önlem o trakea içinde kalır ve orta ameliyat çıkardı almaz emin olmak için, işlem boyunca entübasyon tüpü izlemeye devam etmektir. Son olarak, ameliyat boyunca, tüm girişimler herhangi bir kişi çökmüş bir akciğere neden potansiyeline sahip olarak, akciğerler ile temasını engellemek için yapılmalıdır., Ameliyat sırasında akciğer çöken oluşur basitçe amacıyla en fazla 3 saniye intubator çıkışı tüpü engellerseniz akciğerlerin sorunlu bölgelerini yeniden şişirmek.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Harvard Model 687 Mouse Ventilator	Harvard Apparatus	55-0001
Inintech Biosciences LLC Dry Glass Bead Sterilizer	Fisher Scientific	NC9531961
Leica MZ6 surgical microscope	Leica
Cautery Kit	Gemini	GEM 5917
Delicate Forceps - 0.4 mm Tips Angled	Fine Science Tools	11063-07
Agricola Retractor - 3.5 cm Spread	Fine Science Tools	17005-04
Spring Scissors - 2.5 mm Blades Straight	Fine Science Tools	15000-08
Castroviejo Needle Holder - w/Lock Tungsten Carbide 14 cm	Fine Science Tools	12565-14
Iris Scissors - Delicate Straight 10.5 cm	Fine Science Tools	14060-10
8-0 monofilament suture	Ethicon	8730P
6-0 Silk suture	Ethicon	639G
Thrombin	Sigma	T7009
Fibrinogen	Sigma	F3879
Vetbond Tissue Adhesive	3M	1469SB