Summary
Nous avons développé un dépliée hippocampe in vitro qui préserve CA1-CA3 réseau de neurones. En combinaison avec le réseau de pénétration de micro-électrode, l'activité neuronale peut être contrôlée dans les deux orientations longitudinale et transversale. Cette méthode présente des avantages par rapport aux préparations de tranche de l'hippocampe que la propagation dans tout l'hippocampe peuvent être enregistrées simultanément.
Abstract
Ce protocole décrit un procédé pour la préparation d'une nouvelle préparation in vitro de l'hippocampe plat combiné avec une matrice de micro-usiné pour cartographier l'activité neuronale dans l'hippocampe. La préparation de l'hippocampe transversale de tranche est la préparation la plus courante de tissus pour étudier hippocampe électrophysiologie. Une tranche hippocampique longitudinale a également été élaboré afin d'enquêter sur les connexions longitudinales dans l'hippocampe. Les hippocampe de souris intactes peuvent également être maintenues in vitro parce que son épaisseur permet une diffusion adéquate de l'oxygène. Cependant, ces trois préparations ne fournissent pas un accès direct à la propagation de neurones depuis une partie du tissu est manquant ou plié. L'hippocampe intacte déplié fournit à la fois transversale et liaisons longitudinales dans une configuration à plat pour un accès direct au tissu d'analyser toute l'étendue de la propagation du signal dans l'hippocampe in vitro. Afin de surveiller efficacement l'activité neuronale de til couche de cellules, une coutume fait pénétrer réseau de micro-électrodes (PMEA) a été fabriqué et appliqué à l'hippocampe dépliée. Le PMEA avec 64 électrodes de 200 um de hauteur pourrait enregistrer l'activité neuronale au fond de l'hippocampe de souris. La combinaison unique d'une préparation hippocampique déplié et la PMEA fournit un nouvel outil in vitro pour étudier la vitesse et la direction de propagation de l'activité neuronale dans les régions bidimensionnelles CA1-CA3 de l'hippocampe avec un signal haute par rapport au bruit.
Introduction
La compréhension de la conduction nerveuse ou la propagation des signaux neuronaux est essentielle pour la détermination du mécanisme neuronal de la communication à la fois le fonctionnement normal et des états pathologiques dans le cerveau 1-3. L'hippocampe est l'une des structures les plus étudiés dans le cerveau, car il joue un rôle fondamental dans plusieurs fonctions cérébrales comme la mémoire, et le suivi spatial et est impliqué dans plusieurs changements pathologiques qui influent considérablement le comportement ainsi 1,6. Bien que, l'hippocampe présente une organisation complexe, les différents éléments de sa structure peuvent être facilement identifiés et accessibles dans la préparation de tranches 4-6. Dans le sens transversal de l'hippocampe, l'activité neuronale est connu pour se propager à travers la voie de tri-synaptique qui comprend le gyrus denté (DG), CA3, CA1 andsubiculum 4,5. On croit que la transmission synaptique et la conduction axonale jouent un rôle majeur pour communicatidans ce circuit transversal 4,6. Cependant, la propagation d'un signal neuronal a lieu dans les deux directions transversale et longitudinale 4,6. Cela implique que l'hippocampe ne peut pas être entièrement étudiée en utilisant des préparations de tranche qui limitent l'observation à une direction de propagation particulier quatre. La tranche longitudinale a été développé pour étudier les voies axonales long de l'axe longitudinal 5. Les chercheurs ont observé gamma et thêta oscillations spécifiques comportement principalement le long de la transversale et axes longitudinaux respectivement 6. Ces comportements ont été étudiés séparément, mais l'accès simultané à deux sens est crucial de comprendre ces comportements. Même avec le développement de la préparation de l'hippocampe intact, il est difficile de contrôler la propagation à travers le tissu en raison de l'ensemble de la structure repliée de l'hippocampe 4. L'hippocampe dépliée permet d'accéder aux neurones emballéssous une forme d'une couche de cellules à deux dimensions 7,8 plat.
Par déplier le gyrus denté (DG) (figure 1), l'hippocampe adopte une forme aplatie avec une configuration rectangulaire dans laquelle les deux transversal et liaisons longitudinales restent intactes avec la couche de cellules pyramidales disposé dans une feuille à deux dimensions contenant à la fois CA3 et CA1, laissant un morceau plat de tissu neural qui peut être utilisée pour étudier la propagation neural (figure 2) 8. L'activité neuronale peut alors être contrôlée avec des pipettes individuelles de verre, des réseaux de microélectrodes, des électrodes de stimulation, ainsi que des colorants sensibles à la tension (VSD) 3,7,8. En outre, l'indicateur de tension génétiquement codé à partir de souris transgéniques peut être utilisé pour suivre le motif de propagation neuf.
La configuration à plat du réseau hippocampique déplié est bien adapté pour enregistrement optique de la méthode mais aussi pour une matrice de microélectrodes. Most des tableaux disponibles dans le commerce sont fabriqués avec un profil plat ou à faible électrodes et peut enregistrer l'activité neuronale dans les deux tranches de tissu et des neurones en culture de 10 à 12. Cependant, le rapport signal-sur-bruit (SNR) diminue lorsque les signaux sont obtenus à partir d'un tissu intact depuis le soma des neurones sont situés plus profondément dans le tissu. matrices d'électrodes de microélectrodes avec des rapports d'aspect élevés sont nécessaires pour améliorer le SNR.
A cet effet, un réseau de microélectrodes de pénétration (PMEA) a été développé dans notre laboratoire, et fournit la capacité de la sonde directement dans le tissu 64 par l'insertion des pointes d'un diamètre de 20 um et 200 um de hauteur dans l'hippocampe 7,13 dépliées . Ce réseau de microélectrodes a SNR plus élevé par rapport à la formation d'image de colorant sensibles à la tension et le SNR reste stable lors d'une expérience 7,13. La combinaison de la préparation de l'hippocampe déplié et la PMEA fournit une nouvelle façon d'investirIgate la propagation neural sur un plan à deux dimensions. Des expériences utilisant cette technique ont déjà donné des résultats significatifs sur les mécanismes de propagation du signal neuronal dans l'hippocampe lequel l'activité neuronale peut se propager indépendamment des synapses synaptiques ou électriques 7.
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Protocol
NOTE: Animal protocoles expérimentaux ont été examinés et approuvés par le Comité de protection des animaux et l'utilisation institutionnelle à l'université. Souris CD1 des deux sexes à l'âge de P10 à P20 sont utilisés dans cette étude.
1. Les solutions pour la chirurgie expérimentale et enregistrement
- Préparer normale tampon liquide céphalo-rachidien artificiel (aCSF) contenant (mM): NaCl 124, KCl 3,75, KH 2 PO 4 1,25, MgSO 4 2, NaHCO 3 26, dextrose 10, et CaCl 2 2. Utiliser cette aCSF normale pour la récupération des tissus après dissection, ainsi que pour le système de lavage au début de l'expérience.
- Préparer aCSF saccharose qui est utilisé lors de la dissection de l'hippocampe et contient (mM): Saccharose 220, KCl 2,95, NaH 2 PO 4 1.3, MgSO 4 2, NaHCO 3 26, dextrose 10, et CaCl 2 2. Afin d'induire une activité épileptiforme dans la préparation de tissu hippocampique intact, ajouter 4-aminopyridine (4-AP) à la normale à aCSFla concentration de 100 uM.
2. Procédure chirurgicale pour la Hippocampus Préparation Intact
- Déposez isoflurane (1 ml) dans la chambre au fond d'un bocal en verre de dessiccateur (n ° 1 des matières et équipements spécifiques) et utilisez une serviette en papier ordinaire pour couvrir la surface de l'étage inférieur si l'animal ne reçoit pas en contact avec le liquide. Ensuite, placez la souris CD1 dans le bocal et fermer le couvercle. Gardez l'animal dans le bocal fermé pendant environ 1 min à 2 min. Lorsque la fréquence de la respiration est d'environ un par seconde, enlevez la souris de la jarre.
- Placez la souris sur la scène de la chirurgie et de décapiter avec des ciseaux appropriés. Immédiatement après la décapitation, placer la tête dans la glace-froid (3-4 ° C), le saccharose oxygénée aCSF pendant environ 30 secondes.
- Utilisez des ciseaux fins (No.5 des matières et équipements spécifiques) pour enlever la peau sur le dessus du crâne et de couper le crâne long de la ligne médiane de la tête ainsi qu'à deux extrémités près le tempolobe ral. Utilisez une pince (n ° 6 des matières et équipements spécifiques) pour peler le crâne coupée vers chaque côté de la tête afin d'exposer le cerveau.
- Insérez un laboratoire micro spatule (n ° 8 des matières et équipements spécifiques) dans l'espace entre les lobes pariétaux du cerveau et du crâne, retirez avec précaution le cerveau à partir du bas du crâne, puis déposez-le sur un glacée préparée (3 -4 ° C) étape chirurgicale recouverte de papier filtre humide (n ° 2 dans les Matériaux et équipements spécifiques). Retirer le cervelet avec une lame refroidissement à la glace et on sépare les deux hémisphères en coupant la ligne médiane du cerveau. Ensuite, placer les deux hémisphères séparés dans un bécher rempli du saccharose aCSF glacée barboter avec 95% O 2/5% CO 2.
- Prenez la moitié de l'hémisphère et de place sur la scène de papier filtre glacée. Placez des serviettes en papier réguliers ou papier filtre autour du cerveau à sucer la solution supplémentaire. Utilisez deux outils de pipette en verre polies au feu (n ° 10 dans les matériaux etÉquipement) pour séparer le cortex du reste de la partie centrale du cerveau.
- Après l'hippocampe est exposée à l'intérieur du cortex et de mettre sur la scène glacée, placez deux ou trois gouttes de glacée de saccharose aCSF sur le tissu, puis enlever la solution supplémentaire autour de l'hippocampe. Couper les connexions avec le cortex à deux extrémités de l'hippocampe. Puis, disséquer l'hippocampe sur le cerveau avec le feu poli outils de verre et retirer la partie restante du cerveau.
- Séparer l'ensemble hippocampe avec son côté tourné vers le haut et alveus hippocampique sillon vers le bas. Déposer rapidement deux ou trois gouttes de glacée de saccharose aCSF sur le tissu nouveau et retirer la solution supplémentaire autour du tissu en utilisant un morceau de serviette en papier. Utilisez un outil de verre polies au feu de tourner sur l'ensemble hippocampe pour exposer le sillon (figure 1B, C).
- Sous un microscope optique normale, insérer une aiguille de verre sur mesure (n ° 11 dans Materi spécifiqueals et matériel) dans une extrémité du sillon et couper les connexions de fibres, de gyrus denté (DG) à subiculum ou le champ CA1, le long de la direction de sillon (figure 1C). Appliquer une lame glacée pour couper les extrémités du septum et temporelles de l'hippocampe si nécessaire. Insérez une boucle de fil métallique sur mesure (n ° 12 des matières et équipements spécifiques) dans le sillon de coupe et tirez sur la DG loin du tissu tout en maintenant la fin subiculum / CA1 de l'hippocampe par un outil feu de verre poli (figure 1D) .
- Suite à la procédure qui se déroule au-dessus, ajouter deux ou trois gouttes de saccharose aCSF glacée sur le tissu et retirer la solution supplémentaire autour du tissu. Ensuite, couper l'hippocampe dépliée avec la lame glacée sur les bords (figure 1E) et placez la préparation avec une spatule dans la chambre de récupération rempli de aCSF normale et barboter avec 95% de O 2/5% de CO 2 à la température ambiante (environ 25 ° C). Laisserle tissu de l'hippocampe dépliée pour récupérer environ 1 heure avant de le placer dans la chambre d'enregistrement.
- Prenez l'autre hémisphère du cerveau et l'utiliser pour passer par étapes de 2,5 à 2,9. Habituellement, prendra environ 1-2 min pour terminer toute la procédure se dérouler un seul hippocampe et déposez glacée de saccharose aCSF continuellement pour maintenir le tissu oxygénée et hydratée.
Configuration 3. Système Expérimental
- Collez un PMEA fabriqué sur mesure sur un paquet réseau de grille de broches (PGA) et utiliser micro soudure de fils pour connecter chaque pad d'un seul microélectrodes au pad d'une broche sur l'emballage (figure 3B). Ensuite, insérez le paquet dans la prise sur une carte de circuit sur-mesure 13.
- Se connecter individuellement chaque microélectrodes à ses filtres passe-bande avec fréquence de coupure de 1 Hz à 4 KHz et amplificateurs avec un gain de 100 sur la carte de circuit sur mesure 13. Numériser la sortie analogique de la carte de circuit par un A / D convErting système, et acquérir et stocker les données sur un ordinateur.
- Colle une chambre d'enregistrement en matière plastique sur mesure autour de la matrice avec des tubes d'entrée et de sortie pour l'écoulement de solution (Figure 4A). Utilisation d'au moins deux bouteilles de maintenir des solutions différentes dans le système, et joindre et de contrôler la tubulure de sortie des bouteilles par une vanne à trois. Connecter la sortie de la vanne à trois à un système de tuyauterie avec une chambre de perfusion IV qui guide la solution dans la chambre d'enregistrement.
- Entre le tri-vanne et l'entrée de la chambre d'enregistrement, ajouter un élément chauffant électrique pour chauffer la solution à une température contrôlée (35 ° C) avant que la solution est guidée vers la chambre d'enregistrement. Attacher la sortie de la chambre d'enregistrement à un tube à vide pour recueillir la solution dans un tube à vide relié ballon. Ne importe quelle solution recycler dans toute expérience dans cette étude.
4. Placer le déplié Hippocampus sur la PMEA pour enregistrer l'activité neurale
5. Retrait de laTissu de la PMEA Après une expérience
- Contrôler l'ancre pour tissu par un micromanipulateur et soulever progressivement le tissu de la chambre d'enregistrement. Arrêtez les deux entrée et de sortie pour arrêter l'écoulement dans la chambre d'enregistrement. La chambre d'enregistrement devrait être plein avec une solution ou ajouter quelques gouttes de solution pour remplir la chambre si la chambre d'enregistrement ne est pas plein.
- Utilisez un petit pinceau pour soulever chaque coin du tissu. Si le tissu ne est pas flottant dans la solution, puis utiliser le tube à vide pour sécher la chambre attentivement avec le tissu toujours assis sur le tableau. Ensuite, ouvrez soigneusement l'entrée pour remplir progressivement la chambre et fermer l'entrée pour arrêter l'écoulement lorsque la chambre d'enregistrement est plein. Appliquer le petit pinceau pour soulever chaque coin du tissu nouveau.
- Répétez l'étape 5.2 jusqu'à ce que le tissu se détache de la matrice et flottant dans la solution. Si le tissu est flottant dans la solution, puis utilisez le tube de vide pour aspirer le tissu loin. Ouvrir til se écouler dans l'orifice d'entrée et ouvrir le vide dans la sortie. Laver le système avec de l'eau distillée et sécher.
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Representative Results
Les données présentées sur les figures ici ont été enregistrés dans la préparation de l'hippocampe dépliée avec la 4-AP (100 pM) aCSF ajoutée pendant l'incubation du tissu dans la chambre d'enregistrement à la température ambiante (25 ° C). Normalement l'activité commence dans 5 minutes, mais dans certains tissus de l'hippocampe des animaux plus âgés, il peut prendre plus de temps. Le 4-décharge neuronale induite par des AP observé avec la PMEA est le même que précédemment rapporté 14,15. Étant donné que les électrodes ont une hauteur de 200 pm, les pointes d'électrodes sont situés juste en dessous de la couche de cellules (figure 3C), car la couche de cellules est habituellement de 250 à 300 um au-dessus de la alveus de l'hippocampe (figure 2), les enregistrements (57 sur 64 dans l'expérience de l'échantillon) à partir de différents canaux ont une déviation essentiellement positive. Toutefois, certains de ces enregistrements positifs pourrait afficher de petites déviations négatives ainsi (figure 5B) si les pointes d'électrodes d'enregistrement sont assez proches de la couche cellulaire.Si les pointes d'électrodes sont situés juste au niveau de la couche cellulaire, l'enregistrement aura dopage négative très forte avec changement positif à ce sujet ou tout simplement dopage négatif (Figure 5C) 16. Dans l'échantillon de données montré ici, cinq chaînes sur 57 enregistrements ont dopage négatif. Après l'acquisition des données de tous les canaux 64, le procédé de normalisation individu (figure 6B) est appliquée à cartographier la propagation de neurones dans un plan 2D le long de l'axe de temps de l'enregistrement 7. Avec une combinaison de la PMEA et l'hippocampe dépliée, la propagation neural est mis en correspondance et pour initier observée principalement dans un côté de CA3 et se déplacer longitudinalement dans un front d'onde diagonale, en traversant toute la zone de l'hippocampe (figure 6).
Figure 1. Intervention chirurgicale pour un hippocampe déplié . (A) L'un des deux hippocampes est disséquée du lobe temporal du cerveau de la souris. (B) septale et terminaisons temporelles long de l'axe longitudinal. (C) L'hippocampe est retournée avec une pipette feu de verre poli pour exposer le sillon. Les deux extrémités de l'hippocampe sont taillés et une aiguille de verre est utilisé pour couper les connexions entre la DG et CA1 ou subiculum long de l'axe longitudinal. (D) L'hippocampe est déroulée par une boucle de fil métallique sur mesure. (E) hippocampe déplié avec subiculum et DG rognées. (F) La préparation finale de tissu d'un hippocampe déplié. Cette position indique l'orientation de l'hippocampe lorsqu'il est placé sur la matrice dans une expérience. Pour des détails supplémentaires sur l'hippocampe anatomie déplié se il vous plaît se référer à des méthodes expérimentales dans les manuscrits publiés antérieurement 7.g1large.jpg "target =" _ blank "> Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Histologie section transversale de l'hippocampe dépliée. Cristal-violet tache indique la position de la couche de cellules pyramidales CA1-CA3 dans les hippocampe dépliées un niveau de 250 à 300 um au-dessus de la alveus localisant ainsi les microélectrodes juste en dessous de la couche de cellules (voir la figure 3C). Pour obtenir les coupes colorées avec du cristal violet, le tissu a été post-fixes après l'hippocampe a été dépliée. L'hippocampe déplié a été placé dans PFA 4% O / N. Ensuite, le tissu a été transféré et conservé dans une solution de saccharose (30%) pendant 48 heures, et suivie par encliquetage dans un gel contenant de l'isopentane motard (2-méthylbutane) refroidir à -35 ° C dans de la carboglace. Coupe congelée ont été ensuite découpé dans un cryostat avec20 sections um d'épaisseur dans le plan transversal (comme indiqué dans la figure 2) pour révéler l'emplacement de la couche de cellules pyramidales. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. hippocampe dépliées sur le PMEA. (A) Vue d'en haut d'une nouvelle PMEA avec les microélectrodes située à la fin de chaque trace de métal doré. L'insert du côté droit représente une unique micro-électrode en microscopie électronique d'une hauteur de 200 pm et un diamètre de 20 um 7,13. (B) Le réseau de microélectrodes est collé sur un emballage de PGA avec une chambre d'enregistrement en matière plastique autour des microélectrodes sur un substrat de verre. L'insert sur la droite montre un hippocampe déplié placé sur la arr de microélectrodesay au milieu. (C) Sur la gauche, la tomographie par cohérence optique (OCT) imagerie montre le tissu déplié positionné sur le dessus du tableau dans une expérience différente. Sur la droite, deux images de coupe longitudinales obtenues à partir de l'imagerie octobre sur la gauche montre les conseils de microélectrodes (points blancs souligné par les flèches) mains dans la zone juste en dessous de la couche de corps de la cellule. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure .
Figure 4. Dispositif expérimental. (A) Un couvercle de protection en plastique avec des vis est placé sur les circuits à les protéger contre d'éventuels dommages de l'eau. La chambre d'enregistrement possède deux tubes d'entrée et de sortie pour transporter l'écoulement de la solution. Une ancre pour tissu collé sur mesure avec un maillage de fibres en nylon est utilisé pour sécuriser le tissue pendant les expériences. (B) Vue du dessous du substrat en verre de la PMEA montre l'ancre pour tissu à contenir un échantillon tranche cours d'une expérience. Les fils courbés sont les fibres de nylon à partir de la maille appuyant sur le dessus du tissu. Les points ronds sont les bases de microélectrodes. Les flèches indiquent les électrodes qui ont été endommagés après plusieurs expériences. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. Les données brutes enregistrées par le PMEA d'un hippocampe déplié. Le panneau de gauche: Panneau de droite 4-AP-induite activité épileptiforme enregistrée à partir d'un seul microélectrodes:. La version zoomée du signal marqué dans la fenêtre de temps sur la gauche. (A) de la section de 10 sec d'un exemple de l'activité spontanée enproduite par 100 pM de 4-AP aCSF obtenu pour l'une des microélectrodes situés dans la région dendritique de base sur la base de la polarité des signaux avec un SNR de 34,9 dB. (B) Les données brutes provenant d'un autre micro-électrodes située plus près du corps cellulaire avec un SNR de 27,2 dB. (C) Exemple d'enregistrement obtenu à partir d'une électrode positionnée à l'intérieur de la couche somatique. Dans cet exemple, le SNR est 18,53 dB. (D) d'enregistrement obtenu à partir d'une électrode conductrice coudée encore mais ne pénétrant pas dans le tissu. L'électrode plié a un SNR inférieure significative par rapport à ces électrodes intactes (1,5 dB dans cet exemple). (E) bruit de fond enregistré à partir d'un micro-électrodes. La ligne de base a généralement une valeur crête à crête de 150 à 200 mV et l'impédance d'une seule électrode est d'environ 1-2 MQ. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6. La conversion des données d'enregistrement de neurones dans la propagation des cartes 2-D. (A) Une fenêtre de temps de 170 ms tronque un seul dopage de neurones dans chaque canal tracée sur la photo de la PMEA. Les données brutes sont filtrées par un filtre passe-bas à 100 Hz. Les signaux provenant des électrodes cassées sont interpolées avec les enregistrements qui l'entourent. Dans cet exemple, toutes les pointes sont positifs. (B) Un pic de neurones unique du pixel rouge (A) est normalisée à la barre de couleur avec une méthode développée sur mesure pour la normalisation individuelle (Se il vous plaît se référer à la publication précédente pour plus de détails sur la normalisation 7). (C) Les cartes de couleurs créées par la normalisation particulier montrent que les mouvements de propagation à travers toute la zone de l'hippocampe dépliée à différents points dans le temps.www.jove.com/files/ftp_upload/52601/52601fig6large.jpg "target =" _ blank "> Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Le développement de la préparation de l'hippocampe déplié, où les axes longitudinaux et transversaux de l'hippocampe sont conservés en combinaison avec une matrice de microélectrodes pénétrant, fournit un outil puissant pour étudier les connexions d'anatomie ou la propagation de neurones dans l'hippocampe 7. Cette procédure se déroule est également applicable pour l'étude de l'hippocampe chez des souris adultes. Des études récentes avec cette préparation ont montré que l'activité épileptique 4-AP-induite pourrait propager avec un front d'onde diagonale à travers toute la zone de l'hippocampe dépliée (figure 6) 7,8. Ces études ont montré que l'hippocampe dépliée intact offre des avantages significatifs sur les tranches transversales ou longitudinales, soit lorsque la propagation de neurones dans un réseau de neurones de l'hippocampe plat peut être étudiée (Figure 6).
La microélectrode pénétrant fournit un avantage significatif sur km existantetableaux croelectrode (AME) qui se composent de plusieurs contacts positionnés sur une surface plane 11,12,17. MEA avec des électrodes de surface planes sont difficiles à utiliser avec l'hippocampe dépliée depuis la couche de cellules est situé à environ 250 à 300 um loin de la surface (figure 2). Le PMEA décrit ici a été conçu pour résoudre ce problème avec 64 pénétrant électrodes appropriées pour étudier la propagation de neurones avec une hauteur de 200 um à atteindre en profondeur dans le tissu 7,13. En outre, la PMEA également applicable à toute préparation de tissu à plat, tel que des tranches corticales, transversal tranches hippocampiques etc.
Un autre avantage de l'utilisation de ce PMEA est l'amélioration de la SNR. Une étude de ce prototype de PMEA montre le rapport de SNR d'un signal neuronal enregistré par ce PMEA a une valeur moyenne de 19,4 ± 3 dB, ce qui est significativement plus élevée et plus stable par rapport à celle d'un enregistrement depuis VSD études antérieures ont indiqué que la toxicité etphoto blanchiment de VSD clairement porté atteinte à la capacité d'enregistrer des données 8. Avec un protocole expérimental amélioré à l'aide de l'ancre pour tissu dans cette étude, le SNR de l'enregistrement des PMEA augmente à une gamme d'environ 20 à 30 dB (figure 5), qui a un SNR plus élevé par rapport à ces tableaux aplatir-électrodes avec une valeur de 10 à 15 dB 11,18. La capacité à se dérouler l'hippocampe est essentiel pour obtenir une couche de neurones (CA1-CA3) qui peuvent être interrogés par un tableau d'enregistrement plat.
En outre, étant donné que la matrice de silicium est construit sur un substrat transparent, la tension colorant sensible technique d'imagerie peut être intégré dans le système de PMEA pour étudier la propagation de l'activité neuronale dans l'hippocampe 8. Des souris transgéniques avec des indicateurs fluorescents sensibles à la tension peuvent également être utilisés pour étudier l'origine et la propagation du signal dans les conditions physiologiques, ainsi que les changements induits par pharmacologiagents cal ou un tissu modifié génétique de divers modèles animaux 9.
Il ya plusieurs étapes critiques afin d'assurer l'enregistrement de haute qualité. Tout d'abord pour assurer la viabilité des tissus, l'intervention chirurgicale doit être effectuée le plus rapidement possible. Habituellement, cela prend environ 1 à 2 min de passer par toutes les étapes de 2,1) à 2,10). Pratique de la procédure qui se déroule sur certains animaux échantillon est fortement suggéré avant réelle chirurgie expérimentale est effectuée. Deuxièmement, les besoins de débit doit être maintenue constante pour éviter toute fluctuation de niveau du liquide de perfusion dans la chambre d'enregistrement. De plus, le tissu doit être ancré vers le bas pour éviter un mouvement du tissu par rapport au réseau.
Bien que la PMEA décrit ici peut fournir des signaux utiles dans la surveillance de la propagation de neurones dans l'hippocampe déplié, il ya quelques inconvénients et limitations à cette méthode d'enregistrement.
D'abord, Les microélectrodes peuvent casser à cause de la force mécanique placé sur eux (Figure 5D, E). Au cours de la procédure de placement de tissus et l'élimination, le contact accidentel entre le petit pinceau et le réseau pourrait causer les microélectrodes tordre ou de casser. Lorsque l'ancre pour tissu est abaissé par le micromanipulateur, le mouvement horizontal du tissu le long du fond de la chambre pourrait créer une force de cisaillement qui pourrait conduire à la flexion ou la rupture des électrodes. Dans une conception future, les microélectrodes devraient être remodelés avec une base un peu plus épais pour les rendre plus forts. Dans la version actuelle de cette PMEA, les électrodes d'enregistrement ont une base étroite par rapport à son diamètre 13, ce qui affaiblit les électrodes (figure 3A).
La procédure de nettoyage devrait également être améliorée pour éliminer adéquatement le tissu résiduel et fibres qui pourraient attacher au tableau. Après chaque expérience, de petits morceauxde tissu pourrait rester attaché aux microélectrodes et ce tissu résiduel laissé sur les électrodes doit être retiré. Si ces tissus résiduels ne sont pas supprimés, l'impédance des électrodes et le SNR des enregistrements pourraient être affectées. Flushing du système avec de l'eau distillée est suggéré comme indiqué dans la partie 5 de la section Protocole. Les utilisateurs sont également invités à rincer le système avec une solution faiblement acide qui peut dissoudre le tissu sans endommager le système
Un autre inconvénient de ce protocole est que, pendant la procédure se déroule, la voie perforante en ce hippocampe plié est coupé, ce qui empêche enquête sur les signaux se propageant à partir de neurones possibles DG aux autres couches de l'hippocampe.
En conclusion, nous avons décrit ici une nouvelle méthodologie pour étudier la propagation de l'activité neuronale au sein de l'hippocampe en combinant un rapport d'aspect élevé microélectrodes tableau avec déplié hippocampique tissue. La méthode a conduit à une meilleure compréhension de la façon dont l'activité neuronale peut se propager dans les deux directions longitudinales et transversales. Cette technique peut également être appliquée à un tissu cortical placé de façon similaire au-dessus de la matrice. De plus, en combinant la technique d'enregistrement optique avec cette préparation est possible car le tableau est transparent et pourrait également conduire à des conclusions importantes sur la propagation du signal dans le tissu nerveux.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| desiccator jar | LABRECYCLERS Inc. | 5410 | Place regular paper towels at the bottome of the jar for animal anesthesia use. |
| A blade and Custome made surgical stage for unfolding hippocampus | N/A | N/A | A petri dish is place upside down (in the center) in the ice with a wet filter paper place on top of it. |
| Custom made tissue recovery chamber | N/A | N/A | Plastic tubes were glued with plastic mesh at the bottom and bubbled with 95% O2/ 5% CO2 in the aCSF. |
| Straight Operating Scissors | Fisher Scientific | S17336B Medco Instruments No.:81995 | This scissors is used to decapitate the mice. |
| Integra Miltex Goldman-Fox Scissors | Fisher Scientific | 12-460-517 MILTEX INC No.:5-SC-320 | This scissors is used to cut the skull of the mice. |
| Miltex Hysterectomy Forceps |
Claflin Medical equipment | CESS-722033-00001 | This Forceps is used to peel the cut skull to expose the brain |
| Micro Spatula | Cardinal Health | This micro spatula is used to tranfer the whole brain of a semisphere into the recorering chamber. | |
| Frey Scientific Stainless Steel Semi-Micro Spatula | Cardinal Health | this semi micro spatula is used to tranfer the unfolded hippocampus into the glucose aCSF in the recovering chamber. | |
| small paint brush | Lowe's | tem #: 105657 Model #: 90219 | The one with the smallest size in a normal paint brush package |
| Fire polished glass help tool | N/A | N/A | This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes. |
| Custom made glass needle | N/A | N/A | This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes. |
| Custom made glass tool with a metal wire loop | N/A | N/A | This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes with a reshaped metal wire loop. |
| Custom made glass solution dropper | N/A | N/A | This tool was made from the regular Pasteur glass pipettes with its tips cut and a rubber head attached with the cut end. |
| Custom made tissue anchor | N/A | N/A | Nylon fiber mesh was glued on a insulated copper wire ring. The tissue anchor was hold by an micromanipulator. |
| Custom fabricated microelectrode array | N/A | N/A | More detail about the array please refer to Kibler, et al, 2011. |
| Custom made filter and amplifiers circuits for the array | N/A | N/A | More detail about the array please refer to Kibler, et al, 2011. |
| Data acquisition processor 3400a | Microstar Laboratories | N/A | This is a complete data acquisition system with A/D converter. |
References
- Richardson, K. A., Schiff, S. J., Gluckman, B. J. Control of traveling waves in the Mammalian cortex. Phys Rev Lett. 94 (2), 028103-028112 (2005).
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