Abstract
Genuttryck och dess reglering är mycket viktigt att förstå beteendet hos celler under olika förhållanden. Olika tekniker används idag för att studera genuttryck, men de flesta är begränsade när det gäller att ge en samlad bild av uttrycket av hela transkriptom. DNA microarrays erbjuder en snabb och ekonomisk forskning teknik, som ger en fullständig översikt över den globala genuttryck och har ett stort antal tillämpningar inklusive identifiering av nya gener och transkriptionsfaktor bindningsställen, karakterisering av transkriptionsaktiviteten hos cellerna och även hjälpa till att analysera tusentals av gener (i ett enda experiment). I den aktuella studien har förutsättningarna för bakteriell transkriptomanalys från cell skörd till DNA microarray analys optimerats. Med hänsyn till den tid, kostnader och noggrannhet av experimenten, bevisar detta teknikplattform för att vara mycket användbart och universellt applicabale för att studera bakterie transcriptomes. Här utför vi DNA microarray analys med Streptococcus pneumoniae som en fallstudie genom att jämföra transkription svaren från S. pneumoniae odlades i närvaro av varierande L-serin koncentrationer i mediet. Total-RNA isolerades genom användning av en Macaloid metod med användning av ett RNA isoleringskit och kvaliteten hos RNA kontrollerades genom användning av en kontroll RNA kvalitet kit. cDNA framställdes med användning av omvänt transkriptas och de cDNA-proven märktes med användning av en av två amin-reaktiva fluorescerande färgämnen. Made DNA microarray slides användes för hybridisering av de märkta cDNA-prover och microarray data analyserades genom användning av en ram-cDNA microarray data som pre-processing (Microprep). Slutligen Cyber-T används för att analysera de data som genereras med hjälp Microprep för identifiering av statistiskt signifikanta differentiellt uttryckta gener. Vidare internt byggda programpaket (peppar, FIVA, avslöja, åklagare, Genome2D) användes för att analyseradata.
Introduction
Studiet av hela uppsättningen av mRNA överflöd (transkriptom) kodas av genomet hos en encellig organism eller en eukaryot cell vid en viss tidpunkt eller under ett särskilt villkor, inklusive gen överuttryck eller knock-out, kallas transkriptomik. Transkriptomik tillåter oss att observera i vilken utsträckning gener uttrycks enligt ett visst tillstånd vid en tidpunkt X och ger oss information om hur starkt generna uttrycks i förhållande till en referens.
En microarray är en tvådimensionell array på ett fast substrat (vanligen ett objektglas eller kisel tunnfilmscell) som kan användas för att analysera stora mängder av biologiskt material med användning av high-throughput screening, och miniatyriserade, multiplexeras och parallell bearbetning och detektering metoder. Microarrays finns i olika typer, inklusive DNA-mikroarrayer, protein mikroarrayer, peptid mikroarrayer, vävnads mikroarrayer, mikroarrayer antikropps, cellulära mikroarrayer och andra. En DNA microarray äri grund och botten ett aggregat av mikroskopiska DNA fläckar fixerad till en fast yta, vanligen glas. DNA microarrays används för att mäta uttrycksnivåer av en gen eller en uppsättning gener samtidigt eller till genotyp flera regioner i en genomet 2,3. Picomol (10 -12 mol) av en sond finns inom varje DNA plats som representerar en specifik DNA-sekvens, även känd som en reporter. De märkta mRNA-molekyler från proverna kallas "mål". Fluoroforer används för att mäta sond-mål-hybridisering och detektion av fluoroformärkta mål bestämmer den relativa förekomsten av nukleinsyrasekvenser i målet. En microarray experiment kan åstadkomma flera genetiska test parallellt eftersom en array kan innehålla tiotusentals sonder. Layouten på ett enkelt microarray experiment visas i figur 1. Nyligen fastställdes det i våra och andra labb att dessa matriser är återanvändbara, vilket gör denna teknik helt kostnads effective.
Olika RNA isolerings- och reningstekniker har utvecklats under åren, inklusive C-TAB, SDS och GT metoder 4-8. Dessutom flera kommersiella kit finns också. För genuttryck högkvalitativt RNA är mycket viktigt. Därför är RNA isoleringsmetoder modifieras för att få en maximal mängd av RNA. På samma sätt är de steg för cDNA beredning och märkning av cDNA minimeras. Normalisering av data efter skanning utförs också effektivt genom att använda in-house byggda programpaket och verktyg 9.
Streptococcus pneumoniae är en Gram-positiv human patogen som koloniserar nasofarynx och är orsaken till flera infektioner såsom lunginflammation, sepsis, otitis media och meningit 10. Bakterien kan använda en mängd olika näringsämnen som behövs för tillväxt och överlevnad 11,12. Ett antal studier har utförts påpneumokock kvävemetabolism och reglering betona vikten av aminosyror och deras roll i virulens 13,14. I denna studie, den transcriptomic svaret av S. pneumoniae till förändrade koncentrationer av L-serin, en aminosyra högst närvarande i humant plasma blodet, rapporteras med användning av DNA-mikromatriser. Den transcriptomic respons S. pneumoniae odlades i en minsta koncentration av L-serin (150 pM) jämfördes med den som odlas i en maximal koncentration (10 mM) serin. Kemiskt definierat medium (CDM eller minimalt medium) 15 användes för denna studie för att reglera koncentrationen av serin. Fokus i denna studie är att göra denna teknik användarvänlig och tillhandahålla olika verktyg för data normalisering och analys. Därför har ett antal verktyg som utvecklats för analys och tolkning av data. FIVA (Functional Information Viewer och Analyzer) ger en plattform för att bearbeta information i kluster av gener som harliknande genexpressionsmönster och för att konstruera funktionella profiler 16. ÅKLAGARENS är ett annat programpaket som underlättar identifieringen av förmodade funktioner och anteckningar av gener 17. Genom att använda sig av klustermetoder, beskriver ger en DNA-bindningsställe detekteringsalgoritm. Cis den förfogar motiv av gener kan projiceras med hjälp av denna algoritm 18. Genome2D erbjuder en Windows-baserad plattform för visualisering och analys av transkriptom uppgifter genom att erbjuda olika färgskalor att karakterisera förändringar i genuttryck nivåer på en genom karta 19. Pepper webserver erbjuder, förutom allt-i-ett-analysmetod, en verktygslåda för gruvdrift för reguloner, initiativtagare och transkriptionsfaktor bindningsställen 20. Fullständig annotering av intergena regioner i en bakteriegenomet kan uppnås genom att använda detta paket. Biologer kan ha stor nytta av peppar, eftersom det ger dem en plattform för att utforma experimentets så att hypotes informationen kan bekräftas in vitro 20. Dessa programvarupaket bidrar väsentligt till microarray analys som de flesta av dem är fritt tillgängliga och göra data normalisering och analys mycket pålitlig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av media, och cellodling
- Grow S. pneumoniae D39 vildtypsstam 21 såsom beskrivits tidigare 11. Inokulera celler lagrade vid -80 ° C i 10% glycerol (med 1/100 förhållande i 50 ml sterila rör) i 50 ml kemiskt definierat medium (CDM) med ett slutligt pH av 6,4 15, men utelämna L-serin från aminosyran blandning.
Anm: två olika CDM användes; en innehållande en minimikoncentration av L-serin (150 pM) och den andra innehållande en maximal koncentration av L-serin (10 mM). Denna minimikoncentration är i grunden koncentrationen av L-serin i human blodplasma och målet är att jämföra genuttryck i S. pneumoniae D39-stammen under dessa två villkor.
2. Isolering av totalt RNA
- Material
- Använd syra fenol, RNA betyget för isolering av total-RNA.
- Macaloid:
- Suspendera 2 gramMacaloid i 100 ml TE och koka i 5 minuter. Kyl till RT och sonikera tills Macaloid gels.Centrifuge lösningen vid 2000 x g under 5 min vid RT, återsuspendera i 50 ml TE pH 8 och förvara vid 4 ° C.
- Lösningar:
- Behandla alla lösningar med dietylpyrokarbonat (DEPC). Lägg 100 pl DEPC / 100 ml lösning, inkubera O / N vid 37 ° C och autoklav under 15 minuter.
- Metodik
- Odla 50 ml S. pneumoniae D39 cellodling i 50 ml rör vid 37 ° C (ingen skakning) fram till mitten av exponentiell fas (OD ~ 0,3). Centrifugera kulturer vid 4 ° C på 10.000 x g under 2 min. Kasta media och omedelbart frysa cell pellets i flytande kväve.
- Förblandning 300 | il kloroform: IAA (24: 1) och 300 | il fenol (syra fenol, RNA-kvalitet). Använd 500 pl av den organiska fasen i steg 2.2.3.
- Gör i ordning följande blandning i förväg i RNA fria skruv-cap-rör: 00,5 g glaspärlor, 50 | il 10% SDS, 500 | il fenol / kloroform: lAA (framställd såsom i steg 2.2.2), Macaloid skikt (150-175 | il, inte exakt som det är mycket viskös). Resuspendera cell pellets i 400 pl TE (DEPC) och tillsätt de suspenderade cellerna i skruvlock rör.
- För att bryta cellerna, placera skruvlock rör i en sträng visp för 2x 60 "pulser (" homogenisera ") med 1 min intervall på is. Centrifugera prover för 10 min vid 10000 x g (4 ° C).
- Överför den övre fasen till ett nytt rör, tillsätt 500 | il kloroform: IAA (24: 1) och centrifugera i 5 min vid 10.000 x g (4 ° C).
- Överför 500 | il av den övre fasen till nya rör, tillsätt 2 volymer (1 ml) av lys / bindningsbuffert och blanda genom att pipettera upp och ned. Isolera totalt RNA med hjälp av RNA isolering kit och följ tillverkarens rekommenderade protokoll.
3. RNA-Cleanup
< ol>4. Analys av RNA
- Bestäm koncentrationen av RNA på en spektrofotometer. Bestämma kvaliteten av RNA genom användning av en analys på följande sätt (Figur 2).
- Späd 1 l av provet med 50 pl DEPC vatten för att få en koncentration av 20-200 ng / l.
- Använd 1 pl utspätt RNA-prov för att kontrollera kvaliteten på Bioanalyser enligt tillverkarens anvisningar.
- Obs: ett förhållande av 23S: 16S på ca 2,0 anses bra 1 A260 enhet RNA motsvarar 40 mikrogram / ml.. En rekommenderad mängd för märkning är 10-20 mikrogram.
5. cDNA Förberedelse och märkning
ntent "> OBSERVERA: Följande protokoll följdes för cDNA-framställning och märkning.- Glödgning
- Utför glödgning reaktion i 300 pl PCR-rör, hålla koncentrationen av total-RNA 10-15 mikrogram för hemlagad diabilder eller 5 mikrogram för företaget tillverkade diabilder. Blanda RNA med 2 pl Random nonamerer (1,6 | ig / | il) och tillsätt nukleasfritt vatten om det behövs för att hålla den slutliga volymen av glödgning blandningen till 18 | il.
- Håll glödgning blandningen vid 70 ° C under 5 min. Efter det, kyla ned blandningen till RT under 10 min (annelering) och om det behövs, spinn ner reaktionerna till botten av röret. Placera reaktionsrören på is under åtminstone en minut.
- Omvänd transkription
- Förbered omvänt transkriptas mixen enligt följande: till 18 pl glödgning mix, lägga 12 ul Mästare mix (som består av 6 pl 5x First Strand buffert, 3 pl 0,1 M DDT, 1,2 l 25x AA-dUTP / nukleotid mix och 1,8 pl vända transcriptase (1 pl för företagsgjorda diabilder). Håll reaktionsblandningen för 2-16 h vid 42 ° C.
6. Nedbrytning av mRNA och rening av cDNA
- För att bryta ned mRNA från reaktionsblandningen, tillsätt 3 | il av 2,5 M NaOH och rum vid 37 ° C under ca 15 min. Därefter till 15 fil 2M HEPES fri syra för att neutralisera NaOH.
- Rena cDNA blandningen med hjälp PCR sanerings kolumner och följ tillverkarens protokoll.
7. Mätning av cDNA Koncentration
- Mät cDNA koncentrationer på en spektrofotometer. För att fortsätta med märkning, kontrollera att koncentrationen av cDNA är minst 60 ng / l (hemlagad diabilder) eller 20 ng / l (företaget tillverkade diabilder).
8. Märkning av cDNA med Amine-reaktivt Dye och rening
- Använd aminreaktivt färgämne för att märka cDNA. Direkt blanda cDNA med en alikvot (5 l) avamin-reaktivt färgämne.
- Inkubera blandningen vid RT, i mörker, 60 till 90 min och fortsätta direkt till rening av färgämnesmärkt cDNA. Rena färgämnesmärkt cDNA genom användning av PCR-sanerings kolumner och genom att följa tillverkarens protokoll. Eluera cDNA i 50 | il elueringsbuffert.
9. Mätning av märkt cDNA
- Använd en spektrofotometer för att mäta inkorporering av amin-reaktiva färgämnen till cDNA. Kontrollera att koncentrationen av amin-reaktiva färgämnen är åtminstone 0,5 pmol / | il i en total volym av 50 | il.
10. Blandning av märkt cDNA Prover
- För hemlagad diabilder, använda all den märkta cDNA för hybridisering med högst 30% skillnad i cDNA koncentration. För företaget tillverkade diabilder, använd cDNA med högst 2-faldig skillnad i cDNA koncentration.
Notera: Normalt behövs ca 300 ng cDNA för företaget tillverkade diabilder, vilket är väldigt lite jämfört med required mängd cDNA för hemlagad diabilder.
11. Hybridisering och tvättning
- Använd följande reagenser: demi vatten, etanol 99%, SHY Buffer (hemlagad, med 40 pl jäst RNA). Förbered maximalt 1 ml SHY.
- Apparater och lösningar förberedelser
- Slå på vakuum koncentratorer och värmare minst 1 timme före torkning. Slå på hybridisering ugn, med börvärde justeras till rätt hybridiseringstemperatur (för S. pneumoniae DNA mikroarrayer, använd 45 ° C). Likaså förvärma hybridisering kassett och ugnen i 30-60 minuter.
- Förvärm SHY buffert vid 68 C under minst 30 min.
- Provberedning (märkt cDNA)
- Kombinera lika mängder av märkta cDNA (max 30% skillnad). Torka provet med hjälp av vakuum koncentratorer vid hög temp (ung. 40 min) tills volymen är mindre än 7 pl.
- Lifter-slip
- Använd rena lifter-halk.Obs: ± 30 l kan lastas på bilden.
- Rengör lifter-halk med tvål, rikligt med kranvatten och 100% etanol. Obs: Dirty lifter besked ger hög bakgrund.
- Lufttorka lifter-halk med luftpistol att blåsa bort dammpartiklar. Placera en ren lyftare-slip på bilden med den vita teflonfoder på sidorna nedåt.
- Lägga hybridiseringsbuffert (till märkt cDNA)
- Lös de torkade färgämnesprover i 7 | il H2O och inkubera vid 94 ° C under 2 min.
- Omedelbart, lägga 35 l förvärmd SHY buffert (68 ° C), blanda försiktigt och centrifugera vid maximal hastighet under 1 minut för att bli av fällningar. Förvärm proben vid 68 C i ungefär 5 min tills lastningen.
- Skjut-lifter-slip montering och förvärmning.
- Placera hybridisering diahållaren på ett värmeblock vid 50 C. Placera DNA microarray diabilder med lyften-slip på den uppvärmda hybridisering glidhållare och pvärma bilden med lyften-slip för en minut. Utför nästa steg så snabbt som möjligt.
- Lägg 40 pl av provmålet till änden av sliden. Låt vätskan att strömma mellan glasytorna genom kapillärkraft. Utför all pipettering långsamt och försiktigt.
- Håll glasen med lifter-slip horisontell hela tiden och rör sig långsamt för att se till att lyftaren-slip inte flytta.
- Ta förvärmda hybridisering kassett ur hybridiseringsugn och stäng av maskinen. Placera filterpapper indränkt med 3 ml 2x SSC (standard saltlösning citrat) i hybridisering kassetten.
- Placera försiktigt hybridisering glashållaren med bilder i hybridisering kassett. Stäng hybridisering kassetten och sätta i hybridiseringsugn igen (för ca 16-18 timmar).
- Slide tvättning
- Förbered färsk tvätt-buffertar I, II och III (750 ml per tvättsteg). För 500 ml tvätt-buffert I, använda 2 x SSC / 0,5% SDS. För 500 ml tvätta-buffer II, använd 1 x SSC / 0,25% SDS. För 500 ml tvätt-buffert III, använd 1 x SSC / 0,1% SDS (tillval)
- Placera tvättbuffertar i 30 ° C (för att vara säker på SDS upplöses).
- Sänk glasen så snabbt som möjligt, men mycket försiktigt, i ett Falcon-rör fyllt med 50 ml tvättbuffert I tills glaset vilar på den koniska botten av röret.
- Efter några sekunder, när lyften-slip sjunker till botten av röret, ta ut bilden med pincett utan att repa arrayen och in i racket av tvättstationen. Fortsätt med tvättning med ingen tid lucka.
- Tvätta bilderna i 5 minuter i 500 ml Tvätt-buffert I (i en tvättstation). Ge det en andra tvätt för 20-30 min i 500 ml tvätta-buffert II (i en tvättstation). Likaså tvätta glasen i 5 min i 500 ml tvätta-buffert III (tillval) (i en tvättstation).
- Torka objektglasen för 2 min vid 2000 rpm.
12. microarray analys
- Scan bildermed respektive våglängder i skannern och spara i en mapp "Jove Project".
- Använd mjukvara för att analysera de skannade filerna ursprungligen som beskrivits tidigare 22. Efter att ha kört den här programvaran, välj "Öppna bild" fliken för att ladda den röda bildfil (-.550) som "röd" och grön bildfil (-.635) som "Grön". Ladda upp gal filen (.gal) med S. pneumoniae array listan bildfil genom att välja "Load Array List" -fliken 22.
Obs: denna array lista bestod av 48 galler, på varje galler fanns 16 rader och 15 kolumner. Varje plats på nätet utgör en enda gen och spotinformation inklusive gen namn läggs genom en plats beskrivningsfil. De spotnumren ges från vänster till höger och uppifrån och ned. - Efter noggrant spotting gallren väljer fliken "Hitta Array, Hitta Blocks, Rikta funktioner" för att rikta in fläckarna. Efter att rikta alla funktioner, analysera bilden genom att välja "Analyserar" tab. Skapa en ny fil med resultat, histogram och spridningsdiagram. Spara den här filen från fliken "Spara resultat som" som en .gpr fil för vidare analys.
- Utför ytterligare normalisering och bearbetning av data med egenutvecklade Microprep programpaket som beskrivs 9.
- Använd oberoende biologiska replikat för DNA microarray uppgifter som är färg bytte. Utför CyberT genomförande av en variant av t-test1 och beräkna falska discovery satser (FDRs) såsom beskrivits 9.
- För differentiellt uttryckta gener, ta p <0,001 och FDR <0,05 som en standard.
- Ladda upp DNA microarray uppgifter på NCBI underkastelse sida för att få en GEO (Gene Expression Omnibus) referensnummer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
RNA, cDNA isoleringar och analys
L-serin är en av de essentiella aminosyror och dess koncentration i plasma blod varierar från 60 till 150 iM hos barn och vuxna. Dess roll i biosyntesen av puriner och pyrimidiner belyser dess betydelse i ämnesomsättningen och det är en föregångare till flera aminosyror (glycin, cystein och tryptofan). För att studera effekten av L-serin på hela transkriptom S. pneumoniae D39 vildtypstammen, microarray analys av D39-stammen odlades i CDM med en minsta koncentration (150 pM) av L-serin mot den som odlas i en maximal koncentration (10 mM) i samma medium utfördes. Först av allt, totalt RNA från celler odlade under båda koncentrationerna isolerades. Koncentrationerna av de RNA-prover anges i tabell 1. Kvaliteten av totalt RNA undersöktes med användning av kvalitetskontroll analysen. RNA behandlades med DNas innan du utför dettaanalys för att avlägsna eventuell iskt DNA Figur 2 visar kvaliteten av RNA.; lane L representerar stegen, spår 1 och 2 representerar RNA från 150 ^ m serin och banorna 3 och 4 representerar RNA från 10 mM serin. Närvaron av två tydliga band som motsvarar de två RNA-subenheterna indikerade god kvalitet av RNA och nästa steg i experimentet kunde utföras.
Efter mätning av kvaliteten av RNA, var cDNA-syntes sker. cDNA bildades genom att använda slump nanomers och omvänt transkriptas enzym. Koncentrationerna av de cDNA-proven ges i tabell 1. Denna cDNA märkt med aminreaktiva färgämnen, och koncentrationerna av den märkta cDNA och färgämnes etiketter ges i tabell 1. Efter märkning togs prov blandades därefter och hybridiseras därefter. Efter tvättning diabilder skannas med skannern och analys utfördes med hjälp av Gene Pix Pro. Figur 3 visar scatterplotanalys av amin-reaktiva färgämnen förhållande. Efter inledande analys, rades uppgifterna analyseras vidare med hjälp av PicroPrep programpaket (PrePrep, Prep, PostPrep) 9 för att minska buller och Cyber-T användes för slutlig analys. Tabell 2 sammanfattar resultaten av microarray studier efter applicering av kriterierna på ≥ 2,0 faldig skillnad och p -värde <0,001. Ett antal gener var differentiellt uttryckta i närvaro av minsta L-serin som jämfört med den maximala (tabell 2).
Figur 1. En översikt av DNA microarray-teknik. RNA isoleras från kontrollen och de riktade urval och märkt cDNA hybridiseras därefter.
Figur 2.Kvalitetskontroll av RNA isolerat från S. pneumoniae D39-celler odlade i närvaro av minst (150 pM) och maximal (10 mM) serin koncentrationer. Lane L representerar storleken-stege medan lane 1 och 2 representerar prover RNA isolerat från celler som odlats i närvaro av minsta serin koncentration. Likaså, spår 3 och 4 representerar RNA-prov som isolerats från celler som odlats i närvaro av maximal serin koncentration. Banden representerar 23S och 16S rRNA. Närvaron av endast två band visar att det inte finns någon gDNA kontamination och RNA är av god kvalitet.
Figur 3. Array jämförelse punktdiagram av en provblandning. Varje plats i handlingen representerar betyder uttrycket värdet (log2) av en gen i ett experiment med färg 1 på y-axeln och färgämne 2 på x-axeln.
| Prov | RNA-provet | Beskrivning | RNA-koncentration (ng / ul) | cDNA-koncentration (ng / | il) | Märkt cDNA (ng / ul) | DyLight-550 (pmol / | il) | DyLight-650 (pmol / | il) | Hybridisering schema |
| S1 | R1 | D39 vildtyp odlades i CDM + Minimum L-serin | 2057 | 255 | 225 | 0,8 | R1 + R3 | |
| R2 | D39 vildtyp odlades i CDM + Minimum L-serin | 2566 | 201 | 179 | 1,2 | R2 + R4 | ||
| S2 | R3 | D39 vildtyp odlades i CDM + Maximal L-serin | 2831 | 292 | 276 | 2,3 | ||
| R4 | D39 vildtyp odlas i CDM + Maxmum L-serin | 1867 | 172 | 150 | 1 |
Tabell 1. Hybridisering systemet av proverna används i microarray analys.
| Gene en | Funktion B | Förhållandet C | |||
| SPD0600 | Celldelning protein DivIB | 4 | |||
| SPD0445 | Fosfoglyceratkinas | 3,5 | |||
| SPD0646 | Hypotetiskt protein | 3,4 | |||
| SPD0873 | Hypotetiskt protein | 3,3 | |||
| SPD1223 | Hypotetiskt protein | 3,3 | |||
| SPD0980 | Ribos-fosfat pyrophosphokinase 2,8 | ||||
| SPD1628 | Xantin fosforibosyltransferas | 2,7 | |||
| SPD1011 | Glycerat-kinas | 2,4 | |||
| SPD0645 | Hypotetiskt protein | 2,3 | |||
| SPD0564 | Hypotetiskt protein | 2,2 | |||
| SPD0641 | Mannos-6-fosfat-isomeras, klass I, Mana | 2,1 | |||
| SPD1333 | Hypotetiskt protein | 2,1 | |||
| SPD1384 | Katjon efflux familj protein | 2,1 | |||
| SPD1432 | UDP-glukos 4-epimeras, Gale-1 | 2,1 | |||
| SPD1866 | N-acetylglukosamin-6-fosfat-deacetylas, naga | 2,1 | SPD0104 | LysM-domän-protein | 2 |
| SPD0140 | ABC-transport, ATP-bindande protein | 2 | |||
| SPD0261 | Aminopeptidas C, PEPC | 2 | |||
| SPD1350 | Hypotetiskt protein | 2 | |||
| SPD1822 | Ribosomalt stora subenheten pseudouridine syntas, RluD subfamiljen protein | 2 | |||
| SPD0453 | Typ I restriktion-system för att förändra, S-subenheten | -2 | |||
| SPD0459 | Värmechockprotein GrpE | -2 | |||
| SPD1006 | Glukos-1-fosfat adenylyltransferase | -2 | |||
| SPD1799 | Sensor histidin kinas, förmodad | -2,1 | </ Tr>|||
| SPD0387 | Beta-hydroxyacyl- (acyl-carrier-protein) dehydratas Fabz | -2,2 | |||
| SPD1494 | Socker ABC transportör, permeas protein | -2,2 | |||
| SPD0974 | Klass I glutamin amidotransferase, förmodad | -2,4 | |||
| SPD1600 | Antranilat fosforibosyltransferas | -2,5 | |||
| SPD1472 | Isoleucyl-tRNA-syntetas | -2,6 | |||
| SPD0681 | Hypotetiskt protein | -2,7 | |||
| SPD0501 | Transkription antiterminator, Lict | -3,4 |
Tabell 2. Förteckning över gener som regleras i jämförelsen transkriptom S. pneumoniae stam D39 vildtyp odlas i CDM 15 med minsta koncentration av L-serin och CDM 15 med maximal koncentration av L-serin. En gen Siffrorna hänvisar till D39 locus taggar. B D39 anteckning / TIGR4 annotation 21. C Ratio representerar faldig ökning / minskning i uttrycket av gener i CDM-max jämfört med CDM-minimum (minustecken indikerar nedreglering).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver en användarvänlig protokoll som kan tillämpas för att utföra hela transkriptomanalys av bakterier. Den viktigaste punkten om denna speciella teknik är att se under vilka förutsättningar cellerna skördas varierar. Efter skörd av cellerna och RNA-isolering, blir denna teknik lika för alla typer av bakteriella prover och följer exakt identiska steg och därför, kan tillämpas på alla typer av bakteriekultur. Protokollet är mycket enkel och bekväm och startar från RNA-isolering. Vår RNA isolering protokoll (med hjälp av en Macaloid och RNA isolering kit) är tidseffektiv jämfört med konventionell fenol-kloroform och Trizol metoder. I nästa steg, är framställningen av cDNA med transkriptas III enzym utförs. Härnäst märkning av cDNA görs genom att först blandning av cDNA med aminreaktiva färgämnen, och därefter rena den märkta cDNA. Märkningen är också enkel och tar inte mycket tid som proven måste inkuberas i ca 1h i mörker. Alla dessa steg kan utföras i någon standard laboratorie eftersom den inte kräver någon specialutrustning. Det behövs en microarray scanner för att scanna diabilder. För diabilder och analys, är GenePix Pro programmet används, vilket är en mycket enkel och användarvänligt program 22.
Efter att ha gjort alla experiment analys utförs med hjälp MicroPrep och CyberT. Den MicroPrep paketet består av tre moduler, dvs PrePreP, prep och PostPreP 9. Denna ram uppgifter förbehandling minskar tiden för normalisering av data och minskar också mängden kasserade data. Den lätthet med vilken programvaran kan användas gör det möjligt för forskaren att ha en förståelse av DNA microarray data i minimal tid. Det tar bara ett par minuter att konvertera råsignaldata till högkvalitativa data för vidare bearbetning efter slide bildanalys görs. Ytterligare analyser på poolen av gener regleras i microarray kan göras med användning av olika in-house programvarupaket. De inkluderar Pepper 20, FIVA 16, beskriver 18, ÅKLAGARE 17 och Genome2D 19. Dessa Windows-baserade verktyg och programvaror är användarvänliga och ger djup insikt i de data under vidare utredning. Dessa programvaror gör det mycket enkelt och praktiskt för forskarna att utnyttja denna teknik som data blir mycket mer meningsfullt och relevant.
De färgämnen som används i microarrays är kända för att vara känsliga för en ozoneffekt, där färgämnena blir instabila i närvaro av ozon och signalstyrkan är så låg att den inte kan kännas igen av skannern. Aminreaktiva färgämnen som är mindre känsliga för det ozon verkan används för att märka cDNA. Lösningen på ozon-effekt kommer att göra denna teknik ännu bättre.
En lista skapades av gener som var upp- eller nedregleras i närvaro av den minimala L-serine koncentration jämfört med den maximala (tabell 2). De uppreglerade gener kan kategoriseras enligt deras produkts funktion. Sju av dem kodar hypotetiska proteiner, fyra är involverade i kolhydrat transport och metabolism, en celldelning protein DivIB, och vissa aminosyror transport- och ämnesomsättning gener. Likaså finns det också vissa gener som nedregleras i vår testade skick. En BglG-familjen transkriptionsregulator LicT, vissa kolhydrat gener och vissa aminosyraspecifika gener är bland de nedregleras generna. En värmechockprotein GrpE är också bland de nedregleras sådana. Därför ger denna studie en fullständig översikt över de gener differentiellt uttryckta i de testade förhållanden. Efter analys av resultaten, är nödvändigt ibland kontroll av resultaten. Detta kan antingen göras genom qPCR eller β-galaktosidas-analyser med användning av lacZ-promotorfusioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi tackar Anne de Jong och Siger Holsappel för hjälp med DNA microarrays glidproduktion. Anne de Jong stöd för bioinformatik analys är också uppskattat. Vi tackar också Jelle Slager för granskning papperet. Muhammad Afzal och Irfan Manzoor stöds av GC-universitetet, Faisalabad, Pakistan enligt fakultets utvecklingsprogram av HEC Pakistan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acid phenol | SigmaAldrich | P4682 | |
| Roche RNA isolation kit | Roche Applied Science | 11828665001 | |
| Glass beads | 105015 | ||
| Chloroform | Boom | 92013505.1000. | |
| IAA | 106630 | ||
| Nanodrop | Nanodrop | ND-100 | |
| Agilent BioAnalyser | Agilent | G2940CA | |
| Superscript III | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| AA-dUTP | Life technologies Invitrogen | AM8439 | |
| DDT | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| First Strand buffer | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| NaOH | SigmaAldrich | S8045-1KG | |
| HEPES | SigmaAldrich | H4034-500G | |
| DyLight-550 | Thermoscientiffic | 62262 | |
| DyLight-650 | Thermoscientiffic | 62265 | |
| SHY Buffer | SigmaAldrich | H7033-125ML | |
| Speedvac cooler | Eppendorf | RUGNE3140 | Speedvac concentrator plus |
| Hybridization oven | Grant Boekel | Iso-20 | |
| Lifter-slips | Erie Scientific | 25x60I-M-5439 | |
| Wipe | KIMTECH | ||
| SDS | SigmaAldrich | L3771-100g | |
| SSC | SigmaAldrich | W302600-1KG-K | |
| Genpix autoloader 4200A1 | MSD analytical technologies | Microarray scanner | |
| Sodium bicarbonate | SigmaAldrich | 104766 |
References
- Kayala, M. A., Baldi, P. Cyber-T web server: differential analysis of high-throughput data. Nucleic Acids Res. 40, W553-W559 (2012).
- Chang, T. W. Binding of cells to matrixes of distinct antibodies coated on solid surface. J. Immunol. Methods. 65, 217-223 (1983).
- Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science. 270, 467-470 (1995).
- Galau Levi, A., A, G., Wetzstein, H. Y. A rapid procedure for the isolation of RNA from high-phenolic-containing tissues of pecan. 27 (12), 1316-1318 (1992).
- Lopez-Gomez, R., Gomez-Lim, M. A. A method for extraction of intact RNA from fruits rich in polysaccharides using ripe mango mesocarp. (5), 440-442 (1992).
- Salzman, R. A., Fujita, T., Salzman, Z., Hasegawa, P. M., Bressan, R. A improved RNA isolation method for plant tissues containing high levels of phenolic compounds or carbohydrates. Plant Molecular Biology Report. 17, 11-17 (1999).
- Kiefer, E., Heller, W., Ernst, D. A simple and efficient protocol for isolation of functional RNA from plant tissues rich in secondary metabolites. Plant Mol. Biol. Report. 18, 33-39 (2000).
- Tattersall, E. A. R., Ergul, A., Alkayal, F., Deluc, L., Cushman, J. C., Cramer, G. R. Comparison of methods for isolating high-quality RNA from leaves of grapevine. Am. J. Enol. Vitic. 56, 400-406 (2005).
- Van Hijum, S. A. F. T., Garcia de la Nava, J., Trelles, O., Kok, J., Kuipers, O. P. MicroPreP: a cDNA microarray data pre-processing framework. Appl.Bioinformatics. 2, 241-244 (2003).
- Kadioglu, A., Weiser, J. N., Paton, J. C., Andrew, P. W. The role of Streptococcus pneumoniae virulence factors in host respiratory colonization and disease. Nat.Rev.Microbiol. 6, 288-301 (2008).
- Afzal, M., Shafeeq, S., Kuipers, O. P. LacR is a repressor of lacABCD and LacT is an activator of lacTFEG, constituting the lac gene cluster in Streptococcus pneumoniae. Appl. Environ. Microbiol. 80, 5349-5358 (2014).
- Afzal, M., Shafeeq, S., Henriques-Normark, B., Kuipers, O. P. UlaR activates the expression of the ula operon in Streptococcus pneumoniae in the presence of ascorbic acid. Microbiol. Read. Engl. , (2014).
- Hendriksen, W. T., et al. Site-specific contributions of glutamine-dependent regulator GlnR and GlnR-regulated genes to virulence of Streptococcus pneumoniae. Infect. Immun. 76, 1230-1238 (2008).
- Kloosterman, T. G., Kuipers, O. P. Regulation of arginine acquisition and virulence gene expression in the human pathogen Streptococcus pneumoniae by transcription regulators ArgR1 and AhrC. J. Biol. Chem. 286, 44594-44605 (2011).
- Kloosterman, T. G., Bijlsma, J. J. E., Kok, J., Kuipers, O. P. To have neighbour's fare: extending the molecular toolbox for Streptococcus pneumoniae. Microbiol. Read. Engl. 152, 351-359 (2006).
- Blom, E. J., et al. FIVA: Functional Information Viewer and Analyzer extracting biological knowledge from transcriptome data of prokaryotes. Bioinforma. Oxf. Engl. 23, 1161-1163 (2007).
- Blom, E. J., et al. Prosecutor: parameter-free inference of gene function for prokaryotes using DNA microarray data, genomic context and multiple gene annotation sources. BMC Genomics. 9, 495 (2008).
- Blom, E. J., et al. DISCLOSE : DISsection of CLusters Obtained by SEries of transcriptome data using functional annotations and putative transcription factor binding sites. BMC Bioinformatics. 9, 535 (2008).
- Baerends, R. J. S., et al. Genome2D: a visualization tool for the rapid analysis of bacterial transcriptome data. Genome Biol. 5 (5), R37 (2004).
- De Jong, A., Pietersma, H., Cordes, M., Kuipers, O. P., Kok, J. PePPER, a webserver for prediction of prokaryote promoter elements and regulons. BMC Genomics. 13, 229 (2012).
- Lanie, J. A., et al. Genome sequence of Avery's virulent serotype 2 strain D39 of Streptococcus pneumoniae and comparison with that of unencapsulated laboratory strain R6. J. Bacteriol. 189, 38-51 (2007).
- Molecular Devices, Corp. GenePix Pro 6.0 Microarray Acquisition and Analysis Software for GenePix Microarray Scanners-Use's Guide and Tutorial. , Molecular Devices, Corp. (2005).
