Abstract
건강한 조직 많은 혈액 및 고형 악성 종양과 유사하게이 더욱 분화 된 자손을 발생주기 동안 자기 - 갱신 줄기 같은 암세포의 서브 세트로, 계층 적으로 구성하는 것으로 생각된다. 이해 및 향상된 화학 치료 및 비 - 조혈 종양 부피에 비해 전파 저항을 가질 수있다 유방암 이러한 암 줄기 세포를 표적으로는, 중요한 연구 분야가되고있다. mammosphere 분석이 또한 널리 향적 sphere-를 식별하는 능력을 위해 사용되었다 : CD44, CD24, 및 ALDH 활성 포함 마커 전향 면역 결핍 생쥐에 주입 할 때 향상된 발암 표시 세포를 분리하는 (FACS)를 정렬 형광 활성화 된 세포를 사용하여 평가할 수있다 하나의 줄기 세포와 같은 세포 클론 개발을 형성한다. 여기에서 우리는 세포 라인 또는 기본 환자 샘플, 자신의 계대 및 구 F를 추정하는 계산에서 mammospheres의 적절한 배양 방법을 간략하게 설명orming 효율 (SFE). 먼저 우리는 적절한 계획과 mammosphere 실험의 해석에 주요 고려 사항과 함정에 대해 설명합니다.
Introduction
줄기 같은 암 줄기 세포가 이끄는 종양 세포 계통의 존재는 크게 종양 이질성에 대한 우리의 이해에 추가했다. 종양의 일부 표현형 다양성 유전자 구별 클론의 클론 생장에서 발생 않지만, 실질적인 성분은 후생 유전 학적 차이에 기인하는 것으로 나타난다 : 암 세포가 특정 유전자의 활성화 또는 억제를 통해 줄기, 전구 및 분화 상태 사이 (가역적 때때로) 전환 할 수 식 프로그램 1-3. 이것은 현재 조절 성 요소를 제공하는 암, 간질 또는 면역 인접 셀로부터 측 분비와 함께 그 결과의 분비 신호와 세포에서 발현되는 유전자 발현 프로그램을 반영 셀 고유 또는 외인성 인자를 반영하고있다 같은 정도로서 microenviromental 조건 저산소증 2,4,5.
혁신적인 혈통 추적 방법이지만이들 생체 내 틈새 (6)에 추정되는 암 줄기 세포를 연구 할 수있는 능력 전진 - 8 구 - 형성 분석법 적어도 사용 분석 조건 하에서, 줄기 세포처럼 행동하도록 유방암 세포 잠재력을 추정 인기 편리한 접근 남아있다. 그것은 종종 더 mesenchymal- 상피 대응하도록 제안되어 막 마커 CD44 및 CD24 9 및 효소 ALDH (알데히드 탈수소 효소)의 활동 수준 (10), 마커의 발현에 의해, 정화 암 줄기 세포 대 향적 방법과 함께 사용 -like 암 줄기 세포 각각 11. 구 형성 방법이 제 상피 성장 인자 (EGF) (12)의 첨가 비 점착성, 무 혈청 조건에서 단일 클론으로부터 추정되는 줄기 세포의 성장을 가능 neurosphere 분석법 개발되었다 나중에 유용 정상 및 암에 적용되는 유방 조직.
뼈 선의의 줄기 세포는 생체 내에서 활성화를 선호 할 요인의 정확한 조합을 발생하지 않습니다, G0 단계에서 내립니다. mammosphere 분석 대신 유사 분열 부문 태세 이미 13을 분할하거나 세포의 성장을 할 수 있습니다. 이들 전구 세포가 아닌 세포 진정한 정지되지만, 분석에 사용 된 EGF 및 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF)와 유사 분열 증식 세포 단계 일 수있다. 그럼에도 불구하고, 그들은 활성화 줄기 세포 - 관련 시그널링의 범위 (14) 경로를 포함하고있다. 또한, 그 형성 속도는 마우스 이종 이식편에서 2,15,16을 제한 희석 분석에서의 역가 측정들이 찍은 된 조직의 종양 발생에 관한 </ SUP>.
여기서 우리는 단일 세포를 분리 및 인간 유방암 세포주 및 유방암의 임상 샘플 모두로부터 mammospheres 차를 생성하기 상세한 프로토콜을 제공한다. 우리는 또한 자기 갱신을 평가하는 주요 mammospheres의 일련 구절을 수행하는 방법, 및 구 다른 시드 밀도에서 비교를 (그림 1의 방식을 참조) 할 수 있습니다 효율성을 형성 계산하는 방법에 대해 설명합니다.
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Protocol
절차는 다음과 윤리적 임페리얼 칼리지, 런던에 의해 승인되었습니다.
인간 유방암 세포주에서 차 Mammospheres의 1 세대
참고 : 멸균 문화 후드에서 다음 단계를 수행하십시오.
- Mammosphere 미디어 2 mM의 L- 글루타민이 보충 된 DMEM / F12, 100 U / ㎖ 페니실린, 100 U / ml의 스트렙토 마이신을 함유하는 준비한다. 10 NG / ml의 재조합 인간 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF; R & D 시스템) 및 1X B27 보충제 20 NG / ml의 재조합 인간 상피 성장 인자 (시그마 EGF)을 첨가하여 사용 직전에 완료 매체를 준비한다.
- (또는 원하는 유방암 세포주 70-80 % 컨 플루 언스 (confluence)에) 부착 MCF-7 또는 MDA-MB-231 세포를 함유하는 플라스크 대기음 매체는 1X PBS에 두 번 세척하고, 세포를 Trypsinize.
- 실온에서 5 분 동안 원심 분리기 (200) XG 세포. mammosphere 미디어의 1-5 ml의 디 캔트 뜨는에 resuspend 세포. 피펫40 μm의 셀 스트레이너 캡 필터 상하 필요한 사용하는 경우, 단일 세포 현탁액을 얻었다. 단일 세포 현탁액 (그렇지 않은 경우, 3 회에 세포 현탁액을 주사기 25 G 바늘을 사용하여) 형성하고 있도록 혈구를 사용한다.
- FACS를 통해 필요한 분리 된 CD44 + CD24- 세포의 일부는 항 CD24 피코 에리 트린 (PE) 및 항 CD44-형광 이소 티오 시아 네이트 (FITC) 단일 클론 항체 (9)를 사용하는 경우. 또한, 자기 활성화 된 셀 정렬 안티 CD44 및 제조업체의 지침에 따라 항 CD24 - 바이오틴 결합 된 마이크로 비즈 (MACS) 시스템을 사용하는 인구를 분리. LD 열을 사용하여 LS 열을 사용하여 긍정적 인 선택, 음의 선택을 수행하고 17 유동 세포 계측법에 의해 모든 격리 세포의 표현형을 확인합니다.
- 트리 판 블루를 사용하여 1 mL 당 생존 세포의 수를 계산합니다.
주 : 세포 생존율에 hemocy 그리드 내의 셀의 총 개수로 나누어 생존 세포의 수로서 계산된다tometer. 트리 판 블루를 차지 세포가 아닌 실행 가능한 것으로 간주됩니다. 다음 절차를 정확하게 생존 세포의 비율을 결정하는데 사용된다.- PBS에서 트리 판 블루의 0.4 % 용액을 준비합니다. 세포의 1 ml의 트리 판 블루 원액 0.1 ML을 추가합니다. 혈구를 넣고 낮은 배율 현미경으로 즉시 검사합니다. 총 셀의 개수와 블루 염색 세포의 수를 계산.
가능한 세포 = [1.00 - (파란색 셀의 수 ÷ 총 세포 수)] × 100. - 배양 1 ㎖ 당 생존 세포의 수를 계산하는 아래의 식을 사용한다. 희석 배수를 보정해야합니다.
104 × 1.1 = 세포 / ㎖ 문화 × 가능한 세포의 수
- PBS에서 트리 판 블루의 0.4 % 용액을 준비합니다. 세포의 1 ml의 트리 판 블루 원액 0.1 ML을 추가합니다. 혈구를 넣고 낮은 배율 현미경으로 즉시 검사합니다. 총 셀의 개수와 블루 염색 세포의 수를 계산.
- 6- 웰 초저 부착 플레이트의 각 웰에 전체 mammosphere 미디어 2 ㎖로 세포의 사전 결정된 양을 재현 탁. 파종 밀도는 일반적으로 500-4,000 세포 / cm 아니라 당이 세포입니다. 선택적으로 사용 싸다w 부착 24 웰 플레이트는 매체의 0.5 ml의 동일한 밀도로 세포를 파종한다.
참고 : 우리는 관심의 각 세포주에 대한 파종 밀도와 문화의 시간을 최적화하는 것이 좋습니다. - 특히 제 오일의 성장 단계에서, 플레이트를 방해하지 않고 (세포주 및 mammospheres의 크기에 따라) 5-10일 37 ° C, 5 % CO 2에서 초저 부착 6 웰 플레이트를 인큐베이션 .
인간의 유방암 임상 샘플에서 차 Mammospheres의 2 세대
주 : 인간 유방암 조직 유방 종양의 제거를위한 수술을받은 환자로부터 얻을 수있다. 100 U / ml의 페니실린 100 U / ml의 스트렙토 마이신을 포함하는 배지에서 50 ml의 멸균 튜브에 최대 24 시간 동안 얼음에 저장 조직. 멸균 문화 후드에서 다음 단계를 수행합니다.
- 미디어의 작은 부피와 100mm 조직 배양 접시에 시료를 전송합니다. Remov멸균 가위, scapel 및 핀셋을 사용하여 전자 지방 조직.
- DMEM / F12의 2-3 ML을 추가하고 더 큰 조각이 남아 있지 않을 때까지 살균 scapel 또는 면도날 1mm 3 조각으로 샘플을 말하다.
- 목록 조직편 재현 탁 단백질 분해 효소 (3,000 U / ml의 콜라겐 및 1000 U / ㎖의 히알루로니다 아제)를 함유하는 10 ㎖의 DMEM을 프리 - 가온하고 모든 조직 파편이 소화 될 때까지 회전 진탕하에 37 ℃에서 배양한다. 일반적으로 완전한 소화은 1-3 시간 정도 걸립니다. 종양의 병리학 자에 따라 소화 시간을 조정합니다. (예를 들어 유방 선암 더 취약 짧은 소화 시간이 필요 점액 성 암종에 비해 소화가 일반적으로 어렵다). 혈구에서 20 μl의 서스펜션을 관찰하여 소화 모든 ½ 시간의 정도를 평가합니다.
- 단편 후, 5 분 동안 침강 실 TEM에서 10 분 동안 200 XG에 15 ml의 원추형 폴리 프로필렌 원심 분리 튜브에 상청을 전송하도록 허용아네트. mammosphere 매체 5 ㎖ - 조심스럽게 1에 재현 탁하고 세포 상등액을 가만히 따르다.
- 취득 및 단일 세포 현탁액을 도금하는 세포주를 위해 위의 설명 된 단계 1.1 ~ 1.4을 따릅니다. 필요한 경우 G (25)를 통해 세포가 세포 손상을 제한하기 위해 2 배의 최대 시린지 패스.
3. Mammosphere 효율 (%) 계산 성형
- 배양 기간 후, 40 배 배율 현미경 mammospheres (이상 40 μm의) 직경을 계산합니다. 디지털 화상 (5) 임의의 광학 현미경에 디지털 카메라를 사용하여 필드 및 수집 소프트웨어를 이용 mammospheres 크기를 결정한다. 어떤 이미지 분석 소프트웨어를 사용합니다.
- 다음 식을 이용 Mammosphere 형성 효율 (MFE의 %)을 계산한다
MFE (%)는 = (웰당 mammospheres의 #은) / (웰 당 세포의 접종은 #) × 100
자기 갱신의 평가를위한 Mammospheres 4. 직렬과 Passaging
- 뜨는을 취소하고 미리 예열 0.5 % 트립신 / 0.2 % EDTA의 500 μL에 펠렛을 재현 탁. 2 ~ 3 분 동안 품어.
- 트립신을 중화 FCS 500 μl를 추가합니다. 5 분 동안 500 XG에 원심 분리기. 구체들을 분해 아래로 mammospheres 미디어, 피펫 최대 100 ㎕에 뜨는에 resuspend 펠렛을 취소하고.
- 혈구와 세포를 세어 세포는 단일 세포 현탁액에있는 경우 결정합니다. 25 G를 통과하지 않으면 단일 세포를 얻기 위해 3 회까지 주사기. 기본 생성에 사용되는 동일한 농도에서 새로운 초저 부착 6 웰 플레이트에 세포를 시드.
- 5-10일 후, 구> 40 μm의 수와 이전에보고 된 공식을 사용하여 구체 형성 효율을 계산한다.
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Representative Results
다른 샘플이나 다른 치료를 실시 그 시드 초기 세포 정상화 후 형성 mammospheres> 40 μm의 수에 따라 다를 수 있습니다. 세중에서 재배 각각의 치료를위한 mammosphere 형성 효율 (MFE)를 계산합니다. 이것은 다른 시드 밀도 실험을 비교 할 수 있습니다. 데이터는 가장 이상적 양성 및 음성 대조군으로, 막대 그래프에 표시하고, 삼중 웰 걸친 표준 편차를 표시한다. 지속적으로 60-80% 합류 사이에 비 부착 판에 부착 된 세포를 전송합니다. 조심 셀 카운팅 정확하게 치료의 효과를 정량화에 필수적이다. 이 중요한 단계가 아니라 같은 처리는 별도로 여러 현탁액을 준비하여 결과에 기여하고 변화의 정도를 예측. 측정 된 세포 농도가 같은 우물에서 크게 다른 경우, 귀하의 계산 방법 (그림 2) 정제 고려하십시오.
도 1 : 일차 유방암 및 세포주 샘플 처리 mammosphere 배양을 얻었다 샘플은 효소 적 소화, 단일 세포로 검증 및 성장 인자와 함께 무 혈청 mammosphere 매체에 미부착 된 플레이트 상에 플레이 팅된다.. 플레이트를 구 융합을 피하기 위해 성장기 취급되어서는 안된다. 오른쪽 사진은 오일 촬영 후 대표 MCF-7 구체를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 긍정적 인 상피 에스트로겐 형성 mammospheres의 대표 결과 (MCF-7), 및 중간 엽 트리플 negati했습니다 (MDA-MB-231) 세포주. 최소 세포 융합 / 통합은 MCF-7 500 세포 / ㎠ 여기에, 저밀도 도금에 의해 달성, 1,000 세포 / cm 2 MDA-MB-231에 대한했다.
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Discussion
기본 및 보조 mammospheres의 성공적인 평가는 세포가 최소한의 구 집합으로, 단일 클론에서 양식을 mammospheres 충분히 낮은 밀도에서 도금되는에 의존합니다. 그러나 너무 낮은 밀도가 너무 적었 mammospheres 통계적 처리의 효과를 구별하기 위해 형성 할 수있다. 파종 밀도가 그들의 영역 형성의 효율에 상당히 다를 수 있기 때문에 사용 된 각각의 세포주에 대해 최적화되어야한다 (낮은 E-cadherin의 표현들은 덜 안정하고 짧은 기간 mammosphere 배양 물 (18)을 형성 할 수있다). 이 최적화 단계는 단일 세포의 클론 성장에서 가장 기본 및 보조 구 형성 결과를 확인해야합니다. 웰 당 하나의 셀을 도금 전적으로 mammosphere 클론 형성을 보장하는 유일한 방법이며, 새롭게 도출 된 샘플 (13)의 자기 갱신 / 분화 속도를 정량화 추천 할 수있다. 그러나이 방법은 복잡 요인을 앓고 : mammosphere 형성1 %의 효율은 96 웰 플레이트 당 하나 mammosphere을 수득하며, 효율이 적은 mammospheres 현탁 세포 간의 시그널링 분비 성장 인자의 부재로 형성되고, 과소 평가 될 수있다. 마지막으로, 계대 후 보조 분야의 주파수는 자기 갱신의 수준을 추정 할 수 있으며, 진정으로 암 줄기 세포 특성을 가진 세포를 선택하면 기본 구 형성보다 차의 높은 효율을 기대할 수 있어야합니다. 보조 분야와 세포 형 적합한 매우 낮은 세포 밀도가 향해 최적화되어야 유도 할 때 재 응집는 특정 문제입니다.
또한 달라질 수 μm의 40>에 mammospheres 걸리는 시간이 증가하고, 임상 샘플에서 mammospheres이 분야의 성장 속도에 따라 5~12일 사이에 계산해야 할 수도 있습니다. 응집 분야의 융합은 불가피 매체 주변 셀 고유의 운동에 의해 발생하지만, 프로세스가 실질적 EX 의해 향상 될 것으로 보인다성장기 동안 19 플레이트를 이동 perimenters 따라서 무언가 피해야한다.
큰 분야가 일상적으로 높은 장기 복제 능을 가진 줄기 세포에서 온 것으로 생각되고 있지만,이 가정은 신중하게 취급되어야한다. 큰 구체 전구 세포의 증식 능력, 성장 인자에 대한 응답 성을 반영, 또는 통합 또는 융합의 산물 일 수있다. 두 종류의 세포가 여전히 결합 된 주파수 소스 조직의 종양 발생을 반영 할 수 있지만, 두 줄기 세포 및 그들의 중계 증폭 딸세포는 mammospheres 20 이르게 할 수있다.
mammosphere 분석들은 생체 내 틈새에서 암 줄기 세포의 형성 및 동작의 복잡성을 캡처 실패에 의해 제한된다. 진정으로 시험 관내 및 생체 자기 갱신 전향 절연 유방암 줄기 세포의 분화에 mammo 장기보고자구 분석 따라서 이상적으로 혈통 추적 및 이종 이식 실험과 함께 수행해야합니다. 리니지 정확하게 추적 암 줄기 세포 서브 세트를 반영 마커에 의존하는 반면, 그들은 '뼈 성실한'암 줄기 세포의 형성에 기여 동적 생체 조건을 유지 크게 혜택. 여전히 인간의 면역과 기질 구성 요소 (21)이 부족한 상태에서 면역 마우스에 이종 이식 실험에서 종양 형성을 평가하면, mammosphere 분석에서 누락 된 많은 틈새 구성 요소를 제공 할 것입니다. 기술적으로 까다로운 있지만, 이러한 기술은 유방암 줄기 세포의 특성과 발암에 대한보다 완전하고 정보보기를 시도해야합니다.
mammosphere 분석은 유익하고 편리한 도구를 제공한다,주의 깊게 수행되고 위의 제한 사항이 고려 제공 : 실제로 생체 콘돌리자에 대한 우리의 지식으로암 줄기 세포의 진보에 의해 경험 TIONS는 mammosphere 분석은 분자 및 환경 요인의 증가 범위를 포함 할 수있다. 위에서 설명한 방법을 사용하여, 구형 형성 속도는 이종 이식 2,15,16에서 종양 개시 속도에 대응하고, 구체의 자기 갱신은 더 공격적인 유방암 (22)의 증가와 화학 요법 (23) 등 다음과 같은 줄기 세포 증가 개입을한다. 한편 분야 자체 발현 차이와 줄기 세포의 유전자 발현에 관여하는 신규 한 구조 요인을 연구와 귀중한 자원을 제공 할 수있다.
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Acknowledgments
이 작품은 힐러리 공예, 선생님 더글러스 마이어스 특별한 언급과 제국 BRC, 건강 연구를위한 국립 연구소 및 조치에 대하여 암에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Lonza | CC-3151 | |
| 2 mM L-glutamine | Sigma Aldrich | G8540 | |
| 100 U/ml Penicillin & Streptomycin | Sigma Aldrich | P4083 | |
| 20 ng/ml Recombinant human epidermal growth factor (EGF) | Sigma Aldrich | E9644 | |
| 20 ng/ml Recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF) | R&D systems | 233-FB-025 | |
| 1x B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Scientific | 12399902 | |
| 0.5% trypsin/0.2% EDTA | Sigma Aldrich | 59418C | |
| Fetal calf serum | First Link UK | 02-00-850 | |
| Trypan blue | Sigma Aldrich | 93595 | |
| Low attachment 6-well plates | Corning | CLS3814 | |
| Collagenase type 1A | Sigma Aldrich | C9891 | |
| Hyaluronidase | Sigma Aldrich | H3506 | |
| Sterile razor blades | Fisher Scientific | 12443170 | |
| Sterile scalpel | Fisher Scientific | 11758353 | |
| Sterile micro-dissecting scissors | Sigma Aldrich | S3146 |
References
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