Floating mammosphere assays can investigate the subset of stem-like breast cancer cells that survive in suspension conditions and show enhanced tumorigenesis when implanted into mice. This protocol provides a convenient in vitro measure of sphere-forming ability, a proxy for in vivo tumorigenesis, while facilitating analysis of the stem-associated transcriptional landscape.
Svarende til raske væv, mange blod og faste maligniteter nu menes at være organiseret hierarkisk, med en delmængde af stamceller-lignende kræftceller, selv forny og samtidig give anledning til mere differentieret afkom. Forståelse og målretning af disse kræft stamceller i brystkræft, hvilket kan har forbedret kemo- og radio-resistens i forhold til de ikke-stammen tumor bulk, er blevet et vigtigt forskningsområde. Markører, herunder CD44, CD24, og ALDH aktivitet kan vurderes ved anvendelse af fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) for fremadrettet isolere celler, der udviser forøget tumorgenicitet når implanteret i immunkompromitterede mus: den mammosphere assay er også blevet almindeligt anvendt til dets evne til efterfølgende at identificere sphere- dannende celler, der udvikler fra enkelt stamcelle-lignende kloner. Her skitsere metoder til hensigtsmæssig dyrkning af mammospheres fra cellelinjer eller primære patientprøver, deres passage og beregnede skøn sfære forming effektivitet (LSU). Først skal vi diskutere centrale overvejelser og faldgruber i den relevante planlægning og tolkning af mammosphere eksperimenter.
Eksistensen af tumor celleslægter ledet af stamceller-lignende cancer stamceller har i høj grad tilføjet til vores forståelse af tumor heterogenitet. Mens nogle fænotypiske diversitet i tumorer er en følge af den klonal udvækst af genetisk forskellige kloner, vises en væsentlig komponent at skyldes epigenetiske forskelle: kræftceller kan skifte (undertiden reversibelt) mellem stængel, stamfader, og differentierede tilstande via aktivering eller undertrykkelse af specifikt gen udtryk programmer 1 – 3. Dette kan afspejle celle indre eller ydre faktorer, der afspejler genekspression program, der aktuelt udtrykkes i en celle med dens resulterende autokrint signalering sammen med parakrin signalering fra nabolandet kræft, stromale eller immunceller leverer modulerende faktorer, og microenviromental forhold som graden af hypoxi 2,4,5.
Selv innovative afstamning sporing tilgangeer fremme vores evne til at studere formodede cancer stamceller i deres in vivo niche 6-8, forbliver sfære-dannende assays en populær og praktisk tilgang til at estimere brystkræftceller potentiale at opføre sig som stamceller, i det mindste under assaybetingelserne anvendte. Det er ofte bruges sammen med tilbagevirkende kraft fremgangsmåder til oprensning cancer stamceller ved deres ekspression af membran markører CD44 og CD24 9 og aktivitetsniveauer af enzymet ALDH (aldehyddehydrogenase) 10, markører, der er blevet foreslået til at svare til mere mesenchymal- og epithelial -lignende cancer stamceller henholdsvis 11. Kuglen dannelse fremgangsmåde blev først udviklet som neurosfæren assay, muliggør vækst af formodede stamceller fra enkelte kloner i ikke-adhærente, serumfri betingelser med tilsætning af epitelial vækstfaktor (EGF) 12, senere bliver fordel anvendes til normal og kræft brystvæv.
<p class = "jove_content"> Identiteten af kuglen-dannende grundlægger celle, og de blandede celletyper, der udgør sfære masse, er relevante for de konsekvenser, der kan gøres fra mammo- eller anden-sfære dannende assays. Langsigtede hvilende knogle fide stamceller, menes at hvile i G0 fase, vil ikke opleve den præcise kombination af faktorer, der favoriserer aktivering in vivo. Den mammosphere analysen i stedet muliggør væksten af celler enten klar til mitotiske deling eller allerede dividere 13. Disse progenitorer, men ikke en virkelig hvilende celle kan være cellen fase, prolifererer med mitogener EGF og basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF), der anvendes i assayet. Ikke desto mindre indeholder en række aktiverede stamcelle-associerede signalveje 14. Desuden hastigheden for deres dannelse angår tumorigeniciteten af det væv, de blev taget fra, når den måles ved deres potens i begrænset fortynding assays i muse-xenotransplantater 2,15,16 </ Sup>.Her giver vi detaljerede protokoller til at isolere enkelte celler og generere primære mammospheres fra både humane brystcancercellelinier og kliniske prøver af brystkræft. Vi beskriver også, hvordan du udfører serielle passager af primære mammospheres at vurdere selvfornyelse, og hvordan man beregner sfære danner effektivitet der muliggør en sammenligning på tværs af forskellige seeding tætheder (se skema i figur 1).
Vellykket vurdering af primære og sekundære mammospheres afhængig celler bliver forgyldt ved tilstrækkeligt lave tætheder der mammospheres form fra enkelte kloner, med minimal sfære sammenlægning. Men ved tætheder, der er for lav, kan for få mammospheres danne at skelne effekten af behandlinger statistisk. Podningstæthed bør optimeres for hver cellelinje anvendes, da de kan variere meget i deres sfære danner effektivitetsgevinster (dem der udtrykker lav E-cadherin kan danne mindre stabile og kortere si…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde støttes af Imperial BRC, National Institute for Health Research, og en indsats mod kræft med særlig omtale til Hilary Craft og Sir Douglas Myers.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
DMEM/F12 | Lonza | CC-3151 | |
2mM L-Glutamine | Sigma Aldrich | G8540 | |
100U/ml Penicillin & Streptomycin | Sigma Aldrich | P4083 | |
20ng/ml recombinant human epidermal growth factor (EGF) | Sigma Aldrich | E9644 | |
20ng/ml recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF) | R&D systems | 233-FB-025 | |
1x B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
Phosphate buffered saline (PBS); | Thermo Scientific | 12399902 | |
0.5% trypsin-0.2%EDTA; | Sigma Aldrich | 59418C | |
Fetal Calf Serum | First Link UK | 02-00-850 | |
Trypan Blue | Sigma Aldrich | 93595 | |
Low attachment 6 well plates | Corning | CLS3814 | |
Collagenase type 1A | Sigma Aldrich | C9891 | |
Hyaluronidase | Sigma Aldrich | H3506 | |
Sterile razor blades | Fisher Scientific | 12443170 | |
Sterile scalpel | Fisher Scientific | 11758353 | |
Sterile micro-dissecting scissors | Sigma Aldrich | S3146 |