Abstract
De manera similar a los tejidos sanos, muchos de sangre y tumores malignos sólidos están ahora cree que están organizados jerárquicamente, con un subconjunto de células de cáncer de tallo como la auto-renovarse mientras que da lugar a la progenie diferenciada. La comprensión y la orientación de estas células madre del cáncer en el cáncer de mama, que pueden poseer mejorado quimio y radio-resistencia en comparación con el volumen del tumor no tallo, se ha convertido en un área de investigación importante. Marcadores incluyendo CD44, CD24, y la actividad de ALDH se pueden evaluar usando células activadas por fluorescencia (FACS) para aislar de forma prospectiva células que muestran una mayor tumorigenicidad cuando se implantan en ratones inmunodeficientes: el ensayo mammosphere también se ha convertido en ampliamente utilizado por su capacidad para identificar de forma retrospectiva esfera- formación de células que se desarrollan a partir de clones de células madre similares sola. Aquí resumimos los enfoques para el cultivo apropiado de mammospheres partir de líneas celulares o muestras de pacientes primarios, su pases, y los cálculos para estimar esfera feficiencia orming (SFE). En primer lugar se discuten consideraciones clave y las trampas en la planificación y la interpretación de los experimentos mammosphere apropiado.
Introduction
La existencia de linajes de células tumorales encabezadas por las células madre del cáncer de tallo como ha contribuido en gran medida a nuestra comprensión de la heterogeneidad del tumor. Mientras que algunos diversidad fenotípica en los tumores no surgen de la excrecencia clonal de clones genéticamente distintas, un componente sustancial parece resultar de diferencias epigenéticas: las células cancerosas pueden transición (a veces de forma reversible) entre el vástago, progenitor, y los estados diferenciados través de la activación o represión de genes específicos programas de expresión 1-3. Esto puede reflejar celulares factores intrínsecos o extrínsecos, que refleja la expresión génica programa que actualmente se expresa en una célula con su señalización autocrina resultante en conjunción con la señalización paracrina de la vecina cáncer, del estroma o células inmunes entrega de factores moduladores, y las condiciones microenviromental tales como el grado de hipoxia 2,4,5.
Aunque innovadores enfoques linaje de rastreoavanzan nuestra capacidad para estudiar las células madre del cáncer putativos en su in vivo nicho 6-8, los ensayos de formación de esferas siguen siendo un método popular y conveniente para estimar el potencial de las células de cáncer de mama de comportarse como células madre, al menos en las condiciones de ensayo utilizados. A menudo se utiliza junto con los métodos retrospectivos de las células madre del cáncer de purificación, por su expresión de marcadores de membrana CD44 y CD24 9, y los niveles de actividad de la enzima ALDH (aldehído deshidrogenasa) 10, los marcadores que se han propuesto para corresponder a más mesenchymal- y epitelial Las células madre del cáncer -como respectivamente 11. El enfoque de formación de esferas fue desarrollado primero como el ensayo neurosphere, lo que permite el crecimiento de las células madre putativas de clones individuales en condiciones libres no adherentes, de suero con la adición de factor de crecimiento epitelial (EGF) 12, después de ser útil aplicar a normal y canceroso tejidos de la mama.
óseas quiescente fide madre a largo plazo, que se cree que descansan en fase G0, no experimentará la combinación precisa de factores que favorecerían la activación in vivo. El ensayo mammosphere vez permite el crecimiento de células o bien preparada para la división mitótica o ya divisorias 13. Estos progenitores, aunque no realmente una célula quiescente, pueden ser la etapa de célula que prolifera con los mitógenos de EGF y el factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) utilizados en el ensayo. Sin embargo, contienen una serie de señalización asociada a las células madre activado vías 14. Además, la tasa de su formación se refiere a la tumorigenicidad del tejido que se tomaron de, cuando se mide por su potencia en ensayos de dilución limitada en xenoinjertos de ratón 2,15,16 </ Sup>.
Aquí nos proporcionan protocolos detallados para aislar células individuales y generar mammospheres primarias de ambas líneas celulares de cáncer de mama humano y muestras clínicas de los tumores de mama. También describe cómo realizar pases seriados de mammospheres primarios para evaluar la auto-renovación, y la forma de calcular la eficiencia esfera que permite la comparación entre diferentes densidades de siembra (véase el esquema de la figura 1) que forma.
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Protocol
Los procedimientos a continuación han sido éticamente aprobado por el Imperial College de Londres.
1. Generación de mammospheres primarias de Mama Humano líneas celulares de cáncer
NOTA: Realice los siguientes pasos debajo de una campana de cultivo estéril.
- Prepare mammosphere los medios de comunicación que contiene DMEM / F12 suplementado con 2 mM L-glutamina, 100 U / ml de penicilina, 100 U / ml de estreptomicina. Preparar medio completo inmediatamente antes del uso mediante la adición de 20 factor de ng / ml recombinante de crecimiento epidérmico humano (EGF; Sigma), 10 ng / ml de factor recombinante humano de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF; R & D Systems) y suplemento 1x B27.
- Aspirar los medios de frasco que contiene las células MCF-7 o MDA-MB-231 células adherentes (o una línea celular de cáncer de mama de su elección; 70-80% de confluencia), se lavan dos veces en PBS 1x y trypsinize células.
- Centrifugar las células a 200 xg a temperatura ambiente durante 5 min. Sobrenadante y volver a suspender las células de decantación en 1-5 ml de medio mammosphere. Pipetaarriba y abajo y si es necesario, utilice un filtro de tapa filtro de células de 40 micras para obtener la suspensión de una sola célula. Utilice un hemocitómetro para asegurar una suspensión de células se ha formado (si no, utilizar una aguja de 25 G a la jeringa de la suspensión celular hasta 3 veces).
- Si CD44 + CD24- aislado necesario subconjunto celular a través de FACS usando anti-CD24-ficoeritrina (PE) e isotiocianato (FITC) anticuerpos monoclonales anti-CD44 9-fluoresceína. Alternativamente, aislar dicha población usando una célula magnético activadas por la clasificación del sistema (MACS) con anti-CD44 y anti-combinados microperlas CD24-biotina según las instrucciones del fabricante. Realice la selección positiva utilizando LS columnas, y la selección negativa utilizando columnas de LD y confirmar los fenotipos de todas las células aisladas por citometría de flujo 17.
- Calcular el número de células viables por ml utilizando azul de tripano.
NOTA: La viabilidad celular se calcula como el número de células viables dividido por el número total de células dentro de las rejillas en el hemocyfotómetro. Las células que ocupan azul tripán se consideran no viables. El siguiente procedimiento se utiliza para determinar con precisión la proporción de células viables.- Preparar una solución de 0,4% de azul de tripano en PBS. Añadir 0,1 ml de solución madre de azul de tripano a 1 ml de las células. Cargar un hemocitómetro y examinar inmediatamente bajo un microscopio a bajo aumento. Contar el número de células totales y el número de células de tinción con azul.
Las células viables = [1,00 - (Número de células azules ÷ Número de células totales)] × 100. - Para calcular el número de células viables por ml de cultivo, utilizar la siguiente fórmula. Recuerde que debe corregir el factor de dilución.
Número de células viables × 10 × 1,1 = 4 células / ml de cultivo
- Preparar una solución de 0,4% de azul de tripano en PBS. Añadir 0,1 ml de solución madre de azul de tripano a 1 ml de las células. Cargar un hemocitómetro y examinar inmediatamente bajo un microscopio a bajo aumento. Contar el número de células totales y el número de células de tinción con azul.
- Resuspender una cantidad predeterminada de células en 2 ml de medio mammosphere completos en cada pocillo de una placa de 6 pocillos adherente ultra-bajo. La densidad de siembra es normalmente 500-4.000 células / cm 2 células por pocillo. Uso Opcionalmente low de fijación placas de 24 pocillos, mientras que la siembra de células a la misma densidad en 0,5 ml de medios de comunicación.
Nota: Se recomienda la optimización de la densidad y la hora de la cultura de siembra para cada líneas celulares de interés. - Incubar bajo fijación 6 y placas de ultra a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 5-10 días (dependiendo de la línea celular y el tamaño de mammospheres) sin molestar a las placas, en particular durante la fase de crecimiento de los primeros 5 días .
2. Generación de mammospheres primarias de muestras clínicas de cáncer de mama humano
NOTA: el tejido de cáncer de mama humano puede obtenerse de pacientes sometidos a cirugía para la eliminación de tumores de mama. Tejido de la tienda en hielo durante hasta 24 horas en tubos de 50 ml estériles en medios de cultivo que contiene 100 U / ml de penicilina y 100 U / ml de estreptomicina. Lleve a cabo los siguientes pasos bajo una campana de cultivo estéril.
- Transferir la muestra en un plato de 100 mm de tejido de Petri con un pequeño volumen de medios de comunicación. Remove el tejido adiposo con unas tijeras estériles, bisturí y pinzas.
- Añadir 2-3 ml de DMEM / F12 y picar la muestra en 1 mm 3 piezas con un escalpelo estéril u hoja de afeitar hasta que no haya piezas grandes se mantienen.
- Resuspender las piezas de tejido en pre-calentado 10 ml de DMEM que contiene enzimas proteolíticas (3000 U / ml de colagenasa y 1.000 U / ml de hialuronidasa) y se incuba a 37 ° C en un agitador rotatorio hasta que se digieren todos los fragmentos de tejido. Por lo general, la digestión completa tarda 1-3 horas. Ajuste el tiempo de digestión de acuerdo con caracteres patológicos de los tumores. (Por ejemplo adenocarcinoma de mama es generalmente más difícil de digerir en comparación con carcinoma mucinoso, que es más frágil y necesita más corto tiempo de digestión). Evaluar el grado de digestión cada media hora observando 20 l suspensión bajo hemocitómetro.
- Permitir que los fragmentos sedimentar durante 5 min, luego transferir el sobrenadante en un tubo de polipropileno cónico de 15 ml y centrifugar a 200 xg durante 10 min a tem habitaciónambiente. Decantar con cuidado las células sobrenadante y resuspender en 1 - 5 ml de medios mammosphere.
- Siga los pasos 1.1 a 1.4 descritas anteriormente para las líneas celulares para la obtención y la placa de suspensiones de células individuales. Pasan células a través de la jeringuilla 25 G un máximo de 2 veces si es necesario para limitar las células perjudiciales.
3. La formación de mammosphere Eficiencia (%) Cálculo
- Después de que el período de cultivo, contar los mammospheres (mayor que 40 m) de diámetro bajo un microscopio a 40 aumentos. Imagen digitalmente 5 campos aleatorios utilizando una cámara digital en un microscopio de luz y determinan el tamaño mammospheres utilizando el software de adquisición. Utilice cualquiera de Análisis de Imágenes Software.
- Calcular mammosphere eficacia de formación (MFE%) usando la siguiente ecuación:
MFE (%) = (# de mammospheres por pocillo) / (# de células sembradas por pocillo) x 100
4. pasada en serie de mammospheres para la Evaluación de la auto-renovación
- Desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 500 l de 0,5% de tripsina / 0.2% EDTA pre-calentado. Incubar durante 2-3 minutos.
- Añadir 500 l de FCS para neutralizar la tripsina. Centrifugar a 500 xg durante 5 min. Desechar el sobrenadante y pellet se resuspende en 100 l de mammospheres medios de comunicación, la pipeta hacia arriba y hacia abajo para desagregar las esferas.
- Contar las células con un hemocitómetro y determinar si las células están en suspensión de células individuales. Si no pasa a través de una jeringa 25 G hasta 3 veces para obtener células individuales. Sembrar las células en un nuevo mínimo apego placa de 6 pocillos de ultra a la misma densidad utilizado en la generación primaria.
- Después de 5-10 días, contar esferas> 40 micras y calcular la eficiencia de formación de esferas mediante la fórmula informado antes.
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Representative Results
Diferentes muestras o los sometidos a diferentes tratamientos pueden variar en el número de mammospheres> 40 micras que se forman después de la normalización para las células iniciales sembradas. Calcular formando mammosphere eficiencia (MFE) para cada tratamiento crecido por triplicado. Esto permite experimentos con diferentes densidades de siembra que deben compararse. Los datos se muestra mejor en un gráfico de barras, idealmente con controles positivos y negativos, y la visualización de la desviación estándar a través de los pocillos por triplicado. Transferir consistentemente células adherentes en placas no adherentes entre un 60-80% de confluencia. El recuento de células cuidadosa es esencial para cuantificar con precisión los efectos de los tratamientos. Estimar el grado de variabilidad que este paso clave está contribuyendo a sus resultados mediante la preparación de varias suspensiones por separado del mismo tratamiento también. Si la concentración de células medida difiere significativamente del mismo pozo, considere refinar su enfoque de conteo (Figura 2).
Figura 1: Tratamiento de los cánceres de mama primarios y muestras de líneas celulares para obtener cultivos mammosphere muestras se digirieron enzimáticamente, validados como células individuales, y se sembraron en placas no adherentes en medio mammosphere libre de suero con factores de crecimiento.. Las placas no deben ser manipulados durante la fase de crecimiento para evitar la fusión esfera. La imagen de la derecha muestra representativas MCF-7 esferas fotografiados después de 5 días. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Los resultados representativos de mammospheres formados a partir de un estrógeno positivo epitelial (MCF-7), y un mesenquimales negati Triplecinco (MDA-MB-231) línea celular. fusión celular Minimal / agregación se logró mediante chapado de baja densidad, aquí, en 500 células / cm 2 para MCF-7, y 1.000 células / cm 2 para MDA-MB-231.
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Discussion
Evaluación exitosa de mammospheres primaria y secundaria se basa en las células se sembraron a densidades suficientemente bajas que mammospheres forma de clones individuales, con un mínimo de agregación esfera. Sin embargo a densidades que son demasiado bajo, demasiado pocos mammospheres pueden formar para distinguir los efectos de los tratamientos estadísticamente. Densidad de siembra debe ser optimizado para cada línea celular utilizada, ya que pueden variar considerablemente en sus formando esfera eficiencia (los que expresan bajo la E-cadherina pueden formar culturas mammosphere menos estables y más corto plazo 18). Esta etapa de optimización debe garantizar la mayoría de los resultados de formación de ámbito primario y secundario del crecimiento clonal de células individuales. Plating una célula por pocillo es la única manera de garantizar totalmente la formación mammosphere clonal, y puede ser recomendado para la cuantificación de las tasas de auto-renovación / diferenciación de muestras recién derivados 13. Sin embargo, este enfoque también sufre de factores de complicación: un mammosphere formacióneficiencia de 1% producirá sólo un único mammosphere por placa de 96 pocillos, y la eficiencia puede ser subestimado con menos mammospheres se forman en ausencia de factor de crecimiento paracrino de señalización entre las células en suspensión. Por último, la frecuencia de las esferas secundarias después de pases puede estimar los niveles de auto-renovación, y una mayor eficiencia de secundaria de formación esfera primaria debe esperar si realmente la selección de células con propiedades de células madre del cáncer. Reagregación es un problema particular cuando se deriva esferas secundarias y de tipo de células adecuadas densidades celulares muy bajos deben ser optimizados hacia.
El tiempo necesario para mammospheres crezca a> 40 micras también variará, y mammospheres de muestras clínicas puede necesitar ser contado entre 5-12 días, dependiendo de la velocidad de crecimiento de la esfera. La agregación y fusión de las esferas se produce inevitablemente debido a la locomoción inherente de las células alrededor de los medios de comunicación, pero el proceso parece ser sustancialmente mejorada por el experimenters mover las placas durante la fase de crecimiento 19, por lo tanto, algo que deben evitarse.
Mientras que las grandes esferas se cree habitualmente que venir de las células madre con mayor capacidad replicativa a largo plazo este supuesto deben ser tratados con precaución. Esferas más grandes pueden reflejan la capacidad de proliferación de los progenitores, la capacidad de respuesta a factores de crecimiento, o ser un producto de la agregación o fusión. Tanto las células madre y sus células hijas de amplificación de tránsito son capaces de dar lugar a mammospheres 20, aunque la frecuencia combinado de ambos tipos de células todavía puede reflejar la tumorigenicidad del tejido de origen.
El ensayo mammosphere está limitada por un fracaso para capturar la complejidad de la formación de células madre de cáncer y comportamiento en su nicho in vivo. Para evaluar realmente el largo plazo in vitro e in vivo de auto-renovación y diferenciación de las células madre del cáncer de mama de forma prospectiva aislados, mammoensayos esfera deben, por tanto, idealmente realizarse en conjunto con trazado linaje y experimentos de xenotrasplante. Si bien trazado linaje se basa en marcadores que reflejan con precisión el subconjunto de células madre del cáncer, se benefician enormemente de retener las condiciones in vivo que contribuyen a la formación dinámica de las células madre del cáncer de hueso fide ''. La evaluación de la formación de tumores en experimentos de xenotrasplante en ratones inmunodeprimidos también proporcionará muchos componentes de nicho que faltan de ensayos mammosphere, mientras que todavía carecen de componentes inmunológicos y estromales humanos 21. Aunque técnicamente más exigentes, estas técnicas se deben intentar para una visión más completa e informativa de cáncer de mama propiedades de células madre y tumorigenicidad.
El ensayo mammosphere proporciona una herramienta informativa y conveniente, siempre y cuando se lleva a cabo con cuidado y que las limitaciones anteriores consideró: de hecho, como el conocimiento de la condi in vivolas experimentadas por las células madre del cáncer avances, ensayos mammosphere pueden incorporar una gama creciente de factores moleculares y ambientales. Utilizando el enfoque descrito anteriormente, las tasas de formación de ámbito corresponden a las tasas de tumores de iniciación en xenoinjertos 2,15,16, y auto-renovación de las esferas hace aumento de los cánceres de mama más agresivos 22 y siguientes intervenciones de células-madre aumentar tales como la quimioterapia 23. Mientras tanto los propios esferas pueden proporcionar un recurso valioso con el que estudiar las diferencias de expresión y nuevos factores implicados en la arquitectura de la expresión génica de células madre.
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Acknowledgments
Este trabajo es apoyado por el BRC Imperial, el Instituto Nacional de Investigación en Salud y Acción Contra el Cáncer con mención especial a Hilary Artesanía y Sir Douglas Myers.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Lonza | CC-3151 | |
| 2 mM L-glutamine | Sigma Aldrich | G8540 | |
| 100 U/ml Penicillin & Streptomycin | Sigma Aldrich | P4083 | |
| 20 ng/ml Recombinant human epidermal growth factor (EGF) | Sigma Aldrich | E9644 | |
| 20 ng/ml Recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF) | R&D systems | 233-FB-025 | |
| 1x B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Scientific | 12399902 | |
| 0.5% trypsin/0.2% EDTA | Sigma Aldrich | 59418C | |
| Fetal calf serum | First Link UK | 02-00-850 | |
| Trypan blue | Sigma Aldrich | 93595 | |
| Low attachment 6-well plates | Corning | CLS3814 | |
| Collagenase type 1A | Sigma Aldrich | C9891 | |
| Hyaluronidase | Sigma Aldrich | H3506 | |
| Sterile razor blades | Fisher Scientific | 12443170 | |
| Sterile scalpel | Fisher Scientific | 11758353 | |
| Sterile micro-dissecting scissors | Sigma Aldrich | S3146 |
References
- Iliopoulos, D., Hirsch, H. a, Struhl, K. An epigenetic switch involving NF-kappaB, Lin28, Let-7 MicroRNA, and IL6. Cell. 139 (4), 693-706 (2009).
- Iliopoulos, D., Hirsch, H. a, Wang, G., Struhl, K. Inducible formation of breast cancer stem cells and their dynamic equilibrium with non-stem cancer cells via IL6 secretion. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (4), 1397-1402 (2011).
- Visvader, J. E., Lindeman, G. J. Cancer stem cells: current status and evolving complexities. Cell stem cell. 10 (6), 717-728 (2012).
- Rosen, J. M., Jordan, C. T. The increasing complexity of the cancer stem cell paradigm. Science. 324 (5935), 1670-1673 (2009).
- Rokavec, M., Wu, W., Luo, J. -L. IL6-mediated suppression of miR-200c directs constitutive activation of inflammatory signaling circuit driving transformation and tumorigenesis. Mol Cell. 45 (6), 777-789 (2012).
- Chen, J., Li, Y., et al. A restricted cell population propagates glioblastoma growth after chemotherapy. Nature. 488 (7412), 522-526 (2012).
- Driessens, G., Beck, B., Caauwe, A., Simons, B. D., Blanpain, C. Defining the mode of tumour growth by clonal analysis. Nature. 488 (7412), 527-530 (2012).
- Schepers, A. G., Snippert, H. J., et al. Lineage tracing reveals Lgr5+ stem cell activity in mouse intestinal adenomas. Science. 337 (6095), 730-735 (2012).
- Sheridan, C., Kishimoto, H., et al. CD44+/CD24- breast cancer cells exhibit enhanced invasive properties: an early step necessary for metastasis. Breast cancer research: BCR. 8 (5), R59 (2006).
- Ginestier, C., Hur, M. H., et al. ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome. Cell stem cell. 1 (5), 555-567 (2007).
- Liu, S., Cong, Y., et al. Breast Cancer Stem Cells Transition between Epithelial and Mesenchymal States Reflective of their Normal Counterparts. Stem cell reports. 2 (1), 78-91 (2014).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1553558 1707-1710 (1992).
- Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell stem cell. 8 (5), 486-498 (2011).
- Dontu, G., Abdallah, W. M., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem / progenitor cells. Genes Dev. , 1253-1270 (2003).
- Ponti, D., Costa, A., et al. Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties. Cancer Res. 65 (13), 5506-5011 (2005).
- Grimshaw, M. J., Cooper, L., et al. Mammosphere culture of metastatic breast cancer cells enriches for tumorigenic breast cancer cells. Breast Cancer Res. 10 (3), R52 (2008).
- Pham, P. V., Phan, N. L. C., et al. Differentiation of breast cancer stem cells by knockdown of CD44: promising differentiation therapy. J Transl Med. 9 (1), 209 (2011).
- Manuel Iglesias, J., Beloqui, I., et al. Mammosphere formation in breast carcinoma cell lines depends upon expression of E-cadherin. PloS one. 8 (10), e77281 (2013).
- Coles-Takabe, B. L. K., Brain, I., et al. Don’t look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies. Stem Cells. 26 (11), 2938-2944 (2008).
- Stingl, J. Detection and analysis of mammary gland stem cells. J Pathol. 217 (2), 229-241 (2009).
- Kreso, A., Dick, J. E. Evolution of the cancer stem cell model. Cell stem cell. 14 (3), 275-291 (2014).
- Al-Hajj, M., Clarke, M. F. Self-renewal and solid tumor stem cells. Oncogene. 23 (43), 7274-7282 (2004).
- Yu, F., Yao, H., et al. let-7 regulates self renewal and tumorigenicity of breast cancer cells. Cell. 131 (6), 1109-1123 (2007).
