Abstract
Similar aos tecidos saudáveis, muitas sangue e tumores sólidos são pensados agora para ser organizados hierarquicamente, com um subconjunto de células-tronco cancerosas, como que se auto-renovar, dando origem a descendência mais diferenciada. Compreensão e segmentação destas células-tronco cancerosas no câncer de mama, que pode possuir reforçada quimio e radio-resistência em comparação com o volume do tumor não-haste, tornou-se uma importante área de pesquisa. Os marcadores, incluindo CD44, CD24, e a actividade de ALDH pode ser avaliada utilizando células activadas por fluorescência (FACS) para prospectivamente isolar células que exibem tumorigenicidade aumentada quando implantadas em ratinhos imunocomprometidos: o ensaio mammosphere também tem sido amplamente usada para a sua capacidade para identificar retrospectivamente sphere- formação de células que se desenvolvem a partir de clones de células-tronco como single. Aqui destacamos abordagens para a cultura apropriada de mammospheres de linhas celulares ou amostras primárias do paciente, sua passaging e cálculos para estimar esfera feficiência orming (SFE). Primeiro vamos discutir as principais considerações e armadilhas no planejamento e interpretação de experimentos mammosphere apropriado.
Introduction
A existência de linhagens de células tumorais chefiadas por células-tronco cancerosas-tronco como contribuiu largamente para a nossa compreensão da heterogeneidade tumor. Enquanto alguns diversidade fenotípica em tumores que surgem do crescimento clonal de clones geneticamente distintas, um componente substancial parece resultar de diferenças epigenéticas: as células cancerosas podem fazer a transição (por vezes de forma reversível) entre a haste, progenitor, e os estados diferenciados através da ativação ou repressão do gene específico programas de expressão 1-3. Isto pode reflectir factores intrínsecos ou extrínsecos de células, reflectindo a expressão do gene programa actualmente a ser expresso em uma célula com a sua sinalização a autócrino resultante em conjunto com sinalização parácrina da vizinha cancro, estromais ou células imunitárias entregar factores moduladores, e microenviromental condições tais como o grau de hipóxia 2,4,5.
Embora as abordagens rastreamento de linhagem inovadorasestão avançando a nossa capacidade de estudar as células-tronco do câncer putativos em sua in vivo nicho 6-8, ensaios de formação de esfera continuará a ser uma abordagem popular e conveniente para estimar o potencial de células de câncer de mama "para se comportar como células-tronco, pelo menos nas condições de ensaio utilizados. É frequentemente utilizado juntamente com os métodos retrospectivos para cancro de células estaminais de purificação, pela sua expressão de marcadores de membrana CD44 e CD24 9, e os níveis de enzima ALDH (aldeído desidrogenase) de actividade 10, marcadores que têm sido propostos para corresponder a mais mesenchymal- e epitelial -como células-tronco do câncer, respectivamente 11. A abordagem formação esfera foi desenvolvido pela primeira vez como o ensaio de neuroesferas, permitindo o crescimento de células estaminais putativas a partir de clones individuais em não-aderentes, condições livres de soro, com a adição de factor de crescimento epitelial (EGF) 12, sendo posteriormente aplicado utilmente ao normal e canceroso tecidos mamários.
ósseas repouso fide, pensado para descansar em fase G0, não vai experimentar a combinação precisa de fatores que favorecem a ativação in vivo. O ensaio mammosphere vez permite o crescimento de células ou pronta para divisão mitótica ou já divisórias 13. Estes progenitores, embora não uma célula verdadeiramente quiescente, pode ser a célula que prolifera fase com os agentes mitogénicos de EGF e factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF) utilizados no ensaio. No entanto, eles contêm uma variedade de haste ativado sinalização associado a células vias 14. Além disso, a taxa da sua formação está relacionada com a tumorigenicidade de tecido que foram retiradas, quando medido pela sua potência para ensaios de diluição limitadas em xenoenxertos de ratinho 2,15,16 </ Sup>.
Aqui nós fornecemos protocolos detalhados para isolar células individuais e que geram mammospheres primárias de ambas as linhas de células de câncer de mama humano e amostras clínicas de tumores de mama. Nós também descrevem como executar passagens em série de mammospheres primários para avaliar a auto-renovação, e como calcular esfera formando eficiência que permite a comparação entre diferentes densidades de semeadura (ver esquema na figura 1).
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Protocol
Os procedimentos a seguir foram eticamente aprovado pelo Imperial College, de Londres.
1. Geração de primárias Mammospheres de linhas celulares de cancro da mama humano
NOTA: Execute as seguintes etapas sob uma capa de cultura estéril.
- Prepare Mammosphere meios contendo DMEM / F12 suplementado com 2 mM de L-glutamina, 100 U / ml de penicilina, 100 U / ml de estreptomicina. Prepare media completo imediatamente antes da utilização, adicionando 20 fator ng / ml recombinante de crescimento epidérmico humano (EGF; Sigma), 10 ng / ml fator recombinante humano básico de crescimento de fibroblastos (bFGF; Sistemas I & D) e suplemento 1x B27.
- Aspirar meios de balão contendo aderentes MCF-7 ou MDA-MB-231 (ou uma linha celular de cancro da mama de sua escolha; 70-80% de confluência), lavar duas vezes em 1x PBS, e trypsinize células.
- Centrifugar células a 200 xg à temperatura ambiente durante 5 min. Células sobrenadante e ressuspender Decantar em 1-5 ml de mídia mammosphere. Pipetacima e para baixo e, se necessário, use um 40 um filtro cap filtro de células para obter a suspensão de uma única célula. Usar um hemocitómetro para assegurar uma suspensão de célula única formou (se não, usar uma agulha G 25, a seringa da suspensão de células até 3 vezes).
- Se necessário isolar CD44 + CD24- subconjunto celular através de FACS utilizando anticorpos anti-CD24-ficoeritrina (PE) e isotiocianato (FITC) anticorpos monoclonais anti-9-CD44 fluoresceína. Alternativamente, isolar tais população que utiliza uma célula magnética ativado triagem do sistema (MACS) com anti-CD44 e microbeads combinados-anti-CD24 biotina, conforme as instruções do fabricante. Realizar seleção positiva usando LS colunas e seleção negativa usando colunas LD e confirmar os fenótipos de todas as células isoladas por citometria de fluxo 17.
- Calcula-se o número de células viáveis por ml, utilizando azul de tripano.
NOTA: A viabilidade das células é calculada como o número de células viáveis, dividido pelo número total de células dentro das grades na hemocytometer. As células que ocupam azul tripan são considerados inviáveis. O procedimento seguinte é utilizado para determinar com precisão a percentagem de células viáveis.- Prepara-se uma solução 0,4% de azul de tripano em PBS. Adicionar 0,1 ml de solução de estoque de azul de tripano a 1 ml de células. Coloque um hemocitômetro e examinar imediatamente sob um microscópio com pequeno aumento. Contar o número de células totais e o número de células coradas de azul.
As células viáveis = [1,00 - (número de células azuis ÷ Número de células totais)] x 100. - Para calcular o número de células viáveis por ml de cultura, utilize a fórmula abaixo. Lembre-se de corrigir o fator de diluição.
Número de células viáveis × 10 × 1,1 = 4 células / ml de cultura
- Prepara-se uma solução 0,4% de azul de tripano em PBS. Adicionar 0,1 ml de solução de estoque de azul de tripano a 1 ml de células. Coloque um hemocitômetro e examinar imediatamente sob um microscópio com pequeno aumento. Contar o número de células totais e o número de células coradas de azul.
- Ressuspender uma quantidade pré-determinada de células em 2 ml de meio mammosphere completos em cada poço de uma placa de 6 poços aderente ultra-baixo. A densidade de sementeira é normalmente 500-4,000 células / cm2 de células por poço. Utilização lo Opcionalmentefixação w placas de 24 poços enquanto sementeira de células com a mesma densidade em 0,5 ml de meio.
NOTA: Recomendamos a otimização da densidade de semeadura e tempo de cultivo para cada linhas de células de interesse. - Incubar baixa de fixação 6-se placas de ultra a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 5-10 dias (dependendo da linha de células e o tamanho do mammospheres) sem perturbar as placas, particularmente durante a fase de crescimento dos primeiros 5 dias .
2. Geração de primárias Mammospheres de cancro da mama humano amostras clínicas
NOTA: tecido de cancro da mama humano pode ser obtido a partir de doentes submetidos a cirurgia para a remoção de tumores da mama. Tecido da loja em gelo durante até 24 horas em tubos de 50 ml estéreis em meio de cultura contendo 100 U / ml de penicilina e 100 U / ml de estreptomicina. Execute as seguintes etapas em uma capa de cultura estéril.
- Transfira a amostra num tecido 100 milímetros placa de Petri com um pequeno volume de meio. REMOVe do tecido adiposo com tesoura estéril, scapel e pinças.
- Adicionar 2-3 ml de DMEM / F12 e pique a amostra em 1 milímetro 3 peças com um scapel estéril ou lâmina de barbear até que não haja grandes pedaços permanecem.
- Ressuspender as peças de tecido em pré-aquecida de 10 ml de DMEM contendo enzimas proteolíticas (3.000 U / ml de colagenase e 1.000 U / ml de hialuronidase) e incubar a 37 ° C num agitador rotativo até que todos os fragmentos de tecido são digeridos. Normalmente, a digestão completa leva 1-3 horas. Ajuste o tempo de digestão de acordo com caracteres patológicos de tumores. (Por exemplo adenocarcinoma de mama é geralmente mais difícil de digerir em comparação com carcinoma mucinoso que é mais frágil e necessita de menor tempo de digestão). Avaliar o grau de digestão cada hora ½ observando 20 suspensão ul sob hemocitômetro.
- Permitir que os fragmentos a sedimentar durante 5 min, em seguida, transferir o sobrenadante num tubo de polipropileno cónico de 15 ml e centrifugar a 200 xg durante 10 min a ma quartoratura. Decantar cuidadosamente as células sobrenadante e ressuspender em 1-5 ml de mídia mammosphere.
- Siga os passos descritos acima para 1,1-1,4 linhas celulares para obter e chapa suspensões de células individuais. Passe células através da seringa 25 G um máximo de 2 vezes, se necessário limitar células prejudiciais.
3. Mammosphere Formando Eficiência (%) Cálculo
- Após o período de cultura, contar os mammospheres (maior do que 40 um) de diâmetro sob um microscópio com uma ampliação de 40X. Imagem digital 5 campos aleatórios utilizando uma câmera digital em um microscópio de luz e determinar o tamanho mammospheres usando o software de aquisição. Usar qualquer imagem Software Analysis.
- Calcule Mammosphere Eficiência Formando (MFE%) utilizando a seguinte equação:
MFE (%) = (# de mammospheres por poço) / (# de células semeadas por poço) x 100
4. Passaging Serial de Mammospheres de Avaliação da auto-renovação
- Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 500 ul de pré-aquecido 0,5% de tripsina / EDTA a 0,2%. Incubar por 2-3 min.
- Adicionar 500 ul de FCS para neutralizar a tripsina. Centrifugar a 500 xg durante 5 min. Elimine o sobrenadante e ressuspender sedimento em 100 mL de mídia mammospheres, pipetagem cima e para baixo para desagregar esferas.
- Contar as células com um hemocitómetro e determinar se as células estão em suspensão de célula única. Se não passar através de uma seringa 25 G até 3 vezes para se obter células isoladas. Semente as células em um novo ultra-baixo apego 6 bem-placa com a mesma densidade utilizado na geração primária.
- Depois de 5-10 dias, conte esferas> 40 mm e calcular a eficiência de formação de esfera usando a fórmula relatada antes.
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Representative Results
Diferentes amostras ou os sujeitos a diferentes tratamentos podem variar no número de mammospheres> 40 mm que se formam após a normalização para células iniciais semeadas. Calcular mammosphere formando eficiência (MFE) para cada tratamento cultivadas em triplicado. Isto permite que as experiências com diferentes densidades de semeadura para ser comparadas. Os dados são melhor apresentado em um gráfico de barras, de preferência, com os controlos positivos e negativos, e mostrar o desvio padrão entre as cavidades em triplicado. Consistentemente transferir células aderentes em placas não aderentes em entre 60-80% de confluência. Contagem de células cuidadosa é essencial para quantificar com precisão os efeitos dos tratamentos. Estimar o grau de variabilidade que este passo fundamental está contribuindo para os resultados, preparando várias suspensões separadamente do mesmo tratamento bem. Se a concentração de células medida difere significativamente do mesmo bem, considere a refinar sua abordagem de contagem (Figura 2).
Figura 1: O tratamento de cânceres de mama primários e amostras de linha de celular para obter culturas mammosphere amostras são enzimaticamente digerido, validado como células individuais, e colocadas em placas não aderentes em meio mammosphere sem soro com fatores de crescimento.. As placas não devem ser manipulados durante a fase de crescimento, para evitar fusão esfera. A imagem à direita mostra representativos MCF-7 esferas fotografadas após 5 dias. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Os resultados representativos de mammospheres formados a partir de um estrogénio epitelial positivo (MCF-7), e uma tripla negati mesenquimaisve (MDA-MB-231) A linha de células. fusão celular mínima / agregação foi atingido por plaqueamento baixa densidade, aqui a 500 células / cm2 para células MCF-7, e 1000 células / cm2 para células MDA-MB-231.
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Discussion
Avaliação positiva dos mammospheres primárias e secundárias depende das células sendo banhado pelo suficientemente baixas densidades que mammospheres formulário a partir de clones de solteiro, com esfera de agregação mínima. No entanto em densidades que são muito baixos, muito poucos mammospheres podem formar para distinguir os efeitos de tratamentos estatisticamente. Densidade de semeadura deve ser otimizado para cada linha celular utilizada, uma vez que podem variar consideravelmente em suas eficiências esfera formando (aqueles que expressam baixo E-caderina pode formar menos estáveis e mais curtos culturas mammosphere prazo 18). Este estágio de otimização devem garantir a maioria dos resultados de formação esfera primária e secundária do crescimento clonal de células individuais. Chapeamento de uma célula por bem é a única forma de assegurar inteiramente formação mammosphere clonal, e pode ser recomendada para quantificar as taxas de auto-renovação / diferenciação de amostras recém derivados 13. No entanto, esta abordagem também sofre de fatores complicadores: a mammosphere formandoa eficiência de 1% irá produzir apenas um único mammosphere por placa de 96 poços, e a eficiência pode ser subestimada com menos mammospheres sendo formada na ausência de factor de crescimento parácrino sinalização entre as células em suspensão. Por fim, a frequência de esferas secundárias após passaging pode estimar níveis de auto-renovação, e maior eficiência do secundário do que a formação esfera primária deve ser esperado se verdadeiramente selecionando para as células com propriedades de células-tronco do câncer. Reagregação é um problema particular quando decorrente esferas secundárias e do tipo de célula densidades celulares muito baixos apropriadas deve ser otimizada em direção.
O tempo necessário para mammospheres a crescer a> 40 pm também irá variar, e mammospheres partir de amostras clínicas podem precisar de ser contados entre 5-12 dias, dependendo da velocidade de crescimento esfera. A agregação e fusão de esferas inevitavelmente ocorre devido à locomoção inerente de células em torno da mídia, mas o processo parece ser substancialmente reforçada por experimenters deslocam as placas durante a fase de crescimento de 19, algo que, por conseguinte, deve ser evitada.
Enquanto as grandes esferas são rotineiramente pensado para vir a partir de células-tronco com capacidade de replicação maior a longo prazo esta hipótese deve ser tratado com cautela. As esferas maiores podem reflectir a capacidade proliferativa de células progenitoras, a capacidade de resposta a factores de crescimento, ou ser um produto de fusão ou de agregação. Ambas as células-tronco e suas células filhas amplificadoras de trânsito são capazes de dar origem a mammospheres 20, embora a frequência combinada de ambos os tipos de células ainda podem refletir a tumorigenicity do tecido de origem.
O ensaio mammosphere é limitado por uma falha para capturar a complexidade da formação de células de cancro da haste e no seu comportamento in vivo nicho. Para avaliar verdadeiramente a longo prazo in vitro e in vivo de auto-renovação e diferenciação de células-tronco isoladas prospectivamente câncer de mama, mammoesfera ensaios devem, portanto, idealmente, ser realizada em conjunto com a linhagem e rastreio experimentos xenotransplante. Enquanto o rastreamento linhagem conta com marcadores que refletem com precisão o subconjunto de células-tronco do câncer, eles se beneficiar muito de reter as condições in vivo que contribuem para a dinâmica de formação de células-tronco do câncer 'osso fé'. Avaliando a formação de tumores em experimentos de xenotransplante em ratinhos imunocomprometidos também irá fornecer muitos componentes de nicho faltando ensaios mammosphere, quando ainda falta imunes e estromais componentes humanos 21. Embora tecnicamente mais exigente, deve ser tentada estas técnicas para uma visão mais completa e informativa de câncer de mama propriedades de células-tronco e tumorigenicity.
O ensaio mammosphere faz prever um instrumento informativo e conveniente, desde que seja realizada com cuidado e as limitações acima considerado: na verdade, como o nosso conhecimento do condi in vivoções vivenciadas por células-tronco cancerosas avanços, ensaios mammosphere pode incorporar uma gama crescente de fatores moleculares e ambientais. Usando a abordagem descrita acima, as taxas de esfera-formação correspondem a taxas tumor-iniciação em xenografts 2,15,16, e auto-renovação das esferas faz aumento de cancros da mama mais agressivos 22 e seguintes crescente de células-tronco de intervenções como a quimioterapia 23. Enquanto isso, as próprias esferas pode proporcionar um recurso valioso para estudar com que as diferenças de expressão e de novos factores implicados na expressão de genes em células estaminais arquitectura.
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Acknowledgments
Este trabalho é apoiado pela BRC imperial, o Instituto Nacional de Pesquisa em Saúde e Acção contra o Cancro, com menção especial para Hilary Craft e Sir Douglas Myers.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Lonza | CC-3151 | |
| 2 mM L-glutamine | Sigma Aldrich | G8540 | |
| 100 U/ml Penicillin & Streptomycin | Sigma Aldrich | P4083 | |
| 20 ng/ml Recombinant human epidermal growth factor (EGF) | Sigma Aldrich | E9644 | |
| 20 ng/ml Recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF) | R&D systems | 233-FB-025 | |
| 1x B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Scientific | 12399902 | |
| 0.5% trypsin/0.2% EDTA | Sigma Aldrich | 59418C | |
| Fetal calf serum | First Link UK | 02-00-850 | |
| Trypan blue | Sigma Aldrich | 93595 | |
| Low attachment 6-well plates | Corning | CLS3814 | |
| Collagenase type 1A | Sigma Aldrich | C9891 | |
| Hyaluronidase | Sigma Aldrich | H3506 | |
| Sterile razor blades | Fisher Scientific | 12443170 | |
| Sterile scalpel | Fisher Scientific | 11758353 | |
| Sterile micro-dissecting scissors | Sigma Aldrich | S3146 |
References
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