Abstract
Как здоровых тканей, многие крови и твердых злокачественных опухолей в настоящее время считается, организованы иерархически, с подмножеством стволовых-как раковые клетки, которые самообновлению, давая начало более дифференцированной потомства. Понимание и направленности этих раковых стволовых клеток при раке молочной железы, которые могут обладать повышенной химио- и лучевая устойчивость по сравнению с не-опухолевых стволовых оптом, стала важным направлением исследований. Маркеры в том числе CD44, CD24, и ALDH деятельности может быть оценена с помощью флуоресцентной активированный сортировки клеток (FACS) для перспективно выделения клеток, которые отображают усиление туморогенности при имплантации в ослабленным иммунитетом мышей: mammosphere анализ также стал широко используется для его способности ретроспективно определить Шар формирование клеток, которые развиваются из клеток-как клоны одного стебля. Здесь мы опишем подходы к соответствующей культивирования mammospheres из клеточных линий или первичных проб пациентов, их пассирования, и расчеты для оценки сферы Forming эффективность (SFE). Сначала мы обсудим основные моменты и подводные камни в соответствующем планировании и интерпретации mammosphere экспериментов.
Introduction
Наличие линий опухолевых клеток во главе с стволовых, как раковые стволовые клетки значительно добавил к нашему пониманию опухоли неоднородности. Хотя некоторые фенотипического разнообразия в опухолях действительно возникает из клонального вырост генетически различных клонов, появляется существенный компонент результатом эпигенетических различий: раковые клетки могут перейти (иногда обратимо) между штоком, прародителя и дифференцированных состояний посредством активации или репрессии конкретного гена Программы выражение 1 - 3. Это может отражать клеток внутреннего или внешнего фактора, отражает программу экспрессии генов в настоящее время, выраженное в ячейке с его результирующей аутокринного сигнализации в сочетании с паракринной сигналов от соседних рак, стромальные клетки иммунной системы или доставки модулирующие факторы и microenviromental условия, такие как степень гипоксия 2,4,5.
Хотя инновационных клона отслеживания подходовпродвигаются наши способности к обучению предполагаемых раковых стволовых клеток в их в естественных нише 6 - 8, сфера формирования анализы остаются популярными и удобный подход для оценки потенциала клеток рака молочной железы ", чтобы вести себя как стволовые клетки, по крайней мере, в условиях анализа, используемых. Он часто используется вместе с ретроспективных методов раковых стволовых очистки клеток, их выражения мембранных маркеров CD44 и CD24 9 и уровней активности фермента ALDH (альдегиддегидрогеназой) 10, маркеров, которые были предложены, чтобы соответствовать более mesenchymal- и эпителиальных -как раковые стволовые клетки соответственно 11. Подход формирования сфера была впервые разработана в качестве нейросфера анализа, что позволяет рост предполагаемых стволовых клеток из отдельных клонов в неприлипающими, бессывороточной условиях с добавлением эпителиального фактора роста (EGF) 12, а затем быть с пользой применены к нормальной и раковой тканях молочной железы.
кости ФИДЕ стволовые клетки, как полагают, отдохнуть в G0 фазе, не будет испытывать точное сочетание факторов, которые будут благоприятствуют активации в естественных условиях. Mammosphere анализ, а не способствующая росту клеток либо на пороге митотического деления или уже разделительных 13. Эти предшественники, хотя и не действительно покоя клетки, может быть этапом клеток, которые пролиферируют с митогены EGF и основной фактор роста фибробластов (bFGF), используемых в анализе. Тем не менее, они содержат ряд клеточно-ассоциированного сигнализации активируется стволовых дорожками 14. Кроме того, скорость их образования относится к туморогенности ткани они были взяты из измеренного, когда их активности в анализах ограниченных разведений в ксенотрансплантатов мыши 2,15,16 </ SUP>.
Здесь мы предлагаем подробные протоколы, чтобы изолировать отдельные клетки и формировать первичные mammospheres из обеих клеточных линий рака молочной железы человека и в клинических образцах опухолей молочной железы. Мы также описывается, как выполнять последовательные проходы первичных mammospheres оценить самообновление, и как рассчитать сфера формирования эффективность, что позволяет проводить сравнения между разными плотностями высева (см схему на рисунке 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Приведенные ниже процедуры были этически утвержден Имперского колледжа в Лондоне.
1. Генерация первичных Mammospheres из груди человека раковых клеток линии
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните следующие действия в стерильной капот культуры.
- Подготовка Mammosphere Медиа, содержащий DMEM / F12 с добавлением 2 мМ L-глутамина, 100 ед / мл пенициллина, 100 ед / мл стрептомицина. Подготовка полной среде непосредственно перед использованием путем добавления 20 нг / мл рекомбинантного фактора роста эпидермиса человека (EGF; Sigma), 10 нг / мл рекомбинантного основной фактор роста фибробластов человека (bFGF; R & D Systems) и 1x B27 добавки.
- Вытяжку средств массовой информации из колбы, содержащей прилипшие MCF-7 или MDA-MB-231 клетки (линию клеток рака молочной железы на ваше усмотрение 70-80% слияния), промыть дважды в 1x PBS, и Trypsinize клетки.
- Центрифуга клетки при 200 мкг при комнатной температуре в течение 5 мин. Декантируйте супернатант и ресуспендирования клеток в 1-5 мл mammosphere СМИ. Пипеткавверх и вниз, и, при необходимости использования клеточный фильтр крышки фильтра 40 мкм для получения одного суспензии клеток. Используйте гемоцитометра, чтобы обеспечить суспензию отдельных клеток сформировала (если нет, используйте 25 г иглу в шприц суспензию клеток до 3 раз).
- Если необходимо, CD44 + CD24- сотовой подмножество помощью FACS с использованием анти-CD24-фикоэритрин (РЕ) и анти-CD44-изотиоцианат флуоресцеина (FITC) моноклональными антителами 9. Кроме того, изолировать такого населения, используя магнитную активирована (MACS) системы с анти-CD44 и анти-CD24-биотин комбинированных микросфер в соответствии с инструкциями изготовителя сортировки клеток. Выполните положительный выбор, используя LS колонки, и негативный отбор с использованием колонки LD и подтвердите фенотипы всех изолированных клеток методом проточной цитометрии 17.
- Рассчитать количество жизнеспособных клеток на мл с использованием трипанового синего.
Примечание: Жизнеспособность клеток рассчитывали как количество жизнеспособных клеток, деленное на общее число клеток в сетях на hemocyTometer. Клетки, которые занимают трипанового синего считаются нежизнеспособными. Следующая процедура используется для точного определения доли жизнеспособных клеток.- Приготовьте 0,4% раствора трипанового синего в ФБР. Добавить 0,1 мл трипанового синего раствора в 1 мл клеток. Загрузка гемоцитометра и исследовать непосредственно под микроскопом при малом увеличении. Подсчитайте общее количество клеток и число синих окрашивания клеток.
Жизнеспособные клетки = [1,00 - (Количество синих клеток ÷ Количество всех клеток)] × 100. - Для расчета числа жизнеспособных клеток на мл культуры, использовать формулу, приведенную ниже. Помните, для коррекции коэффициента разбавления.
Количество жизнеспособных клеток × 10 4 × 1,1 = клеток / культуры мл
- Приготовьте 0,4% раствора трипанового синего в ФБР. Добавить 0,1 мл трипанового синего раствора в 1 мл клеток. Загрузка гемоцитометра и исследовать непосредственно под микроскопом при малом увеличении. Подсчитайте общее количество клеток и число синих окрашивания клеток.
- Ресуспендируют заранее определенного количества клеток в 2 мл полной mammosphere информации в каждую лунку 6-луночного сверхнизким клейкого пластины. Плотность посева, как правило, 500-4,000 клеток / см 2 ячейка на лунку. Дополнительно использование вотW крепления 24-луночные планшеты в то время как посев клеток при одинаковой плотности в 0,5 мл среды.
Примечание: Мы рекомендуем оптимизации плотности и времени культуры посева для каждого клеточных линий, представляющих интерес. - Инкубируйте ультра низкой крепления 6-луночные планшеты при 37 ° С и 5% СО 2 в течение 5-10 дней (в зависимости от клеточной линии и размера mammospheres), не нарушая пластины, в частности, во время фазы роста в течение первых 5 дней ,
2. Формирование первичных Mammospheres от рака молочной железы человека клинических образцов
Примечание: Человеческие ткани молочной железы могут быть получены от пациентов, перенесших операции по удалению опухолей молочной железы. Магазин ткани на льду в течение до 24 ч в 50 мл стерильные пробирки в культуральной среде, содержащей 100 U / мл пенициллина и 100 ед / мл стрептомицина. Выполните следующие действия в стерильной капот культуры.
- Передача образца в 100 мм чашки Петри ткани с небольшим объемом средств массовой информации. Убре жировой ткани с помощью стерильных ножниц, scapel и пинцет.
- Добавьте 2-3 мл DMEM / F12 и не стесняется образец в 1 мм 3 штук с стерильной scapel или лезвием бритвы, пока не большие куски остаются.
- Ресуспендируют части ткани в предварительно нагревают 10 мл DMEM, содержащей протеолитические ферменты (3000 ед / мл коллагеназы и 1 000 ед / мл гиалуронидазы) и инкубируют при 37 ° С на ротационном шейкере, пока все фрагменты ткани не перевариваются. Обычно полное переваривание уходит от 1-3 часов. Отрегулируйте время пищеварения в соответствии с патологическими символов опухолей. (Например аденокарциномы молочной железы, как правило, труднее переваривать сравнению с коллоидный рак, который является более хрупким и нуждается в более короткое время пищеварения). Оцените степень переваривания Каждые полчаса, наблюдая 20 мкл суспензии при гемоцитометре.
- Разрешить фрагменты для осаждения в течение 5 мин, а затем перенести супернатант в 15 мл коническую полипропиленовую пробирку и центрифугируют при 200 х г в течение 10 мин при комнатной ТЕАмойки. Осторожно перелейте надосадочную и ресуспендирования клеток в 1 - 5 мл mammosphere СМИ.
- Следуйте инструкциям в 1,1-1,4 описанные выше для клеточных линий для получения и диска суспензии отдельных клеток. Pass клетки через 25 г шприц максимум 2 раза, если необходимо ограничить повреждающие клетки.
3. Mammosphere Формирование эффективность (%) Расчет
- После периода культивирования, подсчета mammospheres (более 40 мкм) диаметр под микроскопом при 40-кратном увеличении. Цифровая изображение 5 случайных полей с помощью цифровой камеры на световом микроскопе и определить размер mammospheres с помощью программного обеспечения приобретения. Использовать любое изображение программное обеспечение для анализа.
- Рассчитать Mammosphere Формирование эффективность (MFE%), используя следующее уравнение:
МФБ (%) = (число mammospheres на лунку) / (число клеток, посеянных на лунку) х 100
4. Серийные пассажи Mammospheres по оценке самообновления
- Удалите супернатант и ресуспендируют осадок в 500 мкл подогретого 0,5% трипсина / 0,2% ЭДТА. Инкубируют в течение 2-3 мин.
- Добавить 500 мкл FCS, чтобы нейтрализовать трипсина. Центрифуга при 500 мкг в течение 5 мин. Удалите супернатант и ресуспендируют осадок в 100 мкл mammospheres СМИ, пипетки вверх и вниз, чтобы разбить сферы.
- Количество клеток с гемоцитометра и определить, если клетки в суспензии отдельных клеток. Если не пройти через 25 G шприц до 3 раз, чтобы получить отдельные клетки. Семенной клеток в новой ультра низкой крепления 6-луночный планшет при той же плотности, используемого в первичной генерации.
- Через 5-10 дней, рассчитывать шары> 40 мкм и вычислить сферы формирования эффективности по формуле сообщалось ранее.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Различные образцы или тех, кто подвергается различным лечения может варьироваться в количестве mammospheres> 40 мкм, которые образуют после нормализации для начальных клеток, посеянных. Рассчитать mammosphere формирования эффективности (МФБ) для каждого лечения, выращенных в трех экземплярах. Это позволяет эксперименты с различной плотностью посева в сравнении. Лучше всего показаны данные по гистограмме, в идеале с положительным и отрицательным контролем, и отображения стандартного отклонения поперек трех лунок. Последовательно передать прилипшие клетки в неприлипающих планшеты между 60-80% слияния. Подсчет клеток Тщательное важно, чтобы точно количественной оценки последствий лечения. Оцените степень изменчивости, что это ключевой шаг способствует ваших результатов путем подготовки нескольких суспензий отдельно от той же обработки скважин. Если концентрация клеток измеряли существенно отличается от той же скважине, рассмотреть переработки свой подсчета подход (рисунок 2).
Рисунок 1: обработка рака молочной железы первичных и образцов клеточных линий, чтобы получить mammosphere культур Образцы ферментативно расщепл, подтверждено в виде отдельных клеток, и высевали на неприлипающими пластин в бессывороточной среде с mammosphere факторов роста.. Плиты не должны быть обработаны в течение фазы роста, чтобы избежать сферу синтеза. Фото справа показывает типичные MCF-7 сфер сфотографировали после 5 дней. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2: Типичные результаты mammospheres, образованных из эпителиальных эстрогена положительного (MCF-7), и мезенхимальные тройной negatiве (MDA-MB-231) клеточной линии. Минимальная слияние клеток / агрегации была достигнута низкой плотности посева, здесь 500 клеток / см 2 в течение MCF-7 и 1000 клеток / см 2 в течение MDA-MB-231.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Успешное оценка первичных и вторичных mammospheres зависит от клетки посевом при достаточно низких плотностей, которые mammospheres форму от отдельных клонов, с минимальным агрегации сферы. Однако при плотностях, которые слишком малы, слишком мало mammospheres могут образовывать различать эффекты лечения статистически. Посев плотность должна быть оптимизирована для каждой линии клеток, используемой, поскольку они могут значительно различаться в их эффективности сферы образования (те, которые выражают низкий E-кадгерин могут образовывать менее стабильные и более короткий срок mammosphere культуры 18). Этот этап оптимизации должен обеспечить большинство первичных и вторичных результатов формирования сферу из клонального роста отдельных клеток. Покрытие одну ячейку на лунку единственный способ полностью обеспечить формирование клонов mammosphere, и может быть рекомендован для количественного определения цены самообновление / дифференциации недавно полученных образцов 13. Тем не менее, этот подход также страдает от осложняющих факторов: формирование mammosphereЭффективность 1% даст только один mammosphere за 96-луночного планшета, и эффективность может быть недооценен с меньшим количеством mammospheres формируется в отсутствие паракринного фактора роста сигнализации между взвешенных клеток. Наконец, частота вторичных сфер после пассирования можно оценить уровни самообновлению и более высокую эффективность, чем вторичного формирования первичной сферы следует ожидать, если действительно селекции клеток, обладающих свойствами стволовых клеток рака. Реагрегация является особой проблемой при выводе вторичные сферы и соответствующие плотности очень низких клеток клеточного типа должны быть оптимизированы в отношении.
Время, необходимое для mammospheres вырастет до> 40 мкм также будет меняться, и mammospheres из клинических образцов может потребоваться для подсчета между 5-12 дней в зависимости от скорости роста сферы. Объединение и слияние сфер неизбежно происходит из-за присущего локомоции клеток вокруг СМИ, но процесс, как представляется, существенно повысить экстаторов движущиеся пластины во время фазы роста 19, то, следовательно, следует избегать.
В то время как крупные шарики регулярно думал приехать из стволовых клеток с более высокой долгосрочной способность к репликации это предположение следует относиться с осторожностью. Большие сферы могут отражать способность к пролиферации клеток-предшественников, отзывчивость на факторы роста, или быть результатом агрегации или слияния. Оба стволовые клетки и их переходные делящиеся дочерние клетки способны давать начало mammospheres 20, хотя комбинированный частота обоих типах клеток все еще может отражать онкогенность исходного ткани.
Mammosphere анализ ограничивается из-за неспособности всей сложности формирования стволовых клеток рака и поведения в своей нише в естественных условиях. Чтобы по-настоящему оценить долгосрочные в пробирке и в естественных условиях самообновления и дифференцировки перспективно изолированных стволовых клеток рака молочной железы, MAMMOсфера анализы должны поэтому идеально выполняться в сочетании с клонов розыску и ксенотрансплантации экспериментов. В то время как линия трассировки зависит от маркеров, которые точно отражают раковых стволовых клеток подмножество, они извлечь большую пользу из сохранения естественных условиях условия, которые способствуют динамическому формированию костном ФИДЕ раковых стволовых клеток. Оценка формирование опухоли в ксенотрансплантатных экспериментов с ослабленным иммунитетом мышей также будет предоставлять множество компонентов ниши, отсутствующие в mammosphere анализов, в то время как до сих пор отсутствует иммунодефицита человека и стромальных компонентов 21. Хотя технически более требовательным, эти методы должны быть предприняты для более полной и информативной точки зрения рака молочной железы свойств и туморогенности стволовых клеток.
Mammosphere анализ делает информативная и удобный инструмент, если он осуществляется тщательно и ограничения, приведенные выше считается: действительно, как наши знания о в естественных условиях кондиционния, с которыми сталкиваются раковых стволовых клеток достижений, mammosphere анализы могут включать более широкий круг молекулярных и экологических факторов. Используя подход, описанный выше, темпы сфера-образование соответствуют ставкам опухоли посвящения в ксенотрансплантатах 2,15,16, и самообновление сфер делает увеличение более агрессивных видов рака 22 грудных и следующие клеточные возрастающей вмешательства стволовые такие как химиотерапия 23. В то же время сами шарики могут обеспечить ценный ресурс, с помощью которого изучить различия экспрессии и новые факторы, участвующие в архитектуре экспрессии генов стволовых клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Работа выполнена при поддержке Императорского BRC, Национальный институт исследований в области здравоохранения, а также действия по борьбе с раком с особым упоминанием Хилари ремесла и сэра Дугласа Майерс.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Lonza | CC-3151 | |
| 2 mM L-glutamine | Sigma Aldrich | G8540 | |
| 100 U/ml Penicillin & Streptomycin | Sigma Aldrich | P4083 | |
| 20 ng/ml Recombinant human epidermal growth factor (EGF) | Sigma Aldrich | E9644 | |
| 20 ng/ml Recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF) | R&D systems | 233-FB-025 | |
| 1x B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Scientific | 12399902 | |
| 0.5% trypsin/0.2% EDTA | Sigma Aldrich | 59418C | |
| Fetal calf serum | First Link UK | 02-00-850 | |
| Trypan blue | Sigma Aldrich | 93595 | |
| Low attachment 6-well plates | Corning | CLS3814 | |
| Collagenase type 1A | Sigma Aldrich | C9891 | |
| Hyaluronidase | Sigma Aldrich | H3506 | |
| Sterile razor blades | Fisher Scientific | 12443170 | |
| Sterile scalpel | Fisher Scientific | 11758353 | |
| Sterile micro-dissecting scissors | Sigma Aldrich | S3146 |
References
- Iliopoulos, D., Hirsch, H. a, Struhl, K. An epigenetic switch involving NF-kappaB, Lin28, Let-7 MicroRNA, and IL6. Cell. 139 (4), 693-706 (2009).
- Iliopoulos, D., Hirsch, H. a, Wang, G., Struhl, K. Inducible formation of breast cancer stem cells and their dynamic equilibrium with non-stem cancer cells via IL6 secretion. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (4), 1397-1402 (2011).
- Visvader, J. E., Lindeman, G. J. Cancer stem cells: current status and evolving complexities. Cell stem cell. 10 (6), 717-728 (2012).
- Rosen, J. M., Jordan, C. T. The increasing complexity of the cancer stem cell paradigm. Science. 324 (5935), 1670-1673 (2009).
- Rokavec, M., Wu, W., Luo, J. -L. IL6-mediated suppression of miR-200c directs constitutive activation of inflammatory signaling circuit driving transformation and tumorigenesis. Mol Cell. 45 (6), 777-789 (2012).
- Chen, J., Li, Y., et al. A restricted cell population propagates glioblastoma growth after chemotherapy. Nature. 488 (7412), 522-526 (2012).
- Driessens, G., Beck, B., Caauwe, A., Simons, B. D., Blanpain, C. Defining the mode of tumour growth by clonal analysis. Nature. 488 (7412), 527-530 (2012).
- Schepers, A. G., Snippert, H. J., et al. Lineage tracing reveals Lgr5+ stem cell activity in mouse intestinal adenomas. Science. 337 (6095), 730-735 (2012).
- Sheridan, C., Kishimoto, H., et al. CD44+/CD24- breast cancer cells exhibit enhanced invasive properties: an early step necessary for metastasis. Breast cancer research: BCR. 8 (5), R59 (2006).
- Ginestier, C., Hur, M. H., et al. ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome. Cell stem cell. 1 (5), 555-567 (2007).
- Liu, S., Cong, Y., et al. Breast Cancer Stem Cells Transition between Epithelial and Mesenchymal States Reflective of their Normal Counterparts. Stem cell reports. 2 (1), 78-91 (2014).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1553558 1707-1710 (1992).
- Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell stem cell. 8 (5), 486-498 (2011).
- Dontu, G., Abdallah, W. M., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem / progenitor cells. Genes Dev. , 1253-1270 (2003).
- Ponti, D., Costa, A., et al. Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties. Cancer Res. 65 (13), 5506-5011 (2005).
- Grimshaw, M. J., Cooper, L., et al. Mammosphere culture of metastatic breast cancer cells enriches for tumorigenic breast cancer cells. Breast Cancer Res. 10 (3), R52 (2008).
- Pham, P. V., Phan, N. L. C., et al. Differentiation of breast cancer stem cells by knockdown of CD44: promising differentiation therapy. J Transl Med. 9 (1), 209 (2011).
- Manuel Iglesias, J., Beloqui, I., et al. Mammosphere formation in breast carcinoma cell lines depends upon expression of E-cadherin. PloS one. 8 (10), e77281 (2013).
- Coles-Takabe, B. L. K., Brain, I., et al. Don’t look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies. Stem Cells. 26 (11), 2938-2944 (2008).
- Stingl, J. Detection and analysis of mammary gland stem cells. J Pathol. 217 (2), 229-241 (2009).
- Kreso, A., Dick, J. E. Evolution of the cancer stem cell model. Cell stem cell. 14 (3), 275-291 (2014).
- Al-Hajj, M., Clarke, M. F. Self-renewal and solid tumor stem cells. Oncogene. 23 (43), 7274-7282 (2004).
- Yu, F., Yao, H., et al. let-7 regulates self renewal and tumorigenicity of breast cancer cells. Cell. 131 (6), 1109-1123 (2007).
