Mammosphere Formation dosage du sein humain cancer des tissus et des lignées cellulaires

Abstract

Similaires aux tissus sains, beaucoup de sang et de tumeurs solides sont maintenant pensés pour être organisée hiérarchiquement, avec un sous-ensemble de cellules cancéreuses souches ressemblant que l'auto-renouveler tout en donnant naissance à une descendance plus différenciée. Comprendre et cibler ces cellules souches cancéreuses dans le cancer du sein, qui peuvent posséder amélioré chimio- et radio-résistance par rapport à la masse de la tumeur non-tige, est devenu un domaine de recherche important. Marqueurs y compris CD44, CD24, et l'activité de l'ALDH peut être évaluée en utilisant cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour isoler de façon prospective les cellules qui affichent la tumorigénicité accrue lorsqu'ils sont implantés dans des souris immunodéprimées: le dosage de mammosphere a également été largement utilisée pour sa capacité à identifier a posteriori SPHERE formant des cellules qui se développent à partir de souches unique clones de cellules comparables. Nous exposons ici approches pour la culture appropriée de mammospheres partir de lignées cellulaires ou d'échantillons primaires des patients, de leur passages, et des calculs pour estimer la sphère fl'efficacité ormer (SFE). D'abord, nous discutons des considérations et des pièges clés dans la planification et l'interprétation des expériences mammosphere appropriée.

Introduction

L'existence de lignées cellulaires tumorales dirigés par des cellules souches du cancer souches ressemblant a grandement ajouté à notre compréhension de l'hétérogénéité tumorale. Alors que certains diversité phénotypique dans les tumeurs ne se pose de l'excroissance clonale de clones génétiquement distinctes, une composante importante semble résulter de différences épigénétiques: les cellules cancéreuses peuvent transition (parfois réversible) entre la tige, l'ancêtre, et les Etats différenciées via l'activation ou la répression de gène spécifique les programmes d'expression ^1-3. Cela peut tenir compte de facteurs intrinsèques ou extrinsèques cellulaires, ce qui reflète le programme d'expression génique actuellement être exprimé dans une cellule avec son signalisation autocrine résultant en liaison avec signalisation paracrine d'un cancer, stromales ou les cellules immunitaires voisine délivrant facteurs modulateurs et les conditions microenviromental tels que le degré de hypoxie ^2,4,5.

Bien que la lignée traçage des approches novatricessont avancer notre capacité à étudier les cellules souches du cancer putatifs dans leur niche in vivo ^6-8, les dosages de la sphère de formation restent une approche populaire et pratique pour estimer le potentiel des cellules de cancer du sein de se comporter comme des cellules souches, au moins dans les conditions de dosage utilisées. Il est souvent utilisé aux côtés méthodes rétrospectives pour les cellules souches du cancer de purification, par leur expression de marqueurs membranaires CD44 et CD24 ⁹ et les niveaux de l'enzyme ALDH (aldéhyde déshydrogénase) d'activité ^10, les marqueurs qui ont été proposés pour correspondre à plus mesenchymal- et épithélial -comme cellules respectivement ¹¹ souches du cancer. L'approche de la formation de la sphère a d'abord été développé en tant que dosage de neurosphères, permettant la croissance de cellules souches putatives provenant de clones individuels dans non adhérentes, des conditions sans sérum avec l'ajout de l'épithélium du facteur de croissance (EGF) ^12, puis est utilement appliquée à normaux et cancéreux tissus mammaires.

Os repos cellules souches de bonne à long terme, la pensée de se reposer en phase G0, ne sera pas l'expérience de la combinaison précise de facteurs qui favoriseraient activation in vivo. Le dosage de la place mammosphere permet la croissance des cellules soit prête pour la division mitotique ou déjà en division ^13. Ces progéniteurs, mais pas véritablement une cellule de repos, peuvent être le stade de la cellule qui prolifère avec les mitogenes et EGF facteur de croissance basique des fibroblastes (bFGF) utilisés dans le dosage. Néanmoins, ils contiennent une gamme de la signalisation associée aux cellules souches activé cheminements de ^14. En outre, la vitesse de leur formation se rapporte à la tumorigénicité de tissu ont été prélevés, lorsqu'elle est mesurée par leur efficacité dans des essais de dilution limitée dans des xénogreffes de souris ^{2,15,16 <}/ Sup>.

Ici, nous fournissons des protocoles détaillés pour isoler des cellules individuelles et de générer mammospheres primaires des deux lignées cellulaires de cancer du sein humain et des échantillons cliniques de tumeurs du sein. Nous décrivons également comment effectuer des passages en série de mammospheres primaires pour évaluer l'auto-renouvellement, et comment calculer sphère formant efficacité qui permet la comparaison entre les différentes densités de semis (voir schéma de la figure 1).

Protocol

Les procédures ci-dessous ont été éthique approuvé par l'Imperial College, Londres.

1. Génération de mammospheres primaires du sein humain Cancer Cell Lines

REMARQUE: Effectuez les étapes suivantes sous une hotte de culture stérile.

1. Préparez mammosphere des milieux contenant du DMEM / F12 supplémenté avec 2 mM de L-glutamine, 100 U / ml de pénicilline, 100 U / ml de streptomycine. Préparer les médias complète immédiatement avant utilisation en ajoutant 20 facteur ng / ml recombinant de croissance épidermique humain (EGF; Sigma), 10 ng / ml de base facteur humain recombinant de croissance des fibroblastes (bFGF; R & D Systems) et le supplément 1x B27.
2. Aspirer le milieu de flacon contenant adhérentes MCF-7 ou MDA-MB-231 cellules (ou une ligne de votre choix de cellules de cancer du sein; 70-80% de confluence), laver deux fois dans PBS 1x et Trypsiniser cellules.
3. Centrifuger les cellules à 200 xg à température ambiante pendant 5 min. Cellules surnageant et remettre décantation dans 1-5 ml de milieu mammosphere. Pipettede haut en bas et si nécessaire utiliser un filtre de plafonnement des tamis cellulaire de 40 um pour obtenir une suspension à cellule unique. Utiliser un hémocytomètre pour assurer une suspension cellulaire unique est formée (dans la négative, utiliser une aiguille G 25 à la seringue la suspension de cellules jusqu'à 3 fois).
4. Si nécessaire isolat CD44 + CD24- sous-ensemble cellulaire via FACS en utilisant anti-CD24-phycoérythrine (PE) et l'isothiocyanate (FITC) des anticorps monoclonaux anti-CD44 ^{9-fluorescéine.} Alternativement, isoler telle population en utilisant un système (MACS) avec anti-CD44 et les microbilles combinées anti-CD24-biotine selon les instructions du fabricant magnétique des cellules activées de tri. Effectuer une sélection positive en utilisant LS colonnes, et la sélection négative en utilisant des colonnes de LD et de confirmer les phénotypes de toutes les cellules isolées par cytométrie de flux ^17.
5. Calculer le nombre de cellules viables par ml en utilisant du bleu trypan.
   REMARQUE: La viabilité des cellules est calculé comme le nombre de cellules viables, divisé par le nombre total de cellules dans les grilles sur la hemocyTometer. Les cellules qui prennent bleu trypan sont considérés comme non viable. La procédure suivante est utilisée pour déterminer avec précision la proportion de cellules viables.
   1. Préparer une solution à 0,4% de bleu trypan dans du PBS. Ajouter 0,1 ml de solution stock trypan bleu à 1 ml de cellules. Chargez un hémocytomètre et d'examiner immédiatement sous un microscope à faible grossissement. Compter le nombre de cellules totales et du nombre de cellules à coloration bleue.
      Les cellules viables = [1,00 - (Nombre de cellules bleues ÷ Nombre de cellules totales)] × 100.
   2. Pour calculer le nombre de cellules viables par ml de culture, utiliser la formule ci-dessous. Rappelez-vous pour corriger le facteur de dilution.
      Nombre de cellules viables × 10 × 1,1 = ⁴ cellules / ml de culture
6. Reprendre un montant pré-déterminé de cellules dans 2 ml de milieu mammosphere complets dans chaque puits d'une plaque adhérente à 6 puits ultra-faible. La densité de semis est normalement 500-4,000 cellules / cm ² cellule par puits. Éventuellement utiliser low fixation des plaques 24 puits pendant l'ensemencement des cellules à la même densité dans 0,5 ml de milieu.
   NOTE: Nous recommandons l'optimisation de la densité et l'heure de la culture ensemencement pour chaque lignées cellulaires d'intérêt.
7. Incuber à faible fixation des plaques 6 puits ultra à 37 ° C et 5% de CO ₂ pendant 5 à 10 jours (selon la lignée cellulaire et de la taille de mammospheres) sans perturber les plaques, en particulier pendant la phase des 5 premiers jours de croissance .

2. Génération de mammospheres primaires de cancer du sein humain échantillons cliniques

REMARQUE: tissu de cancer du sein humain peut être obtenu à partir de patients subissant une intervention chirurgicale pour l'élimination des tumeurs du sein. tissu de magasin sur de la glace pendant jusqu'à 24 heures dans 50 ml dans des tubes stériles dans des milieux de culture contenant 100 U / ml de pénicilline et 100 U / ml de streptomycine. Effectuez les étapes suivantes sous une hotte de culture stérile.

1. Transférer l'échantillon dans une boîte de 100 mm tissus Petri avec un petit volume de médias. Remove du tissu adipeux avec des ciseaux stérile, scalpel et des pinces.
2. Ajouter 2-3 ml de DMEM / F12 et émincer l'échantillon dans une mm ³ morceaux avec un scalpel stérile ou lame de rasoir jusqu'à ce qu'aucun gros morceaux restent.
3. Remettre en suspension les morceaux de tissu dans préchauffée 10 ml de DMEM contenant des enzymes protéolytiques (3000 U / ml de collagénase et 1000 U / ml hyaluronidase) et incuber à 37 ° C dans un agitateur rotatif jusqu'à ce que tous les fragments de tissus sont digérés. Habituellement digestion complète prend 1-3 heures. Réglez le temps de digestion selon caractères pathologiques de tumeurs. (Par exemple adénocarcinome du sein est généralement plus difficile à digérer par rapport au carcinome mucineux qui est plus fragile et a besoin de plus courte durée de digestion). Évaluer le degré de digestion chaque demi-heure en observant 20 ul suspension en vertu hémocytomètre.
4. Autoriser les fragments dans les sédiments pendant 5 min, puis transférer le surnageant dans un tube en polypropylène de 15 ml conique et centrifuger à 200 g pendant 10 min à temtempérature. Décanter avec soin les cellules surnageant et remettre en suspension dans 1-5 ml de milieu de mammosphere.
5. Suivez les étapes décrites ci-dessus 01/01 au 01/04 pour les lignées cellulaires afin d'obtenir et plaque suspensions de cellules isolées. Cellules passe à travers le G 25 seringue un maximum de deux fois si nécessaire pour limiter endommager les cellules.

3. mammosphere efficacité de formation (%) Calcul

1. Après la période de culture, compter les mammospheres (supérieure à 40 um) de diamètre sous un microscope au grossissement de 40X. Image numériquement cinq domaines aléatoires en utilisant un appareil photo numérique sur un microscope optique et déterminent la taille des mammospheres l'aide du logiciel d'acquisition. Utilisez ne importe quel logiciel d'analyse d'images.
2. Calculer mammosphere efficacité Forming (MFE%) selon l'équation suivante:
   MFE (%) = (nombre de mammospheres par puits) / (nombre de cellules ensemencées par puits) x 100

4. Le passage en série de mammospheres pour l'évaluation de l'auto-renouvellement

1. Rejeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans 500 pi de 0,5% de trypsine / EDTA 0,2% préchauffé. Incuber pendant 2-3 min.
2. Ajouter 500 pi de FCS pour neutraliser la trypsine. Centrifuger à 500 g pendant 5 min. Rejeter le surnageant et remettre le culot dans 100 pi de mammospheres médias, pipetage de haut en bas de désagréger sphères.
3. Compter les cellules avec un hémocytomètre et déterminer si les cellules sont en suspension à une seule cellule. Si non passer par un G 25 seringue jusqu'à trois fois pour obtenir des cellules individuelles. Ensemencer les cellules dans un nouveau plus bas attachement plaque ultra 6 puits à la même densité utilisé dans la génération primaire.
4. Après 5-10 jours, comptez sphères> 40 um et de calculer l'efficacité de la sphère de formation selon la formule rapportée auparavant.

Representative Results

Différents échantillons ou ceux qui sont soumis à des traitements différents peuvent varier dans le nombre de mammospheres> 40 um qui se forment après la normalisation pour les cellules ensemencées initiales. Calculer mammosphere efficacité de formation (MFE) pour chaque traitement grandi en trois exemplaires. Cela permet des expériences avec différentes densités d'ensemencement à comparer. Les données sont affichées sur un meilleur diagramme à barres, de préférence avec des contrôles positifs et négatifs, et l'affichage de l'écart-type pour les puits en triple. Constamment transférer cellules adhérentes en plaques non-adhérentes à entre 60-80% de confluence. Comptage des cellules soigneuse est essentielle pour quantifier avec précision les effets des traitements. Estimer le degré de variabilité que cette étape clé contribue à vos résultats en préparant plusieurs suspensions séparément du même traitement bien. Si la concentration cellulaire mesurée diffère sensiblement du même puits, pensez à affiner votre approche de comptage (Figure 2).

Figure 1: Le traitement des cancers du sein primaires et des échantillons de lignées cellulaires pour obtenir des cultures mammosphere échantillons sont digérés par voie enzymatique, validées comme des cellules individuelles, et étalées sur des plaques non adhérentes dans un milieu de mammosphere sans sérum avec des facteurs de croissance.. Elles ne doivent pas être traitées au cours de la phase de croissance pour éviter la fusion sphère. L'image de droite montre représentatives MCF-7 sphères photographiés après 5 jours. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2: résultats représentatifs de mammospheres formés à partir d'un oestrogène épithéliale positive (MCF-7), et un triple negati mésenchymateusesve (MDA-MB-231) lignée cellulaire. fusion cellulaire Minimal / agrégation a été atteint par une faible plaquage de densité, ici, à 500 cellules / cm ² pour MCF-7, et 1 000 cellules / cm ² pour MDA-MB-231.

Discussion

Évaluation positive des mammospheres primaires et secondaires se appuie sur les cellules étant étalées à suffisamment faibles densités qui mammospheres forme de clones uniques, avec une agrégation de la sphère minimale. Cependant, à des densités trop faibles, trop peu mammospheres peuvent former de distinguer les effets des traitements statistiquement. La densité de semis doit être optimisée pour chaque lignée cellulaire utilisée, car ils peuvent varier considérablement dans leur sphère formant efficacité (ceux qui expriment bas E-cadhérine peut former des cultures mammosphere terme moins stables et plus courtes ^18). Cette phase d'optimisation devrait veiller à la plupart des résultats primaires et secondaires formation de la sphère de la croissance clonale de cellules individuelles. Placage une cellule par puits est le seul moyen d'assurer entièrement la formation de mammosphere clonale, et peut être recommandé pour quantifier les taux de ¹³ échantillons fraîchement dérivés auto-renouvellement / différenciation. Pourtant, cette approche souffre également de facteurs de complication: un mammosphere formantefficacité de 1% donnera une seule mammosphere par plaque de 96 puits, et l'efficacité peut être sous-estimé avec moins mammospheres étant formés en l'absence de facteur de croissance paracrine de signalisation entre les cellules en suspension. Enfin, la fréquence de sphères secondaires après repiquage peut estimer les niveaux d'auto-renouvellement, et une plus grande efficacité de l'enseignement secondaire que la formation de la sphère primaire doit être prévu si vraiment la sélection des cellules ayant des propriétés de cellules souches du cancer. Réagrégation est un problème particulier lors de la dérivation sphères secondaires et de type cellulaire densités cellulaires très faibles appropriées devraient être optimisés vers.

Le temps pris pour mammospheres de croître à> 40 um variera également, et peut-être besoin d'être compté entre 5 à 12 jours en fonction de la vitesse de croissance de la sphère mammospheres à partir d'échantillons cliniques. Agrégation et la fusion des sphères se produit inévitablement en raison de la locomotion inhérente de cellules autour des médias, mais le processus semble être sensiblement renforcée par experimenters déplacer les plaques pendant la phase de croissance ^19, donc quelque chose à éviter.

Alors que les grandes sphères sont régulièrement pensé à venir à partir de cellules souches avec une plus grande capacité réplicative à long terme cette hypothèse doit être traitée avec prudence. Les grandes sphères peuvent refléter la capacité de prolifération des progéniteurs, la réactivité aux facteurs de croissance, ou être un produit de fusion ou l'agrégation. Les cellules souches et leurs cellules filles transit d'amplification sont capables de donner naissance à mammospheres ^20, bien que la fréquence combinée des deux types de cellules peut encore tenir compte de la tumorigénicité de la source tissulaire.

Le dosage de mammosphere est limitée par une incapacité à saisir la complexité de la formation de cellules souches du cancer et le comportement dans leur niche in vivo. Pour évaluer vraiment le long terme in vitro et in vivo l'auto-renouvellement et la différenciation des cellules souches du cancer du sein prospective isolés, mammographiedosages sphère devraient donc idéalement être effectuées en collaboration avec le traçage de la lignée et les expériences de xénotransplantation. Bien que la lignée traçage se appuie sur les marqueurs qui reflètent avec précision le sous-ensemble de cellules souches du cancer, ils bénéficient grandement de conserver les conditions in vivo qui contribuent à la formation dynamique des cellules souches du cancer 'de bonne osseuse ». Évaluation de la formation de tumeurs dans des expériences de xénogreffes chez des souris immunodéprimées fournira également de nombreux composants de niche manquantes à partir de tests mammosphere, tout en manquant composants immunitaires et stromales humaines ^21. Bien que techniquement plus exigeante, ces techniques devraient être tenté pour une vue plus complète et informative de cancer du sein propriétés de cellules souches et tumorigène.

Le dosage de mammosphere fournit un outil informatif et pratique, à condition qu'elle soit réalisée avec soin et les limitations ci-dessus considéré: en effet que notre connaissance de la condi in vivotions subies par les cellules souches du cancer avancées, les dosages mammosphere peuvent incorporer un nombre croissant de facteurs moléculaires et environnementaux. En utilisant l'approche décrite ci-dessus, les taux sphère formation correspondent aux taux tumeur initiation dans xénogreffes ^2,15,16, et l'auto-renouvellement des sphères ne augmente dans les cancers les plus agressifs du sein et ²² interventions de plus en plus de cellules souches suivantes telles que la chimiothérapie ^23. Pendant ce temps les sphères eux-mêmes peuvent fournir une ressource précieuse avec lequel pour étudier les différences d'expression et de nouveaux facteurs impliqués dans l'architecture de l'expression des gènes de cellules souches.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12	Lonza	CC-3151
2 mM L-glutamine	Sigma Aldrich	G8540
100 U/ml Penicillin & Streptomycin	Sigma Aldrich	P4083
20 ng/ml Recombinant human epidermal growth factor (EGF)	Sigma Aldrich	E9644
20 ng/ml Recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF)	R&D systems	233-FB-025
1x B27 supplement	Invitrogen	17504-044
Phosphate buffered saline (PBS)	Thermo Scientific	12399902
0.5% trypsin/0.2% EDTA	Sigma Aldrich	59418C
Fetal calf serum	First Link UK	02-00-850
Trypan blue	Sigma Aldrich	93595
Low attachment 6-well plates	Corning	CLS3814
Collagenase type 1A	Sigma Aldrich	C9891
Hyaluronidase	Sigma Aldrich	H3506
Sterile razor blades	Fisher Scientific	12443170
Sterile scalpel	Fisher Scientific	11758353
Sterile micro-dissecting scissors	Sigma Aldrich	S3146