Abstract
Multipel skleros är en inflammatorisk demyeliniserande sjukdom i det centrala nervsystemet som kännetecknas av plackbildning innehåller förlorade oligodendrocyter, myelin, axoner, och nervceller. Remyelinisering är en endogen reparation mekanism genom vilken nya myelin produceras efter spridning, rekrytering, och differentiering av oligodendrocyt prekursorceller i myelinbildande oligodendrocyter, och är nödvändig för att skydda axoner från ytterligare skador. För närvarande, alla läkemedel för behandling av multipel skleros rikta avvikande immun komponenten av sjukdomen, vilket minskar inflammatoriska skov men inte förhindra progression till irreversibel neurologisk nedgång. Det är därför viktigt att remyelinisering främjande strategier utarbetas som kan fördröja sjukdomsutvecklingen och kanske vända neurologiska symtom. Flera djurmodeller för demyelinisering finns, inklusive experimentell autoimmun encefalomyelit och curprizone; Det finns dock liminingar i deras användning för att studera remyelinisering. En mer robust metod är bränn injektion av gifter i det centrala nervsystemet, inklusive tvättmedels lysolecitin i ryggmärgen vita substansen av gnagare. I detta protokoll visar vi att det kirurgiska ingreppet involverad i att injicera lysolecitin i den ventrala vita substansen av möss är snabb, kostnadseffektiv och kräver inga ytterligare material än de som är kommersiellt tillgängliga. Detta förfarande är viktigt inte bara för att studera de normala händelser involverade i remyelinisering processen, men också som en preklinisk verktyg för screening kandidat remyelinisering främjande läkemedel.
Introduction
Multipel skleros (MS) är en kronisk demyeliniserande sjukdom i det centrala nervsystemet (CNS) som kännetecknas av immuncellinfiltration och plack som innehåller förlorat myelin, oligodendrocyter, axoner och nervceller. De flesta patienter har en sjukdom kurs bestående av inflammatoriska skov tillsammans med ett brett spektrum av neurologiska symtom, följt av perioder av remission. Över hälften av dessa patienter så småningom övergå till en sekundär progressiv scen med några uppenbara återfall men kontinuerlig neurologisk nedgång. Man tror att denna progressiva försämringen beror på axonal skada och förlust, bidrog delvis av kronisk demyelinisering. Strategier för att återställa förlorad myelin anses därför en lovande behandlingsform för att fördröja sjukdomsförloppet och kanske vända neurologiska symtom.
Remyelinisering är en endogen reparationssvar i CNS vari nya myelinskidorna genereras från rekryteras oligodendrocyt prekursorceller(OPCs) som differentierar till myelinbildande oligodendrocyter. Remyelinisering har visats i djurmodeller för att vara ganska robust 1-3, dock avtar dess effektivitet med åldern 4. Faktum sker remyelinisering hos människor, även om den är ofullständig i majoriteten av MS-patienter 5. Alla närvarande tillgängliga läkemedel för MS rikta främst avvikande immun komponenten av sjukdomen och samtidigt effektiva för att minska återfall, inte markant fördröja sjukdomsutvecklingen. Nästa generation av terapeutiska strategier för hantering av MS kommer att integrera framsteg inom immunmodule med förstärkning av endogena remyelinisering för att förhindra både återfall och progression 6.
En metod för att studera de- och remyelinisering i CNS innefattar direkt injicering av tvättmedels lysofosfatidylkolin (lysolecitin) in i ryggmärgen vita substansen 1,3,7. Detta förfarande ger en väl karakteriserad demyelinating skada huvudsakligen av makrofag / microglial infiltration och aktivering 8,9, reaktiv astroglios, störning av axonal homeostas / axonal skada och OPC proliferation och migration 10 består. Lesionen utvecklas förutsägbart under period av några veckor och så småningom kapabel att fullt remyelinating. Denna metod har varit särskilt användbart för att studera koreografi av händelser som är involverade i de- och remyelinisering. Vidare har det antagits som ett verktyg för preklinisk testning av kandidatterapier att påskynda reparation efter en demyeliniserande förolämpning.
Protocol
OBS: De djur som används i detta förfarande var omhändertagna enligt den kanadensiska rådet om Djurvård (CCAC) riktlinjer. Etik godkändes av Animal Care kommittén vid University of Calgary.
1. Förbered injektionsspruta
- Lös lysolecitin till en 1% lösning i fosfatbuffrad saltlösning (PBS; pH 7,4) och förvaras vid -20 ° C i små alikvoter (75 pl). Tina en flaska till RT.
OBSERVERA: om lysolecitin är olöst, sonikera röret med ultraljud (40 kHz) under ca 30 min för att bilda en enhetlig lösning. - Hantera före drog glaskapillär med extrem försiktighet för att undvika att skada den känsliga spets. Skruva av muttern av en 10 l injicera sprutan och trä den på den platta änden av kapillär följt av 2 hylsor, se till att de passande ändar hylsorna anpassa och kapillär är skönt på den koniska hylsan (Figur 1). Skölj sprutan med isopropyl alkohol och ta bort kolven. När torr, skruva nålmonteringen för hand på injicera sprutan.
- Fäst metallnavet ålen till priming sprutan. Pierce en gummiskiva med nålen och dra den ner till basen. Fyll priming sprutan med lysolecitin. Trampa försiktigt på priming sprutan tills vätska syns vid nålspetsen. Detta säkerställer luftbubblor kommer inte att införas in i injektionssprutan.
- Sätt i metallnavet nålen på priming sprutan i injektionssprutan. Göra en fast tätning med gummiskiva, långsamt trycka ner priming sprutan tills kapillär fyller till spetsen med lösningen. Försiktigt bort priming sprutan samtidigt deprimerande att fylla cylindern på injicera sprutan utan att införa luftbubblor. För in kolven i injektionssprutan och säkerställa lösningen strömmar från spetsen av kapillären som kolven försiktigt deprimerad.
OBS: Om några luftbubblor är synliga i locketIllary eller injicera sprutan sprutan preparatet upprepas från början. Kontinuerlig vätska i injektionsapparaten är avgörande för att säkerställa injektions exakta volymer. - Fäst avslutade injicera sprutan till armen av en stereotaktisk mikromanipulator. Detta avslutade apparat kommer att kunna injicera 15-20 djur innan det måste fyllas på.
- Kassera den återstående lysolecitin från grundn sprutan. Uttag och tryck isopropylalkohol flera gånger, och ta bort metallnavet ålen. Vänta flera timmar för resterande isopropylalkohol i priming sprutan avdunsta innan du fyller igen.
2. Förbered Animal för Kirurgisk procedur
OBS: Denna procedur beskrivs för kvinnliga C57BL / 6 möss, i åldern 8-10 veckor.
- Bedöva djuret med en intraperitoneal injektion av ketamin (200 mg / kg) och xylazin (10 mg / kg) eller per institutionella regleringarna djurskötsel. Plan fördjur för att vara under narkos för cirka 1 timme om du använder injicerbara anestesi.
- Testa att djuret är djupt sövd med fast klämma foten. En rätt sövda djur kommer inte svara på nypa.
- Använda Clippers, rakar en 2-3 cm 2 område på ryggsidan av djuret, nära öronen. Var noga med att inte skada hörseln.
- Torka området rent med 70% etanol anbringas på en kompress. Se till att alla klippt hår har tagits bort från området. Desinficera området med jod.
- Applicera vaselin till ögonen för att förhindra uttorkning under hela förfarandet.
- Håll djuret i en uppvärmd återvinningskammare tills den ska inleda förfarandet.
3. Utför det kirurgiska ingreppet
OBS: Kontrollera att tillräcklig aseptisk teknik för alla steg i proceduren. Detta inkluderar korrekt användning av handskar, hårnät, masker och draperier. Alla verktyg bör steriliseras innan man kommer in contact med djuret.
- Flytta djuret till en stereotaktisk ram, ryggsidan uppåt, förhöjt vid mittsektionen av vikta pappershanddukar för att överdriva krökning av ryggraden. Fäst armarna och svans med kirurgtejp och fäst i huvudet med en tandklämma. Stabiliserande örat barer är inte nödvändiga för detta förfarande.
- Använd en skalpell för att göra en 3 cm mittlinjeincision, med början strax under öronen och skära i caudal riktning.
- Leta reda på klyftan mellan de två stora fettstrukturer och använda fin pincett i varje hand för att dra dessa isär. Sprid upprullningsdon att öppna kirurgiska området.
- Under ett operationsmikroskop, lokalisera framträdande utväxt process T2 kotan (Notera: denna funktion är karakteristisk för C57BL / 6 musstam). Utför en dissektion med stängda våren sax genom överliggande muskulatur att bättre visualisera T2. Med hjälp av pincett, känner för hårda ytor av T3 och T4 för att bekräfta korrekt anatomisk placering.
- Använda våren sax, göra grunda sido snitt (2-3 mm djup) av bindväv mellan T3 och T4. På grund av naturliga avståndet mellan kotorna i övre bröstkorg delen av musen ryggraden, är en laminektomi inte nödvändigt att avslöja ryggmärgen. Var medveten om att alltför djupt en nedskärning tränger och skada sladden.
OBS: En liten grad av blödningar är vanligt under detta steg. Om detta inträffar, hålla en svamp spjut in i området tills blödnings avtar (30-60 sek). - Visualisera ryggmärgen. Det kommer att täckas med ett tjockt lager av synliga dura om denna meningeal skikt ännu inte bröts medan exponera sladden. En framstående blodkärl löper caudal / rostralt genom ungefärliga mittlinjen av ryggmärgen.
OBS: Denna kärl bör inte användas som ett landmärke för mittlinjen. I stället bör tillräcklig belysning avslöja grå-vita substansen gränser flankerar dorsala kolumnen och dessa bör användas för att uppskatta medellinjen. - Om duraförblir intakt, gör mjuka sido skrapar med en 32 G metall nålen tills den raderas. Målet är att ta bort dura utan skär de återstående underliggande hjärnhinnan, som inte är så tjock och svårare att se.
OBS: Release av cerebrospinalvätska indikerar en överträdelse av spindelvävshinnan och medan detta kan ske utan mekaniska skador på vävnaden, bör den ackumulerade cerebrospinalvätska tas bort med en svamp spjut för att bättre visualisera ytan av sladden. - Flytta injicera sprutan på plats och långsamt sänka den tills spetsen på kapillären bara knappt vidrör ryggmärgen omedelbart lateralt om endera sidan av mittlinjen. Lås armen på plats.
- Använd graderade mätningar av Z-riktningen stereotaktisk arm så att en baslinje positionsmätning. Från denna läsning, subtrahera 1,3 mm. Använd en snabb och ytlig nedåtgående rörelse för att tränga igenom vävnaden och sedan försiktigt sänka kapillär tills den nya mätningen har uppnåtts. Tillval: om så önskas,lesioner i dorsala kolonnen kan produceras genom samma genomträngande rörelse vid mittlinjen och ett djup av 0,3 mm (se diskussion för ytterligare information).
OBS: Dessa värden är specifika för injicering mellan T3 och T4. Om väljer att utföra injektionen på någon annan plats i ryggmärgen, måste dessa värden härledas från alla tillgängliga mus hjärnatlas. - Använd mikromanipulator att pressa lysolecitin i den ventrala ryggmärgen vita substansen. Gör en rotation av mikromanipulator varje 5 sekund i 2 minuter, vilket resulterade i en slutlig volym av 0,5 ul. Låt kapillär på plats för 2 extra minuter för att förhindra backflöde av lösning, och sedan försiktigt bort kapillär.
- Binder en enda sutur i muskeln / adiposvävnad överdra ryggraden. Använd en icke-avbruten sutur för att stänga huden. Applicera mer jod till snittet webbplatsen.
- Placera djuret i en uppvärmd återvinningskammaren tills den återhämtar sig, sedan tillbaka till sin bur. Tillämpa analgetika Post-operativt per institutionella regler djurskötsel. Ytterligare postoperativ vård är oftast inte nödvändigt eftersom djuren är helt rörlig och kan själv utfodring och dricka så fort de återhämtning från anestesi.
- Upprepa proceduren för de återstående djuren.
OBS: Med skicklighet, operationen kan genomföras på 10-15 min per djur, särskilt med hjälp av en andra person knyta suturer. Samma glaskapillär kan användas i ca 15-20 operationer innan spetsen blir slö och bör bytas ut. Kontroll operationer kan utföras på samma sätt som beskrivits, med en injektion av PBS i ryggmärgen istället för lysolecitin. Vi rekommenderar inte rengöring kapillärerna för framtida bruk.
4. Vävnads Bearbetning och analys
- Offra djuren med en intraperitoneal överdos av ketamin (500 mg / kg) och xylazin (25 mg / kg) vid önskade tidpunkter. Lesioner utvecklas typiskt i follgrund sätt: 1-3 dagar, aktiv demyelinisering; 3-7 dagar, OPC rekrytering; 7-10 dagar, oligodendrocyt differentiering; 10-21 dagar, aktiv remyelinisering 2,10,11.
- För att förbereda vävnad för histologi, först utföra en transcardial perfusion 12 med 20 ml RT PBS följt av 20 ml iskall 4% paraformaldehyd i PBS. För beredning av harts inbäddad vävnad för semi- eller ultratunna sektione, se steg 4.9.
- Avlägsna ryggmärgen med användning krökta ben sax för att skära igenom varje kotor börjar vid den cervikala änden av ryggraden och arbeta ned till den nedre bröstnivå. Fäst ryggmärgen O / N i 4% paraformaldehyd i PBS vid 4 ° C. Växla sladdarna till 30% sackaros i PBS vid 4 ° C under minst 72 timmar.
- Identifiera injektionsstället som en avvikelse på den dorsala ytan av ryggmärgen. Skär en 3 mm bit vävnad (med injektionsstället i mitten) och rikta bitarna i cryomolds innehåller optimala skärtemperatur (OCT) compound. Suspendera undersidan av cryomolds i en kyld blandning av 2-metylbutan och torris tills oktober är helt frusen. Förvara vid -80 ° C tills den ska avsnitt.
- Avsnitt de ryggmärgen på en kryostat med en bredd av 20 nm på objektglas och låt lufttorka O / N innan förvaring bilderna vid -20 ° C.
- Identifiera lesion läge och storlek med hjälp av en Eriochrom cyanin histologisk färgning av myelin 13. Utför alla steg vid RT. Lufttorka bilder för 30 min. Placera objektglasen i clearing agent för en min följt av rehydrering i graderade etanollösningar (100%, 95%, 90%, 70%, 50%, vatten) och 1 min vardera.
- Placera objektglasen i Eriochrom cyanin lösningen under 15 min, följt av en 1 min tvätt med vatten. Deri i 0,5% ammoniumhydroxid i 10 sek, följt av en 1 min tvätt med vatten. Torka i graderade etanollösningar (omvänd ordning enligt ovan) under 1 minut vardera, täck med montering media, och bild på en ljus-fält mimikroskop.
- Använd immunohistokemi att visualisera axoner och myelin. Lufttorka bilder för 30 min. Dehydrera med graderad etanol (vatten, 50%, 70%, 90%, 95%, 100%) för 2 min vardera vid RT, sedan omvänd ordning tillbaka till vatten. Detta steg resulterar i högre upplösning av individuella myelinringar 14.
- Blockera icke-specifika interaktioner antikropp med användning 10% getserum och 0,25% Triton X-100 i PBS under 60 min vid RT. Späd primära antikroppar (mus-anti-SMI312 1: 2000, kanin-anti-MBP ett: 1000) i PBS och inkubera på diabilder O / N vid 4 ° C.
- Tvätta 5 gånger under 5 min med PBS vid RT. Späd sekundära antikroppar (Alexa 488 anti-kanin 1: 500, Alexa 546 anti-mus 1: 500) i PBS och inkubera på objektglasen i 60 min vid RT. Tvätta 5 gånger under 5 min med PBS vid RT. Mount glider med täck använder Gelvatol och bild på en fluorescerande mikroskop.
- Använd immunohistokemi att visualisera celler av oligodendrocythärkomst. Följ proceduren för step 4,7, med utelämnande av dehydratisering / rehydratisering steg, och med användning av 10% hästserum i stället för getserum. Använd följande primära antikroppsspädningar: get-anti-PDGFRα 1: 100, mus-anti-CC1 1: 200, kanin-anti-Olig2 1: 200. Använd följande sekundära spädantikropps: Alexa 488 anti-get 1: 500, Alexa 594 anti-mus 1: 500, Alexa 647 anti-kanin 1: 500.
- För att framställa vävnad för halv- eller ultratunna sektione, först utföra en transcardial perfusion 12 med 20 ml RT PBS följt av 20 ml iskall 4% paraformaldehyd / 1% glutaraldehyd i PBS. Ta bort ryggmärgen som beskrivs i steg 4.3. Fix O / N i 4% paraformaldehyd / 1% glutaraldehyd i PBS vid 4 ° C.
- Identifiera injektionsstället som beskrivs i steg 4.4. Klipp en 1 mm bit vävnad innehållande injektionsstället. Ytterligare en mm block på vardera sidan av lesionen, kan framställas såväl om så önskas.
- I ett dragskåp till 10 gånger volymen 1% osmiumtetroxid / 1,5% kaliumferrocyanid till varje block på isunder 60 min.
OBS: osmiumtetroxid är ett mycket giftigt ämne och bör hanteras med stor försiktighet. Alla material i kontakt med osmiumtetroxid bör placeras i majsolja (två gånger volym som osmiumtetroxidlösning) för neutralisation. - Tvätta sladdar 3 gånger med 0,2 M kakodylat under 10 min vid RT, och kasta bort i majsolja. Dehydrera med graderade etanollösningar (vatten, 50%, 70%, 90%, två gånger med 95%, två gånger med 100%, två gånger med propylenoxid) under 10 minuter vid RT.
- Bädda sladdar i harts enligt tillverkarens anvisningar.
- Skär block på en ultramikrotom och montera sektionerna på vatten droppar på objektglas. Placera objektglasen på en värmeplatta (ca 50 ° C) tills torr.
- Visualisera myelin genom att tillsätta några droppar 1% toluidinblått / 2% borax lösningen på bilderna för 10-15 sek vid 50 ° C. Skölj med vatten, torka och täck med monteringsmedier. Bild avsnitt på en ljus-fält mikroskop.
Representative Results
Fokal injektion av lysolecitin i den ventrala vita substansen producerar en diskret demyeliniserande lesion som är detekterbar över en distans av ungefär 3 mm (figur 2). Immunhistokemisk färgning av lesionen kärna för myelin (MBP) och axoner (SMI312) visar axoner som har berövats myelin på 7 dagar (Figur 3). Av 14 dagar, många axoner omgivna av MBP-positiva ringar, vilket tyder på förekomsten av remyelinisering. Färgning för celler av oligodendrocythärkomst (PDGFRα, Olig2, CC1), finns det en betydande ökning av både det totala antalet celler vid 14 dagar jämfört med 7 dagar, såväl som fördelningen av mogna oligodendrocyter jämfört med OPCs (Figur 4) . I överensstämmelse med detta konstaterande, halvtunn sektioner färgas med toluidinblått avslöja förekomsten av tunna myelinskidor på 14 dagar som sällan upptäcks vid 7 dagar (Figur 5), vilket tyder på att dessa remyelinated jagnternodes.
Förfarandet är mycket reproducerbar mellan djur. Variation uppstår när tung andning förändrar den stationära positionen för kapillär-det är oftast inte ett problem med adekvat sedering. Skador på axoner verkar vara minimal, utom i centrum av lesionen, vilket har beskrivits sedan tidigaste användningen av modellen 1. Vi tror att detta är mekaniska skador från glas kapillär, eftersom det också är observerbar i PBS injicerade kontroller. Ändå tenderar variabilitet att vara liten, och vi och andra som använder en liknande procedur har upptäckt skillnader mellan experimentella förhållanden med så få som fyra djur per grupp 15.
Figur 1. Montering av injicera sprutan. (A) Muttern av injektionssprutan gängas på t Han platta änden av glaskapillär, följt av 2 hylsor så att deras parnings slutar interlock. När kapillär är ordentligt tätt i den koniska hylsan, är monteringen skruvas för hand på slutet av injicera sprutan. (B) Stycke centrum av en gummiskiva med metallnavet nål fäst till priming sprutan och skjut ner det till basen. (C) Dra lysolecitinlösningen i priming sprutan. (D) tryck försiktigt på priming sprutan tills den första droppen lysolecitin syns på nålspetsen. (E) För in priming sprutan i cylindern på injektions spruta, vilket gör en fast tätning med gummiskiva. Trampa försiktigt lösningen tills den löper till slutet av kapillären. Försiktigt dra tillbaka priming sprutan bibehållen trycket på kolven för att ta bort metallnavet nålen utan att införa luftbubblor i injicera sprutan.ladda upp / 52.679 / 52679fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Representativa lysolecitin lesion färgas med Eriochrom cyanin. Seriesektioner (åtskilda 400 | im från varandra) av en karakteristisk lysolecitin lesion vid 14 dagar färgade med Eriochrom cyanin att visualisera myelin (blå). Observera att demyelinisering är begränsad till den ventrala vita substansen och att lesionen spänner ca 3 mm i rostral / caudal riktning. Skala bar = 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Axoner och myelin ilysolecitinprodukten modellen. (A) En bluff (PBS) injicerat ryggmärgen på 7 dagar visar friska axoner som omges av myelinringar. (B) A lysolecitinprodukt lesion vid 7 dagar visar utblottad axoner samt degraderad myelin. (C) Vid 14 dagar, en Andelen axoner (exempel betecknade med vita pilspetsar) är förknippade med återkomsten av myelinringar. Skala bar = 10 mikrometer. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. oligodendrocythärkomst celler i lysolecitin modellen. (A, C) Vid 7 dagar, det finns en större representation av PDGFRα + OPCs (vita staplar) i förhållande till CC1 + oligodendrocyter (magenta staplar); siffrorna inom staplarna representerar procentsatser. Olig2 sonderades tillbekräfta färgning av oligodendrocythärkomst celler. (B, C) vid 14 dagar, finns det en betydande ökning av det totala antalet oligodendrocythärkomst celler jämfört till 7 dagar (p <0,05, två-tailed t-test, n = 4 per grupp ). Det finns också en betydande ökning av fördelningen av oligodendrocyter till OPCs vid 14 dagar jämfört med 7 dagar (p <0,0001, Fishers exakta test). Scale bar = 10 | im. Varje fält fångas med en ursprunglig förstoring av 60X. Värdena är medelvärde ± SD. * Betecknar p <0,05. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. remyelinisering i lysolecitin modellen. (A) En tvärsnitts toluidinblå färgade halvtunn delen av ventrala vita substansen i en healthy musen visar axoner över ett brett spektrum av kaliber med respektive myelin tjocklek. (B) Vid 7 dagar, en brist på myelinskidorna observeras intill en opåverkad område (nere till höger). (C) Vid 14 dagar, tunt myeliniserade höljen ( exempel betecknas med röda pilspetsar) visas hela lesionen, som indikerar remyelinated segment. Skala bar = 10 mikrometer. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Ett antal djurmodeller har utvecklats för att studera MS, mest igenkännlig den experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) modell. I EAE är gnagare vaccineras mot ett fragment av en myelinpeptid och genomgår inflammatoriska lesion utveckling manifesterar i stigande förlamning. Även denna modell har varit till nytta för preklinisk testning av immunmoduler MS-läkemedel är det inte idealiskt för att studera remyelinisering främst av tre skäl: För det första, är något slumpmässig placering av inflammatoriska lesioner, och lokalisera lesioner vid bearbetning vävnad för semi- eller ultratunna sektioner kan vara utmanande. Det andra är att remyelinisering sker över en viss tidsförlopp, och den exakta åldern på en enda EAE lesion kan inte vara känd utan kontinuerlig icke-invasiv magnetisk resonanstomografi. Den tredje är att remyelinisering är en naturligt förekommande fenomen hos gnagare, och bevis på remyelinisering efter läkemedelsbehandling i EAE får inte vara en primär följd av drogen, men iStead ett sekundärt fenomen av att reducera inflammation.
En annan vanlig metod för framställning av demyelinering uppnås genom att införa koppar kelator cuprizone i kosten. Detta resulterar i omfattande demyelinisering, notably i corpus callosum. Det finns begränsningar i att studera corpus callosum som ett område av remyelinisering av följande skäl: För det första, axon diametrar (och därmed myelin tjocklek) är mindre än andra CNS regioner, och därmed tunt remyelinated slidor kan vara omöjlig att skilja från de som var aldrig demyelinerad. För det andra, eftersom musen corpus callosum innehåller> 70% omyeliniserade axoner 16, kan det vara oklart om en remyelinated segment är sant reparation av skadat myelin eller de novo myelin syntes i den vuxna, vilket sker normalt 17.
Det är vår övertygelse att den bästa modellen för att studera remyelinisering är direktinsprutning av toxiner, antingen lysolecitin, ethidiumbromid, eller andra, i stjärtfenan cerebrala skaft 18 eller ryggmärgen vita substansen. Den tidigare läge uppnås endast genom exakt 3-dimensionen stereotaktisk injektion, och är begränsad till större gnagare (råttor) på grund av den begränsade storleken på de cerebellära stjälkar. Detta utesluter omfattande resurs av transgena möss studera de- och remyelinisering. Ryggmärgen innehåller dock många stora vita substans som är lätt åtkomliga kirurgiskt. Utrymmen mellan kotor i den rostrala thoraxsegmentet möjliggör exponering av ryggmärgen utan behov av en laminektomi, vilket är ett nödvändigt steg i kaudala bröstkorg kirurgiska procedurer. En fördel med specifikt rikta den ventrala vita substansen är att axoner är jämnt större än ryggens vita substansen, vilket gör kvantifiering av remyelinisering en mindre tvetydig uppgifts liknar de utmaningar som är förknippade med corpus callosum. Dessutom gör den ventrala vita substansen upp en mycket större tArget område att injicera; flera hundra mikrometer i sidled i den dorsala regionen skulle placera kapillären utanför kolonnen, medan samma avvikelse ventralt fortfarande skulle producera en framträdande demyeliniserande lesion. Vissa protokoll injicera lysolecitin i både dorsala och ventrala kolumner av samma djur 19. Detta kan öka både sannolikheten för korrekt kapillär placering och antalet kvantifierbara lesioner i färre djur. Medan de nuvarande data som presenteras är 8-10 veckor gamla djur vid tidpunkten för operationen, har vi också haft framgång med samma procedur på 8-10 månader gamla möss, där remyelinisering beskrivs som markant långsammare 4.
Kvantifiering av remyelinisering är inte en trivial företag. En central dogma postulerar att remyelinated segmenten är kortare i längd och tunnare i genomsnitt än sina friska motsvarigheter, och således G-förhållande beräkningar (axon diameter dividerat med axon + myelin diameter) av tvärsnitts halv- or ultratunna avsnitt har blivit standardförfarande. Det är dock känt att remyelinated segment tjockna med tiden 2 och en ny studie med hjälp av en transgen reporter på remyelinating oligodendrocyter antyder att många inter blir så småningom att skilja från kontroll 20. Kvantifiera antalet mogna oligodendrocyter inom lesionen är ett indirekt sätt att mäta reparation, eftersom oligodendrocyter är kapabla att göra ett stort antal inter, och en betydande del av remyelinisering-beroende på vilken modell som används, kan uppstå från Schwannceller 3. Naturligtvis, som remyelinisering har kopplats till restaurering av saltatorisk ledning 21, skulle den ultimata metriska av reparation vara funktionell återhämtning av neurologiska bortfall. Medan remyelinisering har kopplats till återhämtning av funktionen i vissa arter 22,23, har det inte blivit ett standardförfarande i murina lysolecitin studier. Detta beror sannolikt på en brist på öppen observerbara underskott från antingen rygg eller ventrala skador, jämfört med mer robusta demyelinisering modeller såsom EAE och även cuprizone. Vi tror att funktionella underskott till följd av lysolecitin injektion, och efterföljande återhämtning med remyelinisering, endast kommer att kunna observeras med hjälp känsliga tester av fina sensomotoriska funktion.
En PubMed jakt efter "remyelinisering" tillsammans någon av djurmodeller som anges ovan, om än en brysk metodstrategi, visar färre sökträffar för lysolecitin (109) jämfört med EAE (188) och cuprizone (197). Om våra argument om att lysolecitin demyelinisering är överlägsen metod för att studera remyelinisering, varför är det den minst diskuteras? Kanske en uppfattning för att använda den här metoden kommer från en tro på teknisk svårighet i att utföra det kirurgiska ingreppet. I verkligheten är detta förfarande snabb, kostnadseffektiv, och är inte svårare än rutinvävnad dissektion, kräver material som är all kommersiellellt tillgängliga. Det är vår förhoppning att detta protokoll visar användbar för dem som vill lägga till denna kraftfulla modellen till sin repertoar för att studera den spännande och växande området myelin reparation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| spring scissors | Fine Science Tools | 15004-08 | |
| forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| retractor | Fine Science Tools | 17003-03 | |
| clippers | Philips | QG3330 | |
| heating recovery chamber | Peco Services | V1200 | |
| surgical tape | 3M | 1527-1 | |
| scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| scalpel blade | Feather | No. 15 | |
| sponge spear | Beaver Visitec | 581089 | |
| 5-0 Vicryl sutures | Ethicon | J511G | |
| curved ToughCut spring scissors | Fine Science Tools | 15123-12 | |
| 32 G metal needle | BD | 305106 | |
| needle holders | Fine Science Tools | 12002-14 | |
| angled forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| cotton tipped applicator | Puritan | 806-WC | |
| gauze pads | Safe Cross First Aid | 3763 | |
| 10 μl syringe | Hamilton | 7635-01 | make sure to purchase the microliter, not gastight syringe |
| compression fitting | Hamilton | 55750-01 | contains the 2 ferrules and removable nut, but the nut that comes with the 10 μl syringe is a tighter fit |
| priming kit | Hamilton | PRMKIT | contains the priming syringe, removable hub needle and the rubber discs |
| pre-pulled glass capillaries | WPI | TIP10TW1 (pack of 10) | contains capillaries with 10 μm inner diameter. 30 μm inner diameter also work (TIP30TW1) |
| stereotactic frame | David Kopf instruments | Model 900 | |
| Ultrasonic cleaner | Fisher Scientific | FS-20 | |
| Tissue-Tek optimal cutting temperature (OCT) compound | VWR | 25608-930 | |
| Tissue-Tek intermediate cryomold | VWR | 25608-924 | |
| cryostat | Leica | CM1900 | |
| microscope slides | VWR | 48311-703 | |
| bright field microscope | Olympus | BX51 | |
| ultramicrotome | Leica EM UC7 | EM UC7 | |
| Lysophosphatidylchoine | Sigma | L1381 | |
| 2-methylbutane | Sigma | M32631 | |
| Triton x-100 | Sigma | X-100 | |
| goat serum | Sigma | G9023 | |
| Mouse anti-SMI312 antibody | Covance | SMI-312R | 1:2,000 dilution |
| Rabbit anti-MBP antibody | Abcam | AB40390 | 1:1000 dilution |
| Goat anti-PDGFRα antibody | R&D Systems | AF1062 | 1:100 dilution |
| Rabbit anti-Olig2 antibody | Millipore | AB9610 | 1:200 dilution |
| Mouse anti-CC1 antibody | Calbiochem | OP80 | 1:200 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Life technologies | A-11008 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG | Life technologies | A-11003 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG | Jackson Immuno | 705-546-147 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse IgG | Jackson Immuno | 715-586-151 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG | Jackson Immuno | 711-606-152 | 1:500 dilution |
| PBS | Oxoid | BR0014 | |
| isopropyl alcohol | Sigma | 109827 | |
| ketamine | CDMV | ||
| xylazine | CDMV | ||
| iodine | West Penetone | 2021 | |
| Vaseline petroleum jelly | VWR | CA05971 | |
| paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| sucrose | Sigma | S5016 | |
| Eriochrome Cyanine R | Sigma | 32752 | |
| sulfuric acid | Sigma | 320501 | |
| iron(III) chloride | Sigma | 157740 | |
| ammonium hydroxide | Sigma | 320145 | |
| Acrytol | Leica Biosystems | 3801700 | |
| Citrisolv | Fisher Scientific | 22-143-975 | |
| horse serum | Sigma | H0146 | |
| glutaraldehyde | Electron Micrscopy Sciences | 16220 | |
| osmum tetroxide | Electron Micrscopy Sciences | 19150 | highly toxic |
| potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate | Sigma | P3289 | |
| corn oil | Sigma | C8267 | |
| polyvinyl alcohol | Sigma | P8136 | |
| glycerol | Sigma | G9012 | |
| cacodylic acid | Electron Micrscopy Sciences | 12300 | |
| propylene oxide | Electron Micrscopy Sciences | 20401 | |
| EMBED kit | Electron Micrscopy Sciences | 14120 | |
| Toluidine Blue O | Sigma | T3260 | |
| Sodium tetraborate decahydrate | Sigma | S9640 | |
| Recipes | |||
| Eriochrome cyanine solution | |||
| Ingredient | Amount to add | ||
| Eriochrome Cyanine R | 0.8 g | ||
| sulfuric acid | 400 ml 0.5% | ||
| iron(III)chloride | 20 ml 10% | ||
| water | 80 ml | ||
| *add eriochrome cyanine to sulfuric acid, followed by iron(III) chloride and water. Solution can be kept after use. Make fresh once per year. | |||
| Gelvatol | |||
| Ingredient | Amount to add | ||
| PBS | 140 mL | ||
| polyvinyl alcohol | 20 g | ||
| glycerol | 40 g | ||
| *mix well, place at 37 °C O/N, centrifuge at 1,960 x g 30 min, aliquot into 40 tubes |
References
- Blakemore, W. F., Eames, R. A., Smith, K. J., McDonald, W. I. Remyelination in the spinal cord of the cat following intraspinal injections of lysolecithin. J. Neurol. Sci. 33 (1-3), 31-43 (1977).
- Jeffery, N. D., Blakemore, W. F. Remyelination of mouse spinal cord axons demyelinated by local injection of lysolecithin. J. Neurocytol. 24 (10), 775-781 (1995).
- Blakemore, W. F. Invasion of Schwann-cells into the spinal-cord of rat following local injections of lysolecithin. Neuropathol. Appl. Neurobiol. 2 (1), 21-39 (1976).
- Shields, S. A., Gilson, J. M., Blakemore, W. F., Franklin, R. J. Remyelination occurs as extensively but more slowly in old rats compared to young rats following gliotoxin-induced CNS demyelination. Glia. 28 (1), 77-83 (1999).
- Patrikios, P., et al. Remyelination is extensive in a subset of multiple sclerosis patients. Brain. 129 (Pt 12), 3165-3172 (2006).
- Keough, M. B., Yong, V. W. Remyelination therapy for multiple sclerosis). Neurotherapeutics. 10 (1), 44-54 (2013).
- Hall, S. M. The effect of injections of lysophosphatidyl choline into white matter of the adult mouse spinal cord. J. Cell Sci. 10 (2), 535-546 (1972).
- Miron, V. E., et al. M2 microglia and macrophages drive oligodendrocyte differentiation during CNS remyelination. Nat. Neurosci. 16 (9), 1211-1218 (2013).
- Kotter, M. R., Setzu, A., Sim, F. J., Van Rooijen, N., Franklin, R. J. Macrophage depletion impairs oligodendrocyte remyelination following lysolecithin-induced demyelination. Glia. 35 (3), 202-212 (2001).
- Lau, L. W., et al. Chondroitin sulfate proteoglycans in demyelinated lesions impair remyelination. Ann. Neurol. 72 (3), 419-432 (2012).
- Fancy, S. P., et al. Dysregulation of the Wnt pathway inhibits timely myelination and remyelination in the mammalian CNS. Genes Dev. 23 (13), 1571-1585 (2009).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J. Vis. Exp. (65), (2012).
- Skihar, V., et al. Promoting oligodendrogenesis and myelin repair using the multiple sclerosis medication glatiramer acetate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (42), 17992-17997 (2009).
- Plemel, J. R., et al. Platelet-derived growth factor-responsive neural precursors give rise to myelinating oligodendrocytes after transplantation into the spinal cords of contused rats and dysmyelinated mice. Glia. 59 (12), 1891-1910 (2011).
- Chong, S. Y., et al. Neurite outgrowth inhibitor Nogo-A establishes spatial segregation and extent of oligodendrocyte myelination. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (4), 1299-1304 (2012).
- Sturrock, R. R. Myelination of the mouse corpus callosum. Neuropathol. Appl. Neurobiol. 6 (6), 415-420 (1980).
- Young, K. M., et al. Oligodendrocyte dynamics in the healthy adult CNS: evidence for myelin remodeling. Neuron. 77 (5), 873-885 (2013).
- Woodruff, R. H., Franklin, R. J. Demyelination and remyelination of the caudal cerebellar peduncle of adult rats following stereotaxic injections of lysolecithin, ethidium bromide, and complement/anti-galactocerebroside: a comparative study. Glia. 25 (3), 216-228 (1999).
- Mei, F., et al. Micropillar assays as a high-throughput screening platform for therapeutics in multiple sclerosis. Nat. Med. 20 (8), 954-960 (2014).
- Powers, B. E., et al. Remyelination reporter reveals prolonged refinement of spontaneously regenerated myelin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (10), 4075-4080 (2013).
- Smith, K. J., Blakemore, W. F., McDonald, W. I. Central remyelination restores secure conduction. Nature. 280 (5721), 395-396 (1979).
- Jeffery, N. D., Blakemore, W. F. Locomotor deficits induced by experimental spinal cord demyelination are abolished by spontaneous remyelination. Brain. 120 (Pt 1), 27-37 (1997).
- Duncan, I. D., Brower, A., Kondo, Y., Curlee, J. F. Jr, Schultz, R. D. Extensive remyelination of the CNS leads to functional recovery. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (16), 6832-6836 (2009).
