Abstract
La sclérose en plaques est une maladie inflammatoire démyélinisante du système nerveux central caractérisé par la formation de plaques contenant des oligodendrocytes décédées myéline, les axones et les neurones. Remyélinisation est un mécanisme de réparation endogène lequel nouvelle myéline est produite à la suite de la prolifération, le recrutement et la différenciation des cellules précurseurs d'oligodendrocytes en oligodendrocytes de la myéline, et est nécessaire pour protéger les axones d'autres dommages. Actuellement, tous les produits thérapeutiques pour le traitement de la sclérose en plaques ciblent la composante immunitaire aberrante de la maladie, ce qui réduit les rechutes inflammatoires mais ne empêche pas la progression du déclin neurologique irréversible. Il est donc impératif que les stratégies de promotion de remyélinisation-être élaborés qui peuvent retarder la progression de la maladie et peut-être inverser des symptômes neurologiques. Plusieurs modèles animaux de démyélinisation existent, y compris l'encéphalomyélite auto-immune expérimentale et curprizone; toutefois, il existe limitations à leur utilisation pour l'étude de la remyélinisation. Une approche plus robuste est la focale de l'injection des toxines dans le système nerveux central, y compris la lysolécithine de détergent dans la moelle épinière de la substance blanche rongeurs. Dans ce protocole, nous démontrons que la procédure chirurgicale à se injecter de la lysolécithine dans la substance blanche ventrale de souris est rapide, rentable, et ne nécessite aucun matériel supplémentaire que ceux disponibles dans le commerce. Cette procédure est importante non seulement pour l'étude des événements normaux impliqués dans le processus de remyélinisation, mais également comme un outil de pré-clinique pour le criblage de candidats thérapeutiques favorisant la remyélinisation.
Introduction
La sclérose en plaques (SEP) est une maladie démyélinisante chronique du système nerveux central (SNC) et caractérisée par une infiltration plaques contenant perdus myéline, les oligodendrocytes, les axones des neurones et cellules immunitaires. La plupart des patients ont une évolution de la maladie comprenant des poussées inflammatoires accompagnés d'un large éventail de symptômes neurologiques, suivies de périodes de rémission. Plus de la moitié de ces patients finissent par passer à un stade secondaire progressive sans poussées apparentes mais baisse neurologique continue. On croit que cette détérioration progressive est due à la détérioration axonale et la perte, a contribué en partie par une démyélinisation chronique. Les stratégies visant à restaurer la perte de myéline sont donc considérées comme une approche de traitement prometteuse pour retarder la progression de la maladie et peut-être inverser des symptômes neurologiques.
Remyélinisation est une réponse de réparation endogène dans le système nerveux central par lequel de nouvelles gaines de myéline sont générés à partir de cellules précurseurs d'oligodendrocytes recrutés(OPC) pour différencier en oligodendrocytes de la myéline. Remyélinisation a été montré dans des modèles animaux pour être très robuste 1-3, cependant, son efficacité diminue avec l'âge de 4 ans. En effet, la remyélinisation chez les humains se produit même si elle est incomplète dans la plupart des 5 patients atteints de SEP. Tous les médicaments actuellement disponibles pour MS ciblent principalement la composante immunitaire aberrante de la maladie et, tout en étant efficace à réduire les rechutes, ne tardez pas nettement la progression de la maladie. La prochaine génération de stratégies thérapeutiques pour la gestion des MS se intégrer les progrès dans l'immunomodulation à l'amélioration de la remyélinisation endogène afin d'éviter les deux rechutes et la progression six.
Un procédé pour étudier la remyélinisation ment et dans le système nerveux central implique l'injection directe de la lysophosphatidylcholine de détergent (de lysolécithine) dans la substance blanche de la moelle épinière 1,3,7. Cette procédure produit un demyelinat bien caractérisésing blessures consistant principalement en macrophages / infiltration et l'activation de la microglie 8,9, astrogliose réactive, la perturbation de l'homéostasie axonale / lésions axonales et OPC prolifération et la migration 10. La lésion évolue prévisible au cours de la période de quelques semaines et est finalement capable de pleinement remyélinisation. Cette méthode a été particulièrement utile pour étudier la chorégraphie des événements impliqués dans dé- et la remyélinisation. En outre, il a été adopté comme un outil de test pré-clinique de thérapies candidats à accélérer réparation suite à une insulte démyélinisante.
Protocol
REMARQUE: Les animaux utilisés dans cette procédure ont été traités conformément avec le Conseil canadien de protection des animaux (CCPA) Lignes directrices. Éthique ont été approuvés par le Comité de l'Université de Calgary le soin des animaux.
1. Préparez la seringue pour injection
- Dissoudre la lysolécithine à une solution à 1% dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS; pH 7,4) et conserver à -20 ° C en petites aliquotes (75 ul). Décongelez un flacon à température ambiante.
REMARQUE: si lysolécithine est non dissous, soniquer le tube dans un nettoyeur à ultrasons (40 kHz) pendant environ 30 minutes pour former une solution uniforme. - Manipulez le capillaire en verre pré-tiré avec un soin extrême pour éviter d'endommager la pointe délicate. Dévisser l'écrou d'une seringue injection de 10 pi et le visser sur l'extrémité plate du capillaire suivie par deux embouts, veiller à ce que les extrémités d'accouplement des viroles alignent et le capillaire est bien au chaud dans la virole conique (Figure 1). Rincer la seringue avec isopropalcool yl et retirer le piston. Une fois sec, visser la main d'assemblage de l'aiguille serré sur la seringue d'injection.
- Fixer l'aiguille de moyeu métallique à la seringue d'amorçage. Pierce un disque de caoutchouc avec l'aiguille et faites-le glisser à la base. Remplir la seringue d'amorçage avec lysolécithine. Enfoncer doucement la seringue d'amorçage jusqu'à ce liquide est visible à la pointe de l'aiguille. Ceci garantit des bulles d'air ne seront pas introduites dans la seringue d'injection.
- Insérer l'aiguille de moyeu métallique de la seringue d'amorçage dans la seringue d'injection. Faire un joint ferme avec le disque de caoutchouc, appuyez doucement sur la seringue d'amorçage jusqu'à ce que le capillaire remplit à la pointe avec une solution. Retirez délicatement la seringue d'amorçage tout en appuyant simultanément pour remplir le corps de la seringue injecter sans introduire de bulles d'air. Insérer le piston dans la seringue d'injection et d'assurer solution se écoule à partir de la pointe du capillaire lorsque le plongeur est enfoncé doucement.
NOTE: Si des bulles d'air sont visibles dans le bouchonIllary injection ou seringue, la préparation de la seringue doit être répété depuis le début. Liquide continu dans le dispositif d'injection est critique pour garantir les volumes d'injection précises. - Fixer la seringue injecter rempli au bras d'un micromanipulateur stéréotaxique. Cet appareil rempli sera en mesure d'injecter 15 à 20 animaux avant de devoir être rechargée.
- Jeter la lysolécithine restant de la seringue d'amorçage. Retirer et appuyer sur l'alcool isopropylique à plusieurs reprises, et de détacher l'aiguille de moyeu métallique. Attendre plusieurs heures pour l'alcool isopropylique restant dans la seringue d'amorçage se évaporer avant de le remplir à nouveau.
2. Préparer des animaux pour les interventions chirurgicales
NOTE: Cette procédure est décrite pour les femmes souris C57BL / 6, âgés de 8 à 10 semaines.
- Anesthésier l'animal avec une injection intrapéritonéale de kétamine (200 mg / kg) et de xylazine (10 mg / kg) ou par les règlements de protection des animaux. Plan pour laanimal soit sous anesthésie pendant environ 1 h si vous utilisez l'anesthésie injectable.
- Test que l'animal est anesthésié profondément en pinçant fermement le pied. Un animal anesthésié ne répondra pas à la pincée.
- L'aide de tondeuses, de se raser un cm 2 2-3 sur le côté dorsale de l'animal, près des oreilles. Veillez à ne pas endommager les oreilles.
- Essuyez la zone propre avec 70% d'éthanol appliqué à un tampon de gaze. Assurez-vous que tous les cheveux coupés a été retiré de la zone. Désinfecter la zone avec de l'iode.
- Appliquez de la vaseline pour les yeux pour éviter le dessèchement pendant toute la procédure.
- Gardez l'animal dans une chambre de récupération chauffé jusqu'à ce que prêt à commencer la procédure.
3. Effectuer la procédure chirurgicale
REMARQUE: Veiller à une technique aseptique appropriée pour toutes les étapes de la procédure. Cela comprend l'utilisation appropriée de gants, filets à cheveux, des masques et des stores. Tous les outils doivent être stérilisés avant d'entrer en contact avec l'animal.
- Déplacez l'animal à un cadre stéréotaxique, face dorsale haut, élevé à la section du milieu par des serviettes en papier pliées à exagérer la courbure de la colonne vertébrale. Fixer les bras et la queue avec du ruban adhésif chirurgical et fixer la tête avec un collier de dent. La stabilisation des barres d'oreilles ne sont pas nécessaires pour cette procédure.
- Utiliser un scalpel pour faire une incision médiane de 3 cm, en commençant juste en dessous des oreilles et de coupe dans la direction caudale.
- Localisez le fossé entre les deux grandes structures adipeuses et utiliser des pinces fines dans chaque main pour tirer les différencier. Étaler écarteurs pour ouvrir le champ opératoire.
- Sous un microscope chirurgical, localiser le processus de prolongement important de la vertèbre T2 (Remarque: cette fonction est caractéristique de la souche de souris C57BL / 6). Effectuer un dissection avec des ciseaux à ressort fermé à travers la musculature superposition de mieux visualiser T2. En utilisant les forceps, ressentir pour les surfaces dures de T3 et T4 pour confirmer la localisation anatomique correcte.
- Avec des ciseaux de printemps, faire des coupes latérales peu profondes (2-3 mm de profondeur) du tissu conjonctif entre T3 et T4. En raison de l'espacement entre les vertèbres naturel dans la partie thoracique supérieure de la colonne vertébrale de la souris, une laminectomie ne est pas nécessaire pour révéler la moelle épinière. Soyez conscient qu'une réduction trop profonde va percer et d'endommager le cordon.
REMARQUE: Un petit degré de saignement est commun lors de cette étape. Si cela se produit, maintenez une lance d'éponge dans la région jusqu'à ce que les subventions de la coagulation (30-60 sec). - Visualisez la moelle épinière. Il sera recouvert d'une épaisse couche de Dura visible si cette couche méningée ne était pas encore coupé tout en exposant le cordon. Un vaisseau sanguin important exécute caudal / rostrale à travers la ligne médiane approximative de la moelle épinière.
NOTE: Ce vasculaire ne doit pas être utilisé comme un point de repère pour la ligne médiane. Au lieu de cela, un éclairage adéquat devrait révéler les limites de la matière grise-blanche flanquant la colonne dorsale, et ceux-ci doit être utilisée pour estimer la ligne médiane. - Si la durereste intacte, assurez-éraflures latérales douces avec une aiguille 32 G de métal jusqu'à ce qu'elle soit effacée. Le but est d'enlever la dure-mère tout en ne coupant pas les méninges sous-jacents restants, qui ne sont pas aussi épais et difficiles à voir.
REMARQUE: Sortie de liquide céphalo-rachidien indique une violation de l'arachnoïde et tout cela peut se faire sans dommages mécaniques au tissu, le liquide céphalo-rachidien accumulée doit être retiré avec une lance éponge pour mieux visualiser la surface de la corde. - Déplacez la seringue injection en place et abaissez lentement jusqu'à ce que la pointe du capillaire touche à peine la moelle épinière immédiatement latérale de chaque côté de la ligne médiane. Verrouiller le bras en place.
- Utilisez les mesures graduées de bras stéréotaxique direction Z pour effectuer une mesure de position de référence. De cette lecture, il faut soustraire 1,3 mm. Utilisez un mouvement à la baisse rapide et peu profonde pour percer le tissu, puis abaissez délicatement le capillaire jusqu'à ce que la nouvelle mesure est atteint. Facultatif: si vous le souhaitez,lésions de la colonne dorsale peuvent être produites par le même mouvement de perçage sur la ligne médiane et une profondeur de 0,3 mm (voir la discussion pour plus d'informations).
NOTE: Ces valeurs sont spécifiques pour injecter entre T3 et T4. Si optant pour effectuer l'injection à tout autre endroit dans la moelle épinière, ces valeurs doivent être tirées de ne importe quel atlas du cerveau de la souris disponibles. - Utiliser le micromanipulateur pour enfoncer la lysolécithine dans la substance blanche de la moelle épinière ventrale. Faire une rotation du micromanipulateur toutes les 5 secondes pendant 2 minutes, ce qui entraîne un volume final de 0,5 ul. Laissez le capillaire en place pour 2 min supplémentaires pour empêcher le retour de la solution, puis retirez délicatement le capillaire.
- Attachez un seul fil de suture dans le tissu musculaire / adipeux recouvrant la colonne vertébrale. Utilisez un fil de suture non-interrompue pour fermer la peau. Appliquer plus d'iode au site d'incision.
- Placer l'animal dans une chambre de récupération chauffée jusqu'à ce qu'elle se redresse, puis le ramener dans sa cage. Appliquer analgésiques post-fonctionnellement, conformément aux règlements de protection des animaux. Soins post-opératoires supplémentaires est généralement pas nécessaire puisque les animaux sont entièrement ambulatoire et capable d'auto-alimentation et de boire dès qu'ils récupération de l'anesthésie.
- Répétez la procédure pour les animaux restants.
NOTE: Avec la compétence, l'opération peut être achevée en 10-15 minutes par animal, en particulier avec l'aide d'une deuxième personne attachant sutures. La même capillaire en verre peut être utilisé pendant environ 15-20 chirurgies avant la pointe est émoussée et doit être remplacée. chirurgies de contrôle peuvent être effectuées de façon identique comme il est décrit, par une injection de PBS dans la moelle épinière au lieu de la lysolécithine. Nous ne recommandons pas le nettoyage des capillaires pour une utilisation future.
4. Traitement et analyse de tissus
- Sacrifice des animaux avec une surdose intraperitoneale de kétamine (500 mg / kg) et de xylazine (25 mg / kg) à des moments souhaités. Les lésions évoluent généralement dans le Follde façon raison: 1-3 jours, démyélinisation active; 3-7 jours, le recrutement OPC; 7-10 jours, la différenciation des oligodendrocytes; 10-21 jours, la remyélinisation actif 2,10,11.
- Pour préparer les tissus pour l'histologie, effectuez d'abord une perfusion transcardial 12 avec 20 ml RT PBS suivis par 20 ml glacée 4% de paraformaldehyde dans PBS. Pour la préparation de la résine tissu enrobé pour la coupe semi ou ultra-mince, voir l'étape 4.9.
- Retirer la moelle épinière en utilisant des ciseaux courbes d'os pour couper à travers chaque vertèbre à partir de l'extrémité cervicale de la colonne vertébrale et en descendant jusqu'au niveau inférieur thoracique. Fixer les moelles épinières O / N à 4% de paraformaldehyde dans du PBS à 4 ° C. Mettez les cordons à 30% de saccharose dans du PBS à 4 ° C pendant au moins 72 heures.
- Identifier le site d'injection comme une anomalie sur la surface dorsale de la moelle épinière. Coupez un morceau de tissu (avec le site d'injection dans le centre) de 3 mm et d'aligner les morceaux dans cryomoules contenant la température de coupe optimale (OCT) compound. Suspendre la face inférieure des cryomoules dans un mélange refroidi de 2-méthylbutane et de la glace sèche jusqu'à l'OPO est complètement gelé. Stocker à -80 ° C jusqu'au moment de section.
- Section les cordons de la colonne vertébrale sur un cryostat à une largeur de 20 um sur des lames de microscope et laisser sécher à l'air O / N avant de stocker les diapositives à -20 ° C.
- Détecter l'emplacement de la lésion et la taille en utilisant un ériochrome cyanine colorant histologique de la myéline 13. Effectuez toutes les étapes à la température ambiante. diapositives de l'air libre pendant 30 min. Placer les lames dans agent pour 1 min suivis de réhydratation dans les solutions d'éthanol graduées (100%, 95%, 90%, 70%, 50%, de l'eau) de compensation pour chaque 1 min.
- Placer les lames dans une solution d'ériochrome cyanine pendant 15 min, suivi d'un lavage de 1 minute avec de l'eau. Différencier dans 0,5% d'hydroxyde d'ammonium pendant 10 s, suivi par un lavage de 1 minute avec de l'eau. Déshydrater dans les solutions d'éthanol graduées (ordre inverse comme décrit ci-dessus) pendant 1 min chacun, lamelle avec les médias de montage, et l'image sur un km champ claircroscope.
- Utilisez immunohistochimie de visualiser axones et la myéline. diapositives de l'air libre pendant 30 min. Déshydrater l'éthanol gradué (eau, 50%, 70%, 90%, 95%, 100%) pendant 2 min chacun à température ambiante, puis d'inverser l'ordre de retour à l'eau. Cette étape se traduit par une plus grande résolution d'anneaux individuels 14 de la myéline.
- Bloquer des interactions anticorps non spécifiques en utilisant 10% de sérum de chèvre et 0,25% de Triton X-100 dans du PBS pendant 60 min à température ambiante. Diluer anticorps primaire (anti-souris SMI312 1: 2000, de lapin anti-MBP 1: 1000) dans du PBS et laisser incuber sur des lames O / N à 4 ° C.
- Laver 5 fois pendant 5 min avec du PBS à température ambiante. Diluer anticorps secondaire (Alexa 488 anti-lapin 1: 500, Alexa 546 anti-souris 1: 500) dans du PBS et laisser incuber sur des lames pendant 60 min à température ambiante. Laver 5 fois pendant 5 min avec du PBS à température ambiante. Mont coulisse avec des lamelles à l'aide de Gelvatol et image sur un microscope fluorescent.
- Utilisation immunohistochimie pour visualiser les cellules de la lignée des oligodendrocytes. Suivez la procédure de step 4,7, en omettant l'étape de déshydratation / réhydratation, et en utilisant 10% de sérum de cheval au lieu de sérum de chèvre. Utilisez les dilutions d'anticorps primaires suivants: chèvre anti-PDGFRa 1: 100, de souris anti-CC1 1: 200, de lapin anti-Olig2 1: 200. Utilisez les dilutions d'anticorps secondaires suivants: Alexa 488 anti-chèvre 1: 500, Alexa 594 anti-souris 1: 500, Alexa 647 anti-lapin 1: 500.
- Pour préparer le tissu pour la coupe semi ou ultra-mince, effectuez d'abord une perfusion transcardial 12 avec 20 ml RT PBS suivi par 20 ml de glace-paraformaldéhyde 4% froid / 1% de glutaraldéhyde dans du PBS. Retirer la moelle épinière comme décrit dans l'étape 4.3. Fixer O / N dans du paraformaldéhyde 4% / 1% de glutaraldéhyde dans du PBS à 4 ° C.
- Identifier le site d'injection comme décrit dans l'étape 4.4. Couper un morceau de tissu contenant le site d'injection de 1 mm. D'autres blocs de 1 mm de part et d'autre de la lésion peuvent être préparés si on le souhaite ainsi.
- Dans une hotte, ajouter 10 fois le volume 1% de tétroxyde d'osmium / 1,5% ferrocyanure de potassium pour chaque bloc sur la glacependant 60 min.
NOTE: tétroxyde d'osmium est une substance très toxique et doit être manipulé avec un soin extrême. Tous les matériaux en contact avec le tétroxyde d'osmium doivent être placés dans l'huile de maïs (deux fois de volume comme solution de tétroxyde d'osmium) pour la neutralisation. - Laver cordons 3 fois avec 0,2 M de cacodylate pendant 10 min à température ambiante, rejets dans l'huile de maïs. Déshydrater avec des solutions d'éthanol graduées (eau, 50%, 70%, 90%, deux fois avec 95%, deux fois avec 100%, deux fois avec de l'oxyde de propylene) pendant 10 minutes à TA.
- Cordons Intégrer en résine selon les instructions du fabricant.
- Couper blocs sur une ultramicrotome et monter les coupes SUR DES gouttelettes d'eau sur des lames de microscope. Placer les lames sur une plaque chaude (environ 50 ° C) jusqu'à ce que sec.
- Visualisez la myéline en ajoutant quelques gouttes de 1% bleu de toluidine solution de borax / 2% sur les lames pour les 10-15 sec à 50 ° C. Rincer à l'eau, sèche et lamelle avec les médias de montage. sections de l'image sur un microscope à champ clair.
Representative Results
Injection focale de lysolécithine dans la substance blanche ventrale produit une lésion démyélinisante discret qui est détectable sur une distance d'environ 3 mm (figure 2). La coloration immunohistochimique du noyau de la lésion pour la myéline (MBP) et les axones (SMI312) montre axones qui ont été dépouillés de la myéline à 7 jours (figure 3). En 14 jours, de nombreux axones sont entourés par des anneaux MBP-positifs, ce qui suggère l'apparition de la remyélinisation. La coloration de cellules de la lignée des oligodendrocytes (PDGFRa, Olig2, CC1), on observe une augmentation significative à la fois le nombre total de cellules à 14 jours par rapport à sept jours, ainsi que la répartition des oligodendrocytes matures par rapport aux OPC (Figure 4) . Conformément à cette conclusion, sections semithin colorées au bleu de toluidine révèlent la présence de minces gaines de myéline à 14 jours qui sont rarement détectées à 7 jours (figure 5), indiquant que ceux-ci sont remyelinated internodes.
La procédure est très reproductible entre les animaux. Variation se produit lorsque la respiration lourde modifie la position stationnaire du capillaire ce ne est généralement pas un problème avec une sédation adéquate. Les dommages aux axones semble minime, sauf dans le centre de la lésion, qui a été décrit depuis la première utilisation du modèle 1. Nous pensons que ce est une lésion mécanique du capillaire de verre, comme il est aussi observable dans PBS contrôles injecté. Néanmoins, la variabilité tend à être petite, et nous et d'autres en utilisant une procédure similaire ont détecté des différences entre les conditions expérimentales avec aussi peu que quatre animaux par groupe 15.
Figure 1. Assemblée de la seringue d'injection. (A) L'écrou de la seringue d'injection est enfilé sur t il extrémité plate du tube capillaire en verre, suivi du 2 embouts de telle sorte que leurs extrémités d'accouplement de verrouillage. Une fois que le capillaire est fermement serré dans la virole conique, l'ensemble est vissé serré à la main sur l'extrémité de la seringue d'injection. (B) pièce au centre d'un disque de caoutchouc avec l'aiguille de moyeu métallique fixée à la seringue d'amorçage et faites-le glisser vers le bas pour la base. (c) retirent la lysolécithine solution dans la seringue d'amorçage. (D) enfoncer doucement la seringue d'amorçage jusqu'à ce que la première goutte de lysolécithine est visible à la pointe de l'aiguille. (E) Insérez la seringue d'amorçage dans le canon de l'injection Seringue, faisant un joint ferme avec le disque de caoutchouc. Enfoncer doucement la solution jusqu'à ce qu'il tourne à l'extrémité du capillaire. Retirer délicatement la seringue d'amorçage tout en maintenant la pression sur le piston pour retirer l'aiguille de moyeu métallique sans introduire de bulles d'air dans la seringue d'injection.télécharger / 52679 / 52679fig1large.jpg "target =" _ blank "> Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Représentant lysolécithine lésion colorée avec ériochrome cyanine. Sections de série (espacées de 400 um d'intervalle) d'une lésion de la lysolécithine caractéristique à 14 jours colorées avec ériochrome cyanine de visualiser la myéline (bleu). Notez que la démyélinisation est limitée à la substance blanche ventrale et que la lésion se étend sur environ 3 mm dans la rostrale / direction caudale. Barre d'échelle = 1 mm. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Les axones et la myéline dansle modèle de la lysolécithine. (A) une imposture (PBS) injecté de la moelle épinière à 7 jours montre axones sains qui sont entourés par des anneaux de la myéline. (B) Un lysolécithine lésion à 7 jours montre axones dénudé ainsi que la myéline dégradé. (C) A 14 jours, un proportion des axones (exemples notés avec des pointes de flèches blanches) sont associés à la réapparition des anneaux de la myéline. La barre d'échelle = 10 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Les cellules de la lignée oligodendrocytes dans le modèle de la lysolécithine. (A, C) A sept jours, il ya une plus grande représentation des PDGFRa + OPC (barres blanches) par rapport à CC1 + oligodendrocytes (barres magenta); les chiffres dans les barres représentent les pourcentages. Olig2 a été sondé àconfirmer coloration des cellules de la lignée des oligodendrocytes. (B, C) À 14 jours, il ya une augmentation significative dans le nombre total de cellules de la lignée des oligodendrocytes par rapport à sept jours (p <0,05, test t bilatéral, n = 4 par groupe ). Il existe également une augmentation significative dans la distribution des oligodendrocytes à OPC à 14 jours, comparativement à 7 jours (p <0,0001, test exact de Fisher). La barre d'échelle = 10 um. Chaque champ est capturé à un grossissement original de 60X. Les valeurs sont la moyenne ± SD. * Signifie p <0,05. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. remyélinisation dans le modèle de la lysolécithine. (A) Un bleu de toluidine en coupe transversale teinté semithin section de la substance blanche dans un ventrale healthy souris montre axones sur une large gamme de calibre avec une épaisseur de myéline respective. (B) À sept jours, un manque de gaines de myéline est observée adjacente à une zone affectée (en bas à droite). (C) A 14 jours, gaines finement myélinisées ( exemples notés avec flèches rouges) apparaissent tout au long de la lésion, indicative de segments remyelinated. La barre d'échelle = 10 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Discussion
Un certain nombre de modèles animaux ont été développés pour étudier MS, la plus reconnue du modèle encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE). Dans l'EAE, les rongeurs sont immunisés contre un fragment d'un peptide de myéline et subissent un développement de la lésion inflammatoire manifeste dans paralysie ascendante. Bien que ce modèle a été utile pour les essais pré-clinique de médicaments immunomodulateurs MS, il ne est pas idéal pour étudier la remyélinisation pour trois raisons principales: d'abord, la localisation des lésions inflammatoires est quelque peu aléatoire, et la localisation des lésions lors du traitement des tissus pour les semi ou ultra-mince sections peuvent être difficiles. La seconde est que la remyélinisation se produit sur un parcours de temps spécifique, et l'âge exact d'une lésion unique EAE ne peut être connue sans l'imagerie par résonance magnétique continue non invasive. La troisième est que la remyélinisation est un phénomène naturel chez les rongeurs, et la preuve de la remyélinisation après le traitement de la drogue dans l'EAE peut pas être le résultat primaire du médicament, mais dansStead un phénomène secondaire de réduire l'inflammation.
Une autre méthode courante de produire démyélinisation est obtenue en introduisant le cuivre chélateur cuprizone dans le régime alimentaire. Il en résulte une démyélinisation répandue, notamment dans le corps calleux. Il ya des limites dans l'étude du corps calleux comme un site de remyélinisation pour les raisons suivantes: Tout d'abord, les diamètres des axones (et donc l'épaisseur de la myéline) sont plus petits que les autres régions du système nerveux central, et gaines ainsi finement remyelinated peuvent être distingués de ceux qui ne ont jamais démyélinisée. Deuxièmement, parce que le corps calleux de la souris contient> 70% axones amyéliniques 16, il peut être difficile de savoir si un segment remyelinated est vrai réparation de la myéline endommagée ou la synthèse de novo de la myéline chez l'adulte, qui se produit normalement 17.
Il est de notre conviction que le meilleur modèle pour étudier la remyélinisation est l'injection directe de toxines, soit lysolécithine, ethidbromure ium, ou autres, dans les pédoncules cérébraux caudales 18 ou la moelle épinière de la substance blanche. L'ancien emplacement ne est atteint que par injection précise stéréotaxique 3 dimensions, et se limite à des rongeurs (rats grandes) en raison de la petite taille des pédoncules cérébelleux. Cela exclut la ressource étendue de souris transgéniques dans l'étude et la remyélinisation ment. La moelle épinière, cependant, contient beaucoup de grandes étendues de la substance blanche qui sont facilement accessibles chirurgicalement. Les espaces entre les vertèbres dans le segment thoracique rostrale permet pour l'exposition de la moelle épinière, sans la nécessité d'une laminectomie, qui est une étape nécessaire dans les procédures chirurgicales thoraciques caudales. Un avantage de cibler spécifiquement la substance blanche ventrale est que les axones sont uniformément plus grande que la substance blanche dorsale, ce qui rend la quantification de la remyélinisation une tâche-similaire aux défis associés à corps calleux moins ambigu. En outre, la substance blanche ventrale représente un nombre beaucoup plus tArget zone d'injecter; plusieurs centaines de microns latéralement dans la région dorsale du capillaire se placer à l'extérieur de la colonne, tandis que le même type ventralement serait toujours produire une lésion démyélinisante important. Certains protocoles injecter à la fois dans la lysolécithine dorsal et ventral colonnes du même animal 19. Cela peut augmenter à la fois la probabilité de placement capillaire appropriée et le nombre de lésions mesurables au moins d'animaux. Bien que les données actuelles présentées sont de 8 à 10 semaines vieux animaux au moment de l'opération, nous avons aussi eu du succès en utilisant la même procédure sur 8-10 mois vieilles souris, où la remyélinisation est décrit comme étant nettement plus lent 4.
Quantification de la remyélinisation ne est pas une mince tâche. Un dogme central postule que remyelinated segments sont plus courts et plus minces, en moyenne, que leurs homologues en bonne santé, et donc les calculs g-rapport (diamètre de l'axone, divisé par le diamètre de l'axone + myéline) de section transversale semi-or sections ultraminces sont devenus procédure standard. Toutefois, il est connu que les segments remyelinated épaississent au fil du temps 2 et une étude récente utilisant un journaliste transgénique des oligodendrocytes remyélinisantes suggère que de nombreux nœuds finissent par devenir indiscernables de commande 20. Quantifier le nombre de oligodendrocytes matures dans la lésion est une façon indirecte de mesurer la réparation, que les oligodendrocytes sont capables de faire un grand nombre de nœuds, et une proportion importante de la remyélinisation-en fonction du modèle utilisé, peut se produire à partir de cellules de Schwann 3. Bien entendu, comme la remyélinisation a été liée à la restauration de conduction saltatoire 21, la métrique finale de réparation correspondant à la récupération fonctionnelle des déficits neurologiques. Alors que la remyélinisation a été liée à la récupération de la fonction de certaines espèces 22,23, il ne est pas devenue une procédure standard dans les études de lysolécithine murins. Cela est probablement dû à un manque d'observ manifestedéficits capables de lésions soit dorsales ou ventrales, par rapport aux modèles de démyélinisation plus robustes tels que l'EAE et même cuprizone. Nous croyons que les déficits fonctionnels résultant de lysolécithine injection, et la récupération ultérieure avec la remyélinisation, ne seront observables en utilisant des tests sensibles de fines fonctionnement sensori-moteur.
Une recherche PubMed de «remyélinisation" aux côtés de l'un des modèles animaux énumérés ci-dessus, mais une approche méthodologique brusque, montre moins les résultats de recherche pour lysolécithine (109) par rapport à l'EAE (188) et cuprizone (197). Si notre argument selon lequel lysolécithine démyélinisation est la meilleure approche pour étudier la remyélinisation, pourquoi est-il discuté de la moins? Peut-être une crainte pour l'utilisation de cette méthode découle d'une conviction de difficulté technique dans l'exécution de l'opération chirurgicale. En réalité, cette procédure est rapide, rentable, et ne est plus difficile que la dissection des tissus de routine, exigeant des matériaux qui sont tous commerciellement disponible. Ce est notre espoir que ce protocole se avère utile pour ceux qui souhaitent ajouter ce modèle puissant à leur répertoire pour étudier le domaine passionnant et l'expansion de réparation de la myéline.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| spring scissors | Fine Science Tools | 15004-08 | |
| forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| retractor | Fine Science Tools | 17003-03 | |
| clippers | Philips | QG3330 | |
| heating recovery chamber | Peco Services | V1200 | |
| surgical tape | 3M | 1527-1 | |
| scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| scalpel blade | Feather | No. 15 | |
| sponge spear | Beaver Visitec | 581089 | |
| 5-0 Vicryl sutures | Ethicon | J511G | |
| curved ToughCut spring scissors | Fine Science Tools | 15123-12 | |
| 32 G metal needle | BD | 305106 | |
| needle holders | Fine Science Tools | 12002-14 | |
| angled forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| cotton tipped applicator | Puritan | 806-WC | |
| gauze pads | Safe Cross First Aid | 3763 | |
| 10 μl syringe | Hamilton | 7635-01 | make sure to purchase the microliter, not gastight syringe |
| compression fitting | Hamilton | 55750-01 | contains the 2 ferrules and removable nut, but the nut that comes with the 10 μl syringe is a tighter fit |
| priming kit | Hamilton | PRMKIT | contains the priming syringe, removable hub needle and the rubber discs |
| pre-pulled glass capillaries | WPI | TIP10TW1 (pack of 10) | contains capillaries with 10 μm inner diameter. 30 μm inner diameter also work (TIP30TW1) |
| stereotactic frame | David Kopf instruments | Model 900 | |
| Ultrasonic cleaner | Fisher Scientific | FS-20 | |
| Tissue-Tek optimal cutting temperature (OCT) compound | VWR | 25608-930 | |
| Tissue-Tek intermediate cryomold | VWR | 25608-924 | |
| cryostat | Leica | CM1900 | |
| microscope slides | VWR | 48311-703 | |
| bright field microscope | Olympus | BX51 | |
| ultramicrotome | Leica EM UC7 | EM UC7 | |
| Lysophosphatidylchoine | Sigma | L1381 | |
| 2-methylbutane | Sigma | M32631 | |
| Triton x-100 | Sigma | X-100 | |
| goat serum | Sigma | G9023 | |
| Mouse anti-SMI312 antibody | Covance | SMI-312R | 1:2,000 dilution |
| Rabbit anti-MBP antibody | Abcam | AB40390 | 1:1000 dilution |
| Goat anti-PDGFRα antibody | R&D Systems | AF1062 | 1:100 dilution |
| Rabbit anti-Olig2 antibody | Millipore | AB9610 | 1:200 dilution |
| Mouse anti-CC1 antibody | Calbiochem | OP80 | 1:200 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Life technologies | A-11008 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG | Life technologies | A-11003 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG | Jackson Immuno | 705-546-147 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse IgG | Jackson Immuno | 715-586-151 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG | Jackson Immuno | 711-606-152 | 1:500 dilution |
| PBS | Oxoid | BR0014 | |
| isopropyl alcohol | Sigma | 109827 | |
| ketamine | CDMV | ||
| xylazine | CDMV | ||
| iodine | West Penetone | 2021 | |
| Vaseline petroleum jelly | VWR | CA05971 | |
| paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| sucrose | Sigma | S5016 | |
| Eriochrome Cyanine R | Sigma | 32752 | |
| sulfuric acid | Sigma | 320501 | |
| iron(III) chloride | Sigma | 157740 | |
| ammonium hydroxide | Sigma | 320145 | |
| Acrytol | Leica Biosystems | 3801700 | |
| Citrisolv | Fisher Scientific | 22-143-975 | |
| horse serum | Sigma | H0146 | |
| glutaraldehyde | Electron Micrscopy Sciences | 16220 | |
| osmum tetroxide | Electron Micrscopy Sciences | 19150 | highly toxic |
| potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate | Sigma | P3289 | |
| corn oil | Sigma | C8267 | |
| polyvinyl alcohol | Sigma | P8136 | |
| glycerol | Sigma | G9012 | |
| cacodylic acid | Electron Micrscopy Sciences | 12300 | |
| propylene oxide | Electron Micrscopy Sciences | 20401 | |
| EMBED kit | Electron Micrscopy Sciences | 14120 | |
| Toluidine Blue O | Sigma | T3260 | |
| Sodium tetraborate decahydrate | Sigma | S9640 | |
| Recipes | |||
| Eriochrome cyanine solution | |||
| Ingredient | Amount to add | ||
| Eriochrome Cyanine R | 0.8 g | ||
| sulfuric acid | 400 ml 0.5% | ||
| iron(III)chloride | 20 ml 10% | ||
| water | 80 ml | ||
| *add eriochrome cyanine to sulfuric acid, followed by iron(III) chloride and water. Solution can be kept after use. Make fresh once per year. | |||
| Gelvatol | |||
| Ingredient | Amount to add | ||
| PBS | 140 mL | ||
| polyvinyl alcohol | 20 g | ||
| glycerol | 40 g | ||
| *mix well, place at 37 °C O/N, centrifuge at 1,960 x g 30 min, aliquot into 40 tubes |
References
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