Summary

マウス腸神経系の開発を可視化するために免疫染色

Published: April 29, 2015
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Summary

The enteric nervous system is formed by neural crest cells that proliferate, migrate and colonize the gut. Neural crest cells differentiate into neurons with markers specific for their neurotransmitter phenotype. This protocol describes a technique for dissecting, fixing and immunostaining of the murine embryonic gastrointestinal tract to visualize enteric nervous system neurotransmitter expression.

Abstract

The enteric nervous system is formed by neural crest cells that proliferate, migrate and colonize the gut. Following colonization, neural crest cells must then differentiate into neurons with markers specific for their neurotransmitter phenotype. Cholinergic neurons, a major neurotransmitter phenotype in the enteric nervous system, are identified by staining for choline acetyltransferase (ChAT), the synthesizing enzyme for acetylcholine. Historical efforts to visualize cholinergic neurons have been hampered by antibodies with differing specificities to central nervous system versus peripheral nervous system ChAT. We and others have overcome this limitation by using an antibody against placental ChAT, which recognizes both central and peripheral ChAT, to successfully visualize embryonic enteric cholinergic neurons. Additionally, we have compared this antibody to genetic reporters for ChAT and shown that the antibody is more reliable during embryogenesis. This protocol describes a technique for dissecting, fixing and immunostaining of the murine embryonic gastrointestinal tract to visualize enteric nervous system neurotransmitter expression.

Introduction

運動、栄養吸収、およびローカルの血流を制御する機能腸管神経系(ENS)は、生命1に不可欠です。 ENSは、それらはニューロンおよびグリア細胞を含む神経節に分化腸を移動し、コロニー形成、増殖、神経堤細胞(NCC)によって形成されます。ヒルシュスプルング病(HSCR、男性でのオンラインメンデル遺伝)、1 4,000で出生の発生率とmultigeneic先天性障害は、破壊されたENSの形成を研究するためのプロトタイプの病気と考えることができます。 HSCRでは、NCCはに移動し、遠位後腸2の変数の長さを植民地化することができません。また、他の一般的な胃腸(GI)は、肛門直腸奇形、腸atresias、および運動障害などの小児集団における発達障害は、基本的なENS機能の障害と関連しており、おそらく微妙な、過小評価、解剖学的変化とで機能的変化と関連していますENS 3-6。そのため、私たちはENS形成の発達決定要因を理解することを可能にする技術は、病因および小児消化管障害の治療の可能性に光を当てることができます。

移行と植民地化の後、NCCは、それらの神経伝達物質の表現型に特異的なマーカーでニューロンに分化します。コリン作動性ニューロンは、腸溶性ニューロン7の約60%を含み、かつコリンアセチルトランスフェラーゼ(チャット)、興奮性神経伝達物質アセチルコリンのための合成酵素を染色することによって検出することができます。歴史的には、コリン作動性ニューロンを可視化する試みは、中枢神経系に対して向けられた抗体の抗原特異性(CNS)は、末梢神経系(PNS)のChAT 8-10に対してチャット異なるによって混乱しました。しかし、胎盤のChATに対する抗体は、両方の中央と周辺のChAT 11-13を認識し、我々は最近、visuaを可能にする技術が記載されています高感度のENSのコリン作動性ニューロンのlization以前の開発でチャットレポーター線14で達成されたよりも。

ここでは、ニューロンにおけるENSの神経伝達物質の発現を可視化するマウス胚GI管の、固定および免疫染色を解剖するための手法を提示します。これらの研究のために、我々は、 チャット-Creマウスを利用しているR26Rと交配:floxSTOP:チャットのCreを生成するためにtdTomato動物、R26R:floxSTOP:tdTomatoマウス (原稿全体のChAT-CreをtdTomatoと定義されます)。これらの動物は、その後のChAT発現14を検出する蛍光レポーターの両方を発現するマウスを得るために、ホモ接合のChAT-GFPレポーターマウスと交配させました。これら二つのレポーター動物は、C57BL / 6Jバックグラウンド上にあり、(ジャクソン·ラボラトリーズ、バーハーバー、ME)は、市販されています。

Protocol

ウィスコンシン大学の動物実験委員会は、すべての手順を承認しました。 ソリューションの調製解剖緩衝液およびリンス液として1×リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を使用します。 ボトルにスクロースおよび場所の30グラムを計量することにより、30%スクロースを準備します。 1×PBS 99 mlを加え、1mlの10%アジ化ナトリウムを追加します。ショ糖の全てが?…

Representative Results

我々は以前のChAT発現14を検出GFPおよびtdTomato蛍光レポーターの両方を発現するマウスの生成を記載しています。簡単に説明すると、 チャットCreマウスは、R26Rと交配させた:floxSTOP:チャットのCreを生成するためにtdTomato動物; R26R:floxSTOP:(チャット-CreをtdTomatoと呼ばれる)tdTomatoマウスを。これらの動物は、その後、ホモ接合のChAT-GFPレ…

Discussion

私たちの研究室等はHSCR腸内の欠陥があっても神経節の小腸5,15,16に、無神経節結腸に限らず、近位に延長されていないことを示しています。これらの変化はENS神経密度と神経伝達物質表現型の変化を含み、HSCRを有する患者において観察された運動障害を説明することができます。私たちは、ENS形成の決定要因を理解するための努力で上記の技術を利用しています。具体的には、これ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品はアメリカの小児外科協会財団賞(AG)と健康K08DK098271(AG)の国立研究所メートがサポートされていました。

Materials

Phosphate Buffered Saline Oxoid BR0014G
Sucrose Fisher S2
Sodium Azide Fisher BP9221
Bovine Serum Albumin Fisher BP1605
Triton X-100 Sigma X100
Paraformaldehyde Sigma 158127
60 mm Petri dishes Fisher FB0875713A
Fluorescence scope Nikon SMZ-18 stereoscope
Dissection microscope Nikon SMZ-18 stereoscope
Fine forceps Fine science tools 11252-20
1.5 mL Eppendorf tubes VWR 20170-038
Fluoromount-G SouthernBiotech, Birmingham, AL 0100-01
Glass slides Fisher 12-550-15
Cover glass VWR 16004-330
Confocal microscope Nikon Nikon A1
Nikon Elements Nikon

References

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Cite This Article
Barlow-Anacker, A. J., Erickson, C. S., Epstein, M. L., Gosain, A. Immunostaining to Visualize Murine Enteric Nervous System Development. J. Vis. Exp. (98), e52716, doi:10.3791/52716 (2015).

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