Farging å Visual Murint Ente Nervous System Development
Summary
The enteric nervous system is formed by neural crest cells that proliferate, migrate and colonize the gut. Neural crest cells differentiate into neurons with markers specific for their neurotransmitter phenotype. This protocol describes a technique for dissecting, fixing and immunostaining of the murine embryonic gastrointestinal tract to visualize enteric nervous system neurotransmitter expression.
Abstract
The enteric nervous system is formed by neural crest cells that proliferate, migrate and colonize the gut. Following colonization, neural crest cells must then differentiate into neurons with markers specific for their neurotransmitter phenotype. Cholinergic neurons, a major neurotransmitter phenotype in the enteric nervous system, are identified by staining for choline acetyltransferase (ChAT), the synthesizing enzyme for acetylcholine. Historical efforts to visualize cholinergic neurons have been hampered by antibodies with differing specificities to central nervous system versus peripheral nervous system ChAT. We and others have overcome this limitation by using an antibody against placental ChAT, which recognizes both central and peripheral ChAT, to successfully visualize embryonic enteric cholinergic neurons. Additionally, we have compared this antibody to genetic reporters for ChAT and shown that the antibody is more reliable during embryogenesis. This protocol describes a technique for dissecting, fixing and immunostaining of the murine embryonic gastrointestinal tract to visualize enteric nervous system neurotransmitter expression.
Introduction
Et fungerende Ente Nervous System (ENS), som kontrollerer motilitet, næringsopptak, og lokal blodstrøm, er avgjørende for livet 1. ENS er dannet av neural crest celler (NCC) som sprer, vandrer og koloniserer tarmen, hvor de differensieres til ganglia inneholder nevroner og gliaceller. Hirschsprung sykdom (HSCR, Online Mendels arvelover i Man), en multigeneic medfødt lidelse med en forekomst på 1 av 4000 levendefødte, kan betraktes som det prototypiske sykdom for å studere forstyrret ENS formasjon. I HSCR, NCC klarer å migrere til og kolonisere variable lengder av distal hindgut to. I tillegg er andre vanlige gastrointestinal (GI) utviklingsmessige defekter i den pediatriske populasjonen, for eksempel anorektal misdannelser, tarm atresias og motilitetslidelser forbundet med forstyrrelser i grunnleggende ENS funksjoner, og er sannsynligvis forbundet med subtile, underappreciated, anatomiske endringer og funksjonelle endringer iENS 3-6. Derfor kan teknikker som tillater oss å forstå utviklings determinants av ENS dannelse belyse patogenesen og potensiell behandling av pediatriske GI veislidelser.
Etter migrasjon og kolonisering, skiller NCC i nevroner med markører spesifikke for deres neurotransmitter fenotype. Kolinerge neuroner utgjør ca 60% av enteriske neuroner 7, og kan bli detektert ved farging for cholin acetyltransferase (ChAT), å syntetisere enzymet for eksitatorisk neurotransmitter acetylkolin. Historisk forsøker å visualisere kolinerge nevroner ble forvirret av ulike antigen spesifisitet av antistoffer rettet mot sentralnervesystemet (CNS) Chat versus perifere nervesystemet (PNS) Chat 8-10. Men antistoffer rettet mot morkake ChAT gjenkjenne både sentrale og perifere ChAT 11-13, og vi har nylig beskrevet teknikker som gjør det mulig for visualization av ENS kolinerge nevroner med høy følsomhet tidligere i utviklingen enn det som har blitt oppnådd med ChAT reporter linjer 14.
Her presenterer vi en teknikk for å dissekere, fikse og farging av mus embryonale mage-tarmkanalen til å visualisere ENS neurotransmitter uttrykk i nevroner. For disse studiene, har vi benyttet ChAT-Cre mus parret med R26R: floxSTOP: tdTomato dyr å produsere chat-Cre; R26R: floxSTOP: tdTomato mus (definert som ChAT-Cre tdTomato hele manuskriptet). Disse dyrene ble så parret med homozygot chat-GFP reporter mus, for å få mus som uttrykker både fluorescerende reportere som gjenkjenner ChAT uttrykk 14. Disse to reporter dyr er på en C57BL / 6J bakgrunnen og er kommersielt tilgjengelig (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME).
Protocol
Representative Results
Discussion
Vårt laboratorium og andre har vist at intestinale mangler i HSCR ikke er begrenset til aganglionic tykktarmen, men utvidet proksimalt, selv inn i det ganglionated tynntarmen 5,15,16. Disse endringene omfatter endringer i ENS neuronal tetthet og nevrotransmitter fenotype, og kan utgjøre dysmotility som har blitt observert hos pasienter med HSCR. Vi har utnyttet de ovennevnte teknikker i arbeidet med å forstå de faktorer som bestemmer ENS formasjon. Nærmere bestemt har disse teknikker blitt anvendt for å…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet stipulert American Pediatric Surgical Association Foundation Award (AG) og National Institutes of Health K08DK098271 (AG).
Materials
| Phosphate Buffered Saline | Oxoid | BR0014G | |
| Sucrose | Fisher | S2 | |
| Sodium Azide | Fisher | BP9221 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher | BP1605 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| 60 mm Petri dishes | Fisher | FB0875713A | |
| Fluorescence scope | Nikon | SMZ-18 stereoscope | |
| Dissection microscope | Nikon | SMZ-18 stereoscope | |
| Fine forceps | Fine science tools | 11252-20 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | VWR | 20170-038 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech, Birmingham, AL | 0100-01 | |
| Glass slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Cover glass | VWR | 16004-330 | |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon A1 | |
| Nikon Elements | Nikon |
References
- Gershon, M. D. Developmental determinants of the independence and complexity of the enteric nervous system. Trends Neurosci. 33 (10), 446-456 (2010).
- Amiel, J., Sproat-Emison, E., et al. Hirschsprung disease, associated syndromes and genetics: a review. J Med Genet. 45 (1), 1-14 (2008).
- Erickson, C. S., Barlow, A. J., et al. Colonic enteric nervous system analysis during parenteral nutrition. J Surg Res. 184 (1), 132-137 (2013).
- Erickson, C. S., Zaitoun, I., Haberman, K. M., Gosain, A., Druckenbrod, N. R., Epstein, M. L. Sacral neural crest-derived cells enter the aganglionic colon of Ednrb(-/-) mice along extrinsic nerve fibers. J Comp Neurol. 20 (3), 620-632 (2011).
- Zaitoun, I., Erickson, C. S., et al. Altered neuronal density and neurotransmitter expression in the ganglionated region of Ednrb null mice: implications for Hirschsprung’s disease. Neurogastroenterol Motil. , (2013).
- Margolis, K. G., Stevanovic, K., et al. Enteric neuronal density contributes to the severity of intestinal inflammation. Gastroenterology. 141 (2), 588-598 (2011).
- Qu, Z. -. D., Thacker, M., Castelucci, P., Bagyánszki, M., Epstein, M. L., Furness, J. B. Immunohistochemical analysis of neuron types in the mouse small intestine. Cell Tissue Res. 334 (2), 147-161 (2008).
- Bian, X. -. C., Bornstein, J. C., Bertrand, P. P. Nicotinic transmission at functionally distinct synapses in descending reflex pathways of the rat colon. Neurogastroenterol Motil. 15 (2), 161-171 (2003).
- Johnson, C. D., Epstein, M. L. Monoclonal antibodies and polyvalent antiserum to chicken choline acetyltransferase. J Neurochem. 46 (3), 968-976 (1986).
- Tooyama, I., Kimura, H. A protein encoded by an alternative splice variant of choline acetyltransferase mRNA is localized preferentially in peripheral nerve cells and fibers. J Chem Neuroanat. 17 (4), 217-226 (2000).
- Koga, T., Bellier, J. -. P., Kimura, H., Tooyama, I. Immunoreactivity for Choline Acetyltransferase of Peripheral-Type (pChAT) in the Trigeminal Ganglion Neurons of the Non-Human Primate Macaca fascicularis. Acta histochemica et cytochemica. 46 (2), 59-64 (2013).
- Sang, Q., Young, H. M. The identification and chemical coding of cholinergic neurons in the small and large intestine of the mouse. Anat Rec. 251 (2), 185-199 (1998).
- Lei, J., Howard, M. J. Targeted deletion of Hand2 in enteric neural precursor cells affects its functions in neurogenesis, neurotransmitter specification and gangliogenesis, causing functional aganglionosis. Development (Cambridge, England). 138 (21), 4789-4800 (2011).
- Erickson, C. S., Lee, S. J., Barlow-Anacker, A. J., Druckenbrod, N. R., Epstein, M. L., Gosain, A. Appearance of cholinergic myenteric neurons during enteric nervous system development: comparison of different ChAT fluorescent mouse reporter lines. Neurogastroenterol Motil. 26 (6), 874-884 (2014).
- Teitelbaum, D. H., Caniano, D. A., Qualman, S. J. The pathophysiology of Hirschsprung’s-associated enterocolitis: importance of histologic correlates. J Pediatr Surg. 24 (12), 1271-1277 (1989).
- Aslam, A., Spicer, R. D., Corfield, A. P. Children with Hirschsprung’s disease have an abnormal colonic mucus defensive barrier independent of the bowel innervation status. J Pediatr Surg. 32 (8), 1206-1210 (1997).
- Puig, I., Champeval, D., De Santa Barbara, P., Jaubert, F., Lyonnet, S., Larue, L. Deletion of Pten in the mouse enteric nervous system induces ganglioneuromatosis and mimics intestinal pseudoobstruction. J Clin Invest. 119 (12), 3586-3596 (2009).
