The enteric nervous system is formed by neural crest cells that proliferate, migrate and colonize the gut. Neural crest cells differentiate into neurons with markers specific for their neurotransmitter phenotype. This protocol describes a technique for dissecting, fixing and immunostaining of the murine embryonic gastrointestinal tract to visualize enteric nervous system neurotransmitter expression.
The enteric nervous system is formed by neural crest cells that proliferate, migrate and colonize the gut. Following colonization, neural crest cells must then differentiate into neurons with markers specific for their neurotransmitter phenotype. Cholinergic neurons, a major neurotransmitter phenotype in the enteric nervous system, are identified by staining for choline acetyltransferase (ChAT), the synthesizing enzyme for acetylcholine. Historical efforts to visualize cholinergic neurons have been hampered by antibodies with differing specificities to central nervous system versus peripheral nervous system ChAT. We and others have overcome this limitation by using an antibody against placental ChAT, which recognizes both central and peripheral ChAT, to successfully visualize embryonic enteric cholinergic neurons. Additionally, we have compared this antibody to genetic reporters for ChAT and shown that the antibody is more reliable during embryogenesis. This protocol describes a technique for dissecting, fixing and immunostaining of the murine embryonic gastrointestinal tract to visualize enteric nervous system neurotransmitter expression.
En velfungerende enteriske nervesystem (ENS), som styrer motilitet, absorption af næringsstoffer, og lokal blodgennemstrømning, er afgørende for livet 1. ENS er dannet af neurale kamceller (NCC), der prolifererer, migrerer og koloniserer tarmen, hvor de differentierer til ganglier indeholdende neuroner og gliaceller. Hirschsprungs sygdom (HSCR, Online Mendelsk Arv i Man), en multigeneic medfødt lidelse med en incidens på 1 i 4000 levendefødte, kan betragtes som den prototypiske sygdom for at studere forstyrret ENS formation. I HSCR, NCC undlader at migrere til og kolonisere variable længder af den distale colon, 2. Derudover er andre fælles gastrointestinal (GI) udviklingsmæssige defekter i den pædiatriske population, såsom anorektale misdannelser, tarm atresias og motilitetsforstyrrelser forbundet med forstyrrelser i basale ENS funktioner, og er sandsynligvis forbundet med subtile, underappreciated, anatomiske forandringer og funktionelle ændringer iENS 3-6. Derfor kan teknikker, der tillader os at forstå de udviklingsmæssige determinanter for ENS dannelse belyse patogenesen og potentiel behandling af pædiatriske GI tract lidelser.
Efter migration og kolonisering, NCC differentierer ind neuroner med markører specifikke for deres neurotransmitter fænotype. Cholinerge neuroner udgør ca. 60% af enteriske neuroner 7, og kan påvises ved farvning for cholinacetyltransferase (ChAT), det syntetiserende enzym til excitatoriske neurotransmitter acetylcholin. Historisk har forsøg på at visualisere cholinerge neuroner blev forstyrret af forskellige antigenspecificitet af antistoffer rettet mod det centrale nervesystem (CNS) Chat versus perifere nervesystem (PNS) Chat 8-10. Men antistoffer rettet mod placenta ChAT genkende både centrale og perifere ChAT 11-13, og vi har for nylig beskrevne teknikker, der tillader udstyr og forretnilization af ENS cholinerge neuroner med høj følsomhed tidligere i udvikling, end der er opnået med ChAT reporter linier 14.
Her præsenterer vi en teknik til at dissekere, fastsættelse og immunfarvning af det murine embryonale mavetarmkanalen at visualisere ENS neurotransmitter udtryk i neuroner. Til disse undersøgelser, har vi udnyttet chat-Cre mus parret med R26R: floxSTOP: tdTomato dyr at producere chat-Cre; R26R: floxSTOP: tdTomato mus (defineret som chat-Cre tdTomato hele manuskriptet). Disse dyr blev derefter parret med homozygote chat-GFP reporter mus, til opnåelse af mus, der udtrykker både fluorescerende reportere, der registrerer ChAT ekspression 14. Disse to reporter dyr er på en C57BL / 6J baggrund, og er kommercielt tilgængelige (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME).
Vores laboratorium og andre har vist, at tarmens defekter i HSCR ikke er begrænset til den aganglionic kolon men udvidede proksimalt, selv ind i den ganglionated tyndtarmen 5,15,16. Disse ændringer omfatter ændringer i ENS neuronal tæthed og neurotransmitter fænotype og kan tegne sig for dysmotilitet der er blevet observeret hos patienter med HSCR. Vi har udnyttet de ovennævnte teknikker i vores bestræbelser på at forstå de afgørende faktorer for ENS-dannelse. Specifikt er disse teknikker blevet anv…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet bythe amerikanske Pediatric Kirurgisk Association Foundation Award (AG) og National Institutes of Health K08DK098271 (AG).
Phosphate Buffered Saline | Oxoid | BR0014G | |
Sucrose | Fisher | S2 | |
Sodium Azide | Fisher | BP9221 | |
Bovine Serum Albumin | Fisher | BP1605 | |
Triton X-100 | Sigma | X100 | |
Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
60 mm Petri dishes | Fisher | FB0875713A | |
Fluorescence scope | Nikon | SMZ-18 stereoscope | |
Dissection microscope | Nikon | SMZ-18 stereoscope | |
Fine forceps | Fine science tools | 11252-20 | |
1.5 mL Eppendorf tubes | VWR | 20170-038 | |
Fluoromount-G | SouthernBiotech, Birmingham, AL | 0100-01 | |
Glass slides | Fisher | 12-550-15 | |
Cover glass | VWR | 16004-330 | |
Confocal microscope | Nikon | Nikon A1 | |
Nikon Elements | Nikon |