Immunocoloration à Visualisez murin nerveux entérique développement du système
Summary
The enteric nervous system is formed by neural crest cells that proliferate, migrate and colonize the gut. Neural crest cells differentiate into neurons with markers specific for their neurotransmitter phenotype. This protocol describes a technique for dissecting, fixing and immunostaining of the murine embryonic gastrointestinal tract to visualize enteric nervous system neurotransmitter expression.
Abstract
The enteric nervous system is formed by neural crest cells that proliferate, migrate and colonize the gut. Following colonization, neural crest cells must then differentiate into neurons with markers specific for their neurotransmitter phenotype. Cholinergic neurons, a major neurotransmitter phenotype in the enteric nervous system, are identified by staining for choline acetyltransferase (ChAT), the synthesizing enzyme for acetylcholine. Historical efforts to visualize cholinergic neurons have been hampered by antibodies with differing specificities to central nervous system versus peripheral nervous system ChAT. We and others have overcome this limitation by using an antibody against placental ChAT, which recognizes both central and peripheral ChAT, to successfully visualize embryonic enteric cholinergic neurons. Additionally, we have compared this antibody to genetic reporters for ChAT and shown that the antibody is more reliable during embryogenesis. This protocol describes a technique for dissecting, fixing and immunostaining of the murine embryonic gastrointestinal tract to visualize enteric nervous system neurotransmitter expression.
Introduction
Un fonctionnement du système nerveux entérique (SNE), qui contrôle la motilité, l'absorption des nutriments, et la circulation sanguine locale, est essentiel à la vie 1. L'ENS est formé par les cellules de la crête neurale (CCN) qui prolifèrent, migrent et colonisent l'intestin, où ils se différencient en neurones des noyaux contenant et les cellules gliales. Maladie de Hirschsprung (Héritage de mendélienne HSCR, en ligne chez l'homme), un trouble congénital multigeneic avec une incidence de 1 sur 4000 naissances vivantes, peut être considéré comme la maladie prototypique pour l'étude de la formation ENS perturbé. Dans HSCR, CCN ne parviennent pas à migrer vers et de coloniser des longueurs variables de l'intestin distal 2. En outre, d'autres gastro-intestinales Fréquent (GI) les défauts de développement dans la population pédiatrique, tels que des malformations ano-rectales, atrésie intestinale et des troubles de la motilité sont associés à des perturbations dans les fonctions de base de l'ENS, et sont susceptibles d'être associées avec subtils, sous-estimés, les changements anatomiques et des changements fonctionnels dansl'ENS 3-6. Par conséquent, les techniques qui nous permettent de comprendre les déterminants du développement de la formation ENS peuvent faire la lumière sur la pathogenèse et le traitement potentiel des troubles du tractus GI pédiatriques.
Après la migration et de la colonisation, la CCN se différencie en neurones avec des marqueurs spécifiques de leur phénotype de neurotransmetteur. Les neurones cholinergiques comprennent environ 60% des neurones entériques 7, et peuvent être détectés par coloration de choline acétyltransférase (ChAT), l'enzyme de synthèse de l'acétylcholine, un neurotransmetteur excitateur. Historiquement, les tentatives de visualiser les neurones cholinergiques ont été confondus par les différentes spécificité antigénique des anticorps dirigés contre le système nerveux central (SNC) Chat contre le système nerveux périphérique (SNP) Tchat 8-10. Cependant, les anticorps dirigés contre placentaire ChAT reconnaître à la fois central et périphérique ChAT 11-13, et nous avons récemment techniques décrites qui permettent de visualisation des neurones cholinergiques ENS avec une grande sensibilité plus tôt dans le développement que ce qui a été réalisé avec des lignes ChAT rapporteurs 14.
Ici, nous présentons une technique de dissection, fixation et immunologique de la GI embryonnaire murin voies de visualiser ENS neurotransmetteur expression dans les neurones. Pour ces études, nous avons utilisé des souris Chat-Cre accouplées avec R26R: animaux tdTomato pour produire Chat-Cre; R26R: floxSTOP souris tdTomato (définis comme CHAT-Cre tdTomato au long du manuscrit): floxSTOP. Ces animaux ont ensuite été accouplées avec des souris rapporteurs de Chat-GFP homozygotes, pour obtenir des souris exprimant les deux reporters fluorescents qui détectent expression ChAT 14. Ces deux animaux rapporteurs sont sur un fond C57BL / 6J et sont disponibles dans le commerce (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME).
Protocol
Representative Results
Discussion
Notre laboratoire et d'autres ont montré que les défauts intestinales dans HSCR ne sont pas limitées au côlon aganglionnaire mais étendues proximale, même dans l'intestin grêle ganglionated 5,15,16. Ces modifications incluent des changements dans la densité et ENS neurotransmetteur neuronale phénotype et peuvent expliquer dysmotility qui a été observé chez les patients avec HSCR. Nous avons utilisé les techniques ci-dessus dans nos efforts pour comprendre les déterminants de la formation…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu PAR LE American Pediatric Surgical Association Foundation Award (AG) et les National Institutes of Health K08DK098271 (AG).
Materials
| Phosphate Buffered Saline | Oxoid | BR0014G | |
| Sucrose | Fisher | S2 | |
| Sodium Azide | Fisher | BP9221 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher | BP1605 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| 60 mm Petri dishes | Fisher | FB0875713A | |
| Fluorescence scope | Nikon | SMZ-18 stereoscope | |
| Dissection microscope | Nikon | SMZ-18 stereoscope | |
| Fine forceps | Fine science tools | 11252-20 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | VWR | 20170-038 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech, Birmingham, AL | 0100-01 | |
| Glass slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Cover glass | VWR | 16004-330 | |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon A1 | |
| Nikon Elements | Nikon |
References
- Gershon, M. D. Developmental determinants of the independence and complexity of the enteric nervous system. Trends Neurosci. 33 (10), 446-456 (2010).
- Amiel, J., Sproat-Emison, E., et al. Hirschsprung disease, associated syndromes and genetics: a review. J Med Genet. 45 (1), 1-14 (2008).
- Erickson, C. S., Barlow, A. J., et al. Colonic enteric nervous system analysis during parenteral nutrition. J Surg Res. 184 (1), 132-137 (2013).
- Erickson, C. S., Zaitoun, I., Haberman, K. M., Gosain, A., Druckenbrod, N. R., Epstein, M. L. Sacral neural crest-derived cells enter the aganglionic colon of Ednrb(-/-) mice along extrinsic nerve fibers. J Comp Neurol. 20 (3), 620-632 (2011).
- Zaitoun, I., Erickson, C. S., et al. Altered neuronal density and neurotransmitter expression in the ganglionated region of Ednrb null mice: implications for Hirschsprung’s disease. Neurogastroenterol Motil. , (2013).
- Margolis, K. G., Stevanovic, K., et al. Enteric neuronal density contributes to the severity of intestinal inflammation. Gastroenterology. 141 (2), 588-598 (2011).
- Qu, Z. -. D., Thacker, M., Castelucci, P., Bagyánszki, M., Epstein, M. L., Furness, J. B. Immunohistochemical analysis of neuron types in the mouse small intestine. Cell Tissue Res. 334 (2), 147-161 (2008).
- Bian, X. -. C., Bornstein, J. C., Bertrand, P. P. Nicotinic transmission at functionally distinct synapses in descending reflex pathways of the rat colon. Neurogastroenterol Motil. 15 (2), 161-171 (2003).
- Johnson, C. D., Epstein, M. L. Monoclonal antibodies and polyvalent antiserum to chicken choline acetyltransferase. J Neurochem. 46 (3), 968-976 (1986).
- Tooyama, I., Kimura, H. A protein encoded by an alternative splice variant of choline acetyltransferase mRNA is localized preferentially in peripheral nerve cells and fibers. J Chem Neuroanat. 17 (4), 217-226 (2000).
- Koga, T., Bellier, J. -. P., Kimura, H., Tooyama, I. Immunoreactivity for Choline Acetyltransferase of Peripheral-Type (pChAT) in the Trigeminal Ganglion Neurons of the Non-Human Primate Macaca fascicularis. Acta histochemica et cytochemica. 46 (2), 59-64 (2013).
- Sang, Q., Young, H. M. The identification and chemical coding of cholinergic neurons in the small and large intestine of the mouse. Anat Rec. 251 (2), 185-199 (1998).
- Lei, J., Howard, M. J. Targeted deletion of Hand2 in enteric neural precursor cells affects its functions in neurogenesis, neurotransmitter specification and gangliogenesis, causing functional aganglionosis. Development (Cambridge, England). 138 (21), 4789-4800 (2011).
- Erickson, C. S., Lee, S. J., Barlow-Anacker, A. J., Druckenbrod, N. R., Epstein, M. L., Gosain, A. Appearance of cholinergic myenteric neurons during enteric nervous system development: comparison of different ChAT fluorescent mouse reporter lines. Neurogastroenterol Motil. 26 (6), 874-884 (2014).
- Teitelbaum, D. H., Caniano, D. A., Qualman, S. J. The pathophysiology of Hirschsprung’s-associated enterocolitis: importance of histologic correlates. J Pediatr Surg. 24 (12), 1271-1277 (1989).
- Aslam, A., Spicer, R. D., Corfield, A. P. Children with Hirschsprung’s disease have an abnormal colonic mucus defensive barrier independent of the bowel innervation status. J Pediatr Surg. 32 (8), 1206-1210 (1997).
- Puig, I., Champeval, D., De Santa Barbara, P., Jaubert, F., Lyonnet, S., Larue, L. Deletion of Pten in the mouse enteric nervous system induces ganglioneuromatosis and mimics intestinal pseudoobstruction. J Clin Invest. 119 (12), 3586-3596 (2009).
