Immunostaining לדמיין פיתוח מערכת עצבים Murine מעיים
Summary
The enteric nervous system is formed by neural crest cells that proliferate, migrate and colonize the gut. Neural crest cells differentiate into neurons with markers specific for their neurotransmitter phenotype. This protocol describes a technique for dissecting, fixing and immunostaining of the murine embryonic gastrointestinal tract to visualize enteric nervous system neurotransmitter expression.
Abstract
The enteric nervous system is formed by neural crest cells that proliferate, migrate and colonize the gut. Following colonization, neural crest cells must then differentiate into neurons with markers specific for their neurotransmitter phenotype. Cholinergic neurons, a major neurotransmitter phenotype in the enteric nervous system, are identified by staining for choline acetyltransferase (ChAT), the synthesizing enzyme for acetylcholine. Historical efforts to visualize cholinergic neurons have been hampered by antibodies with differing specificities to central nervous system versus peripheral nervous system ChAT. We and others have overcome this limitation by using an antibody against placental ChAT, which recognizes both central and peripheral ChAT, to successfully visualize embryonic enteric cholinergic neurons. Additionally, we have compared this antibody to genetic reporters for ChAT and shown that the antibody is more reliable during embryogenesis. This protocol describes a technique for dissecting, fixing and immunostaining of the murine embryonic gastrointestinal tract to visualize enteric nervous system neurotransmitter expression.
Introduction
מערכת תפקוד מעי עצבים (ENS), השולטת בתנועתיות, מזין קליטה, וזרימת דם מקומית, היא חיונית לחיים 1. ENS נוצר על ידי תאים עצביים פסגה (NCC) שמתרבים, להעביר וליישב את הבטן, שבו הם להתמיין הנוירונים הגרעינים המכילים ותאי גלייה. מחלת הירשפרונג (תורשה של מנדל HSCR, באינטרנט באיש), הפרעה מולדת multigeneic עם שכיחות של 1 ב4,000 לידה חי, יכולה להיחשב המחלה אבטיפוס ללימוד היווצרות ENS שיבש. בHSCR, NCC לא מצליח להעביר ולליישב אורכים משתנה של המעי האחורי דיסטלי 2. בנוסף, במערכת העיכול נפוצה אחרת (GI) פגמים התפתחותיים באוכלוסיית הילדים, כגון מומים אנו-רקטליות, atresias מעיים, והפרעות תנועתיות קשורות עם הפרעות בתפקודים בסיסיים ENS, וצפויה הקשורים בשינויים קלים, אינם מוערכים, אנטומיים ושינויים תפקודיים ב3-6 ENS. לכן, טכניקות שתאפשרנה לנו להבין את הגורמים התפתחותיים של היווצרות ENS עשויות לשפוך אור על הפתוגנזה וטיפול פוטנציאלי של הפרעות בדרכי עיכול בילדים.
בעקבות הגירה והתישבות, NCC מבדיל לתוך הנוירונים עם סמנים ספציפיים לפנוטיפ העצבי שלהם. נוירונים כולינרגית מהווים כ 60% מתאי עצב מעיים 7, ויכולים להיות מזוהים על ידי מכתים לacetyltransferase כולין (צ'אט), אנזים הסינתזה להנוירוטרנסמיטר אצטילכולין מעורר. מבחינה הסטורית, מנסה לדמיין נוירונים כולינרגית היו מבולבל על ידי שונה סגוליות אנטיגן של נוגדנים המכוונים נגד מערכת עצבים מרכזית (CNS) צ'אט לעומת מערכת עצבים היקפית (PNS) צ'אט 8-10. עם זאת, נוגדנים המכוונים נגד צ'אט שליה להכיר שני צ'אט המרכזי והיקפי 11-13, ויש לנו טכניקות מתוארות לאחרונה המאפשרות לvisualization של נוירונים כולינרגית ENS עם רגישות גבוהה מוקדם יותר בפיתוח מאשר הושג עם קווי כתב צ'אט 14.
כאן, אנו מציגים טכניקה לנתח, לתקן וimmunostaining של מערכת העיכול עוברי עכברית לדמיין ביטוי עצבי ENS בתאי עצב. למחקרים אלה, שנוצלנו עכברי הצ'אט-Cre הזדווגו עם R26R: בעלי חיים tdTomato לייצר צ'אט-Cre; R26R: floxSTOP עכברי tdTomato (המוגדרים כצ'אט-Cre tdTomato ברחבי כתב היד): floxSTOP. בעלי חיים אלה ולאחר מכן היו הזדווגו עם עכברי כתב צ'אט-GFP הומוזיגוטים, להשיג עכברים להביע שני כתבי ניאון המזהים ביטוי צ'אט 14. שני בעלי חיים אלה הם כתב על רקע C57BL / 6J והם זמינים מסחריים (ג'קסון מעבדות, בר הרבור, ME).
Protocol
Representative Results
Discussion
המעבדה ואחרים שלנו הראו כי ליקויים במערכת העיכול בHSCR אינם מוגבלים למעי גס aganglionic אבל הרחיבו proximally, אפילו למעי הדק ganglionated 5,15,16. שינויים אלה כוללים שינויים בפנוטיפ צפיפות והעצבי העצבי ENS ועשויים להסביר dysmotility שנצפה בחולים עם HSCR. יש לנו מנוצלים הטכניקות לעיל במאמצי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על איגוד כירורגי ילדים אמריקאי פרס קרן (AG) והמכון הלאומי לבריאות K08DK098271 (AG) bythe.
Materials
| Phosphate Buffered Saline | Oxoid | BR0014G | |
| Sucrose | Fisher | S2 | |
| Sodium Azide | Fisher | BP9221 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher | BP1605 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| 60 mm Petri dishes | Fisher | FB0875713A | |
| Fluorescence scope | Nikon | SMZ-18 stereoscope | |
| Dissection microscope | Nikon | SMZ-18 stereoscope | |
| Fine forceps | Fine science tools | 11252-20 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | VWR | 20170-038 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech, Birmingham, AL | 0100-01 | |
| Glass slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Cover glass | VWR | 16004-330 | |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon A1 | |
| Nikon Elements | Nikon |
References
- Gershon, M. D. Developmental determinants of the independence and complexity of the enteric nervous system. Trends Neurosci. 33 (10), 446-456 (2010).
- Amiel, J., Sproat-Emison, E., et al. Hirschsprung disease, associated syndromes and genetics: a review. J Med Genet. 45 (1), 1-14 (2008).
- Erickson, C. S., Barlow, A. J., et al. Colonic enteric nervous system analysis during parenteral nutrition. J Surg Res. 184 (1), 132-137 (2013).
- Erickson, C. S., Zaitoun, I., Haberman, K. M., Gosain, A., Druckenbrod, N. R., Epstein, M. L. Sacral neural crest-derived cells enter the aganglionic colon of Ednrb(-/-) mice along extrinsic nerve fibers. J Comp Neurol. 20 (3), 620-632 (2011).
- Zaitoun, I., Erickson, C. S., et al. Altered neuronal density and neurotransmitter expression in the ganglionated region of Ednrb null mice: implications for Hirschsprung’s disease. Neurogastroenterol Motil. , (2013).
- Margolis, K. G., Stevanovic, K., et al. Enteric neuronal density contributes to the severity of intestinal inflammation. Gastroenterology. 141 (2), 588-598 (2011).
- Qu, Z. -. D., Thacker, M., Castelucci, P., Bagyánszki, M., Epstein, M. L., Furness, J. B. Immunohistochemical analysis of neuron types in the mouse small intestine. Cell Tissue Res. 334 (2), 147-161 (2008).
- Bian, X. -. C., Bornstein, J. C., Bertrand, P. P. Nicotinic transmission at functionally distinct synapses in descending reflex pathways of the rat colon. Neurogastroenterol Motil. 15 (2), 161-171 (2003).
- Johnson, C. D., Epstein, M. L. Monoclonal antibodies and polyvalent antiserum to chicken choline acetyltransferase. J Neurochem. 46 (3), 968-976 (1986).
- Tooyama, I., Kimura, H. A protein encoded by an alternative splice variant of choline acetyltransferase mRNA is localized preferentially in peripheral nerve cells and fibers. J Chem Neuroanat. 17 (4), 217-226 (2000).
- Koga, T., Bellier, J. -. P., Kimura, H., Tooyama, I. Immunoreactivity for Choline Acetyltransferase of Peripheral-Type (pChAT) in the Trigeminal Ganglion Neurons of the Non-Human Primate Macaca fascicularis. Acta histochemica et cytochemica. 46 (2), 59-64 (2013).
- Sang, Q., Young, H. M. The identification and chemical coding of cholinergic neurons in the small and large intestine of the mouse. Anat Rec. 251 (2), 185-199 (1998).
- Lei, J., Howard, M. J. Targeted deletion of Hand2 in enteric neural precursor cells affects its functions in neurogenesis, neurotransmitter specification and gangliogenesis, causing functional aganglionosis. Development (Cambridge, England). 138 (21), 4789-4800 (2011).
- Erickson, C. S., Lee, S. J., Barlow-Anacker, A. J., Druckenbrod, N. R., Epstein, M. L., Gosain, A. Appearance of cholinergic myenteric neurons during enteric nervous system development: comparison of different ChAT fluorescent mouse reporter lines. Neurogastroenterol Motil. 26 (6), 874-884 (2014).
- Teitelbaum, D. H., Caniano, D. A., Qualman, S. J. The pathophysiology of Hirschsprung’s-associated enterocolitis: importance of histologic correlates. J Pediatr Surg. 24 (12), 1271-1277 (1989).
- Aslam, A., Spicer, R. D., Corfield, A. P. Children with Hirschsprung’s disease have an abnormal colonic mucus defensive barrier independent of the bowel innervation status. J Pediatr Surg. 32 (8), 1206-1210 (1997).
- Puig, I., Champeval, D., De Santa Barbara, P., Jaubert, F., Lyonnet, S., Larue, L. Deletion of Pten in the mouse enteric nervous system induces ganglioneuromatosis and mimics intestinal pseudoobstruction. J Clin Invest. 119 (12), 3586-3596 (2009).
