O sistema nervoso entérico é formado por células da crista neural que proliferam, migram e colonizam o intestino. As células da crista neural se diferenciam em neurônios com marcadores específicos para seu fenótipo de neurotransmissor. Este protocolo descreve uma técnica de dissecação, fixação e imunocoloração do trato gastrointestinal embrionário murino para visualizar a expressão de neurotransmissores do sistema nervoso entérico.
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Artigo de método
Immunostaining para Visualize Murino desenvolvimento do sistema nervoso entérico
Neste artigo
Resumo
Resumo
O sistema nervoso entérico é formado por células da crista neural que proliferam, migram e colonizam o intestino. Após a colonização, as células da crista neural devem se diferenciar em neurônios com marcadores específicos para seu fenótipo de neurotransmissor. Os neurônios colinérgicos, um importante fenótipo de neurotransmissor no sistema nervoso entérico, são identificados pela coloração da colina acetiltransferase (ChAT), a enzima sintetizadora da acetilcolina. Esforços históricos para visualizar neurônios colinérgicos foram prejudicados por anticorpos com especificidades diferentes para ChAT do sistema nervoso central versus sistema nervoso periférico. Nós e outros superamos essa limitação usando um anticorpo contra ChAT placentário, que reconhece ChAT central e periférico, para visualizar com sucesso neurônios colinérgicos entéricos embrionários. Além disso, comparamos esse anticorpo com repórteres genéticos para ChAT e mostramos que o anticorpo é mais confiável durante a embriogênese. Este protocolo descreve uma técnica de dissecação, fixação e imunocoloração do trato gastrointestinal embrionário murino para visualizar a expressão de neurotransmissores do sistema nervoso entérico.
Introdução
Um funcionamento do sistema nervoso entérico (ENS), que controla a motilidade, a absorção de nutrientes e fluxo sanguíneo local, é essencial para a vida 1. O SNE é formado por células da crista neural (NCC) que proliferam, migram e colonizar o intestino, onde se diferenciam em gânglios contendo neurónios e células gliais. Doença de Hirschsprung (HSCR, on-line Mendelian Inheritance in Man), uma desordem congênita multigeneic com uma incidência de 1 em 4.000 nascidos vivos, pode ser considerada a doença prototípica para estudar a formação ENS interrompido. Em HSCR, NCC não conseguem migrar para colonizar e comprimentos variáveis do intestino posterior dist....
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Protocolo
A Universidade de Wisconsin Animal Care e do Comitê Use aprovado todos os procedimentos.
1. Preparação de Soluções
- Use fosfato 1x solução salina tamponada (PBS) como tampão de dissecção e uma solução de enxaguamento.
- Prepare a 30% de sacarose por pesagem de 30 g de sacarose e em lugar de uma garrafa. Adicionar 99 ml de PBS 1x e adicionar azida de sódio a 1 ml de 10%. Misturar bem até que toda a sacarose é dissolvido. Armazenar a 4 ° C até serem necessárias.
- Preparar a solução de bloqueio através da mistura de 1x PBS, 3% de albumina de soro bovino (BSA) e 0,1% de Triton-X-100. Misture bem e guarde na g....
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Resultados
Descrevemos previamente a geração de ratinhos que expressam GFP e ambos tdTomato repórteres fluorescentes que detectam expressão ChAT em 14. Resumidamente, os ratos chat-Cre foram acasalados com R26R: floxSTOP: animais tdTomato para produzir chat-Cre; R26R: ratos tdTomato (chamados chat-Cre tdTomato): floxSTOP. Estes animais foram depois acasalados com ratinhos repórter ChAT-GFP homozigóticos. Os embriões foram isolados e os tecidos foram dissec.......
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Discussão
O nosso laboratório e outros mostraram que defeitos intestinais em HSCR não são restritas para o cólon proximal alargada aganglionic mas, mesmo para o intestino delgado ganglionados 5,15,16. Estas alterações incluem modificações nas ENS densidade neuronal e fenótipo neurotransmissor e podem ser responsáveis pela dismotilidade que tem sido observada em pacientes com HSCR. Nós utilizamos as técnicas acima em nossos esforços para entender os determinantes da formação ENS. Especificamente, estas técnicas têm si.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado bythe Academia Americana de Pediatria Cirúrgica Award Foundation (AG) e os Institutos Nacionais de Saúde K08DK098271 (AG).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Solução salina tamponada com fosfato | Oxóide | BR0014G | |
| sacarose | Fisher | S2 | |
| Azida sódica | Fisher | BP9221 | |
| Albumina de soro bovino | Fisher | BP1605 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Paraformaldeído | Sigma | 158127 | |
| 60 mm Placas de Petri | Microscópio | Fisher FB0875713A | |
| Estereoscópio Nikon | SMZ-18 Microscópio | ||
| de dissecção | Estereoscópio Nikon | SMZ-18 Pinça | |
| fina | Ferramentas de ciência fina | 11252-20 | |
| Tubos Eppendorf de 1,5 ml | VWR | 20170-038 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech, Birmingham, AL | 0100-01 | |
| Corrediças de vidro | Fisher | 12-550-15 | |
| Vidro de cobertura | VWR | 16004-330 | |
| Microscópio confocal | Nikon | Nikon A1 | |
| Nikon Elements | Nikon |
Referências
- Gershon, M. D. Developmental determinants of the independence and complexity of the enteric nervous system. Trends Neurosci. 33 (10), 446-456 (2010).
- Amiel, J., Sproat-Emison, E., et al. Hirschsprung disease, associated syndromes and genetics: a ....
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Reimpressões e permissões
