Immunostaining para Visualize Murino desenvolvimento do sistema nervoso entérico
Summary
The enteric nervous system is formed by neural crest cells that proliferate, migrate and colonize the gut. Neural crest cells differentiate into neurons with markers specific for their neurotransmitter phenotype. This protocol describes a technique for dissecting, fixing and immunostaining of the murine embryonic gastrointestinal tract to visualize enteric nervous system neurotransmitter expression.
Abstract
The enteric nervous system is formed by neural crest cells that proliferate, migrate and colonize the gut. Following colonization, neural crest cells must then differentiate into neurons with markers specific for their neurotransmitter phenotype. Cholinergic neurons, a major neurotransmitter phenotype in the enteric nervous system, are identified by staining for choline acetyltransferase (ChAT), the synthesizing enzyme for acetylcholine. Historical efforts to visualize cholinergic neurons have been hampered by antibodies with differing specificities to central nervous system versus peripheral nervous system ChAT. We and others have overcome this limitation by using an antibody against placental ChAT, which recognizes both central and peripheral ChAT, to successfully visualize embryonic enteric cholinergic neurons. Additionally, we have compared this antibody to genetic reporters for ChAT and shown that the antibody is more reliable during embryogenesis. This protocol describes a technique for dissecting, fixing and immunostaining of the murine embryonic gastrointestinal tract to visualize enteric nervous system neurotransmitter expression.
Introduction
Um funcionamento do sistema nervoso entérico (ENS), que controla a motilidade, a absorção de nutrientes e fluxo sanguíneo local, é essencial para a vida 1. O SNE é formado por células da crista neural (NCC) que proliferam, migram e colonizar o intestino, onde se diferenciam em gânglios contendo neurónios e células gliais. Doença de Hirschsprung (HSCR, on-line Mendelian Inheritance in Man), uma desordem congênita multigeneic com uma incidência de 1 em 4.000 nascidos vivos, pode ser considerada a doença prototípica para estudar a formação ENS interrompido. Em HSCR, NCC não conseguem migrar para colonizar e comprimentos variáveis do intestino posterior distal 2. Além disso, outro gastrointestinal comum (GI) defeitos de desenvolvimento na população pediátrica, como malformações anorretais, atresias intestinais e distúrbios de motilidade são associados a distúrbios nas funções básicas ENS, e estão provavelmente associados à subtis, subvalorizado, alterações anatômicas e alterações funcionaiso 3-6 ENS. Portanto, as técnicas que nos permitem entender os determinantes do desenvolvimento da formação ENS pode lançar luz sobre a patogênese e potencial tratamento de distúrbios do trato GI pediátricos.
Na sequência de migração e colonização, NCC diferencia em neurônios com marcadores específicos para seu fenótipo neurotransmissor. Os neurónios colinérgicos representam cerca de 60% de neurónios entéricos 7, e pode ser detectado por coloração para colina acetiltransferase (ChAT), a enzima de síntese para a acetilcolina neurotransmissor excitatório. Historicamente, as tentativas para visualizar os neurónios colinérgicos foram confundidos pela diferindo a especificidade do antigénio dos anticorpos dirigidos contra o sistema nervoso central (SNC) contra a ChAT sistema nervoso periférico (SNP) ChAT 8-10. No entanto, os anticorpos dirigidos contra placentária ChAT reconhecer tanto ChAT central e periférica 11-13, e temos técnicas recentemente descritos que permitem a visuazação da ENS neurônios colinérgicos com alta sensibilidade anteriormente no desenvolvimento do que foi alcançado com linhas de chat repórter 14.
Aqui, nós apresentamos uma técnica para dissecar, fixação e imunomarcação do murino tracto GI embrionário para visualizar ENS expressão de neurotransmissores nos neurônios. Para estes estudos, nós utilizamos ratos chat-Cre acasalaram com R26R: animais tdTomato para produzir chat-Cre; R26R:: floxSTOP ratos tdTomato (definidos como chat-Cre tdTomato em todo o manuscrito): floxSTOP. Estes animais foram depois acasalados com ratinhos repórter ChAT-GFP homozigóticos, para obter ratinhos que expressam ambos os repórteres fluorescentes que detectam expressão ChAT em 14. Esses dois animais repórter estão em um fundo C57BL / 6J e estão comercialmente disponíveis (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME).
Protocol
Representative Results
Discussion
O nosso laboratório e outros mostraram que defeitos intestinais em HSCR não são restritas para o cólon proximal alargada aganglionic mas, mesmo para o intestino delgado ganglionados 5,15,16. Estas alterações incluem modificações nas ENS densidade neuronal e fenótipo neurotransmissor e podem ser responsáveis pela dismotilidade que tem sido observada em pacientes com HSCR. Nós utilizamos as técnicas acima em nossos esforços para entender os determinantes da formação ENS. Especificamente, es…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado bythe Academia Americana de Pediatria Cirúrgica Award Foundation (AG) e os Institutos Nacionais de Saúde K08DK098271 (AG).
Materials
| Phosphate Buffered Saline | Oxoid | BR0014G | |
| Sucrose | Fisher | S2 | |
| Sodium Azide | Fisher | BP9221 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher | BP1605 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| 60 mm Petri dishes | Fisher | FB0875713A | |
| Fluorescence scope | Nikon | SMZ-18 stereoscope | |
| Dissection microscope | Nikon | SMZ-18 stereoscope | |
| Fine forceps | Fine science tools | 11252-20 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | VWR | 20170-038 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech, Birmingham, AL | 0100-01 | |
| Glass slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Cover glass | VWR | 16004-330 | |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon A1 | |
| Nikon Elements | Nikon |
References
- Gershon, M. D. Developmental determinants of the independence and complexity of the enteric nervous system. Trends Neurosci. 33 (10), 446-456 (2010).
- Amiel, J., Sproat-Emison, E., et al. Hirschsprung disease, associated syndromes and genetics: a review. J Med Genet. 45 (1), 1-14 (2008).
- Erickson, C. S., Barlow, A. J., et al. Colonic enteric nervous system analysis during parenteral nutrition. J Surg Res. 184 (1), 132-137 (2013).
- Erickson, C. S., Zaitoun, I., Haberman, K. M., Gosain, A., Druckenbrod, N. R., Epstein, M. L. Sacral neural crest-derived cells enter the aganglionic colon of Ednrb(-/-) mice along extrinsic nerve fibers. J Comp Neurol. 20 (3), 620-632 (2011).
- Zaitoun, I., Erickson, C. S., et al. Altered neuronal density and neurotransmitter expression in the ganglionated region of Ednrb null mice: implications for Hirschsprung’s disease. Neurogastroenterol Motil. , (2013).
- Margolis, K. G., Stevanovic, K., et al. Enteric neuronal density contributes to the severity of intestinal inflammation. Gastroenterology. 141 (2), 588-598 (2011).
- Qu, Z. -. D., Thacker, M., Castelucci, P., Bagyánszki, M., Epstein, M. L., Furness, J. B. Immunohistochemical analysis of neuron types in the mouse small intestine. Cell Tissue Res. 334 (2), 147-161 (2008).
- Bian, X. -. C., Bornstein, J. C., Bertrand, P. P. Nicotinic transmission at functionally distinct synapses in descending reflex pathways of the rat colon. Neurogastroenterol Motil. 15 (2), 161-171 (2003).
- Johnson, C. D., Epstein, M. L. Monoclonal antibodies and polyvalent antiserum to chicken choline acetyltransferase. J Neurochem. 46 (3), 968-976 (1986).
- Tooyama, I., Kimura, H. A protein encoded by an alternative splice variant of choline acetyltransferase mRNA is localized preferentially in peripheral nerve cells and fibers. J Chem Neuroanat. 17 (4), 217-226 (2000).
- Koga, T., Bellier, J. -. P., Kimura, H., Tooyama, I. Immunoreactivity for Choline Acetyltransferase of Peripheral-Type (pChAT) in the Trigeminal Ganglion Neurons of the Non-Human Primate Macaca fascicularis. Acta histochemica et cytochemica. 46 (2), 59-64 (2013).
- Sang, Q., Young, H. M. The identification and chemical coding of cholinergic neurons in the small and large intestine of the mouse. Anat Rec. 251 (2), 185-199 (1998).
- Lei, J., Howard, M. J. Targeted deletion of Hand2 in enteric neural precursor cells affects its functions in neurogenesis, neurotransmitter specification and gangliogenesis, causing functional aganglionosis. Development (Cambridge, England). 138 (21), 4789-4800 (2011).
- Erickson, C. S., Lee, S. J., Barlow-Anacker, A. J., Druckenbrod, N. R., Epstein, M. L., Gosain, A. Appearance of cholinergic myenteric neurons during enteric nervous system development: comparison of different ChAT fluorescent mouse reporter lines. Neurogastroenterol Motil. 26 (6), 874-884 (2014).
- Teitelbaum, D. H., Caniano, D. A., Qualman, S. J. The pathophysiology of Hirschsprung’s-associated enterocolitis: importance of histologic correlates. J Pediatr Surg. 24 (12), 1271-1277 (1989).
- Aslam, A., Spicer, R. D., Corfield, A. P. Children with Hirschsprung’s disease have an abnormal colonic mucus defensive barrier independent of the bowel innervation status. J Pediatr Surg. 32 (8), 1206-1210 (1997).
- Puig, I., Champeval, D., De Santa Barbara, P., Jaubert, F., Lyonnet, S., Larue, L. Deletion of Pten in the mouse enteric nervous system induces ganglioneuromatosis and mimics intestinal pseudoobstruction. J Clin Invest. 119 (12), 3586-3596 (2009).
