Summary

Murine आंतों का तंत्रिका प्रणाली विकास की कल्पना करने के Immunostaining

Published: April 29, 2015
doi:

Summary

The enteric nervous system is formed by neural crest cells that proliferate, migrate and colonize the gut. Neural crest cells differentiate into neurons with markers specific for their neurotransmitter phenotype. This protocol describes a technique for dissecting, fixing and immunostaining of the murine embryonic gastrointestinal tract to visualize enteric nervous system neurotransmitter expression.

Abstract

The enteric nervous system is formed by neural crest cells that proliferate, migrate and colonize the gut. Following colonization, neural crest cells must then differentiate into neurons with markers specific for their neurotransmitter phenotype. Cholinergic neurons, a major neurotransmitter phenotype in the enteric nervous system, are identified by staining for choline acetyltransferase (ChAT), the synthesizing enzyme for acetylcholine. Historical efforts to visualize cholinergic neurons have been hampered by antibodies with differing specificities to central nervous system versus peripheral nervous system ChAT. We and others have overcome this limitation by using an antibody against placental ChAT, which recognizes both central and peripheral ChAT, to successfully visualize embryonic enteric cholinergic neurons. Additionally, we have compared this antibody to genetic reporters for ChAT and shown that the antibody is more reliable during embryogenesis. This protocol describes a technique for dissecting, fixing and immunostaining of the murine embryonic gastrointestinal tract to visualize enteric nervous system neurotransmitter expression.

Introduction

गतिशीलता, पोषक तत्व अवशोषण, और स्थानीय रक्त के प्रवाह को नियंत्रित करता है जो एक से कार्य आंतों का तंत्रिका तंत्र (सत्ता), जीवन 1 करने के लिए आवश्यक है। सत्ता, विस्थापित और वे गैन्ग्लिया युक्त न्यूरॉन्स और glial कोशिकाओं में अंतर जहां आंत, उपनिवेश पैदा करना है कि तंत्रिका शिखा कोशिकाओं (एनसीसी) द्वारा बनाई है। हिर्स्चस्प्रुंग रोग (मनुष्य में HSCR, ऑनलाइन मेंडेलियाई भाग), 1 4000 में जीवित जन्मों की एक घटना के साथ एक multigeneic जन्मजात विकार, बाधित सत्ता गठन के अध्ययन के लिए prototypic रोग माना जा सकता है। HSCR में एनसीसी की ओर पलायन और बाहर का पश्चांत्र 2 के चर लंबाई उपनिवेश स्थापित करने में विफल। साथ ही, दूसरे आम जठरांत्र (सैनिक) ऐसे anorectal विकृतियां, आंतों atresias, और गतिशीलता विकार के रूप में बाल चिकित्सा आबादी में विकास संबंधी दोषों, बुनियादी सत्ता कार्यों में गड़बड़ी के साथ जुड़े रहे हैं, और संभावना सूक्ष्म, underappreciated, शारीरिक परिवर्तन और कार्यात्मक परिवर्तन के साथ जुड़े रहे हैंसत्ता 3-6। इसलिए, हमें सत्ता गठन की विकासात्मक निर्धारकों को समझने के लिए अनुमति देते हैं कि तकनीक रोगजनन और बाल चिकित्सा सैनिक पथ विकारों के संभावित उपचार पर प्रकाश डाला सकता है।

प्रवास और उपनिवेशन के बाद, एनसीसी उनके न्यूरोट्रांसमीटर phenotype के लिए विशिष्ट मार्कर के साथ न्यूरॉन्स में differentiates। Cholinergic न्यूरॉन्स आंतों का न्यूरॉन्स 7 की लगभग 60% शामिल है, और कोलीन acetyltransferase (चैट), उत्तेजक neurotransmitter acetylcholine के लिए synthesizing एंजाइम के लिए धुंधला से पता लगाया जा सकता है। ऐतिहासिक रूप से, कोलीनर्जिक न्यूरॉन्स केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी के प्रतिजन विशिष्टता भिन्न से चकित थे कल्पना करने के लिए प्रयास करता है (सीएनएस) 8-10 चैट परिधीय तंत्रिका तंत्र (पीएन) बनाम चैट। हालांकि, अपरा चैट के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी दोनों मध्य और परिधीय चैट 11-13 पहचान है, और हम visua के लिए अनुमति देते हैं कि हाल ही में वर्णित तकनीक हैउच्च संवेदनशीलता के साथ सत्ता कोलीनर्जिक न्यूरॉन्स की lization पहले विकास में चैट संवाददाता लाइनों के साथ 14 हासिल किया गया है।

यहाँ, हम, विदारक न्यूरॉन्स में सत्ता न्यूरोट्रांसमीटर अभिव्यक्ति कल्पना करने के लिए murine भ्रूण सैनिक पथ के फिक्सिंग और immunostaining के लिए एक तकनीक मौजूद है। निर्माण करने के लिए tdTomato जानवरों चैट-Cre; R26R: floxSTOP: इन अध्ययनों के लिए, हम R26R के साथ mated चैट-Cre चूहों का उपयोग किया है floxSTOP: (पांडुलिपि भर में चैट-Cre tdTomato के रूप में परिभाषित) tdTomato चूहों। इन जानवरों को फिर चैट अभिव्यक्ति 14 का पता लगाने कि फ्लोरोसेंट संवाददाताओं दोनों व्यक्त चूहों प्राप्त करने के लिए, समयुग्मक चैट-GFP संवाददाता चूहों के साथ mated किया गया। इन दो रिपोर्टर जानवरों एक C57BL / 6J पृष्ठभूमि पर हैं और व्यावसायिक रूप से (जैक्सन प्रयोगशालाओं, बार हार्बर, एमई) उपलब्ध हैं।

Protocol

विस्कॉन्सिन पशु की देखभाल और उपयोग समिति विश्वविद्यालय के सभी प्रक्रियाओं को मंजूरी दे दी। समाधान की 1. तैयारी विच्छेदन बफर और rinsing समाधान के रूप में 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) का प्रयो…

Representative Results

हम पहले चैट अभिव्यक्ति 14 का पता लगाने कि GFP और tdTomato फ्लोरोसेंट संवाददाताओं दोनों व्यक्त चूहों की पीढ़ी का वर्णन किया है। FloxSTOP: संक्षेप में, चैट-Cre चूहों R26R के साथ mated गया निर्माण करने के लिए tdTomato</e…

Discussion

हमारी प्रयोगशाला और दूसरों HSCR में आंतों दोष भी ganglionated छोटी आंत 5,15,16 में, aganglionic पेट के लिए प्रतिबंधित है, लेकिन proximally बढ़ाया नहीं कर रहे हैं कि पता चला है। इन परिवर्तनों सत्ता न्यूरोनल घनत्व और न्यूरोट्रां?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

इस काम अमेरिकन बाल चिकित्सा सर्जिकल एसोसिएशन फाउंडेशन अवार्ड (एजी) और स्वास्थ्य K08DK098271 के राष्ट्रीय संस्थान (एजी) bythe का समर्थन किया था।

Materials

Phosphate Buffered Saline Oxoid BR0014G
Sucrose Fisher S2
Sodium Azide Fisher BP9221
Bovine Serum Albumin Fisher BP1605
Triton X-100 Sigma X100
Paraformaldehyde Sigma 158127
60 mm Petri dishes Fisher FB0875713A
Fluorescence scope Nikon SMZ-18 stereoscope
Dissection microscope Nikon SMZ-18 stereoscope
Fine forceps Fine science tools 11252-20
1.5 mL Eppendorf tubes VWR 20170-038
Fluoromount-G SouthernBiotech, Birmingham, AL 0100-01
Glass slides Fisher 12-550-15
Cover glass VWR 16004-330
Confocal microscope Nikon Nikon A1
Nikon Elements Nikon

References

  1. Gershon, M. D. Developmental determinants of the independence and complexity of the enteric nervous system. Trends Neurosci. 33 (10), 446-456 (2010).
  2. Amiel, J., Sproat-Emison, E., et al. Hirschsprung disease, associated syndromes and genetics: a review. J Med Genet. 45 (1), 1-14 (2008).
  3. Erickson, C. S., Barlow, A. J., et al. Colonic enteric nervous system analysis during parenteral nutrition. J Surg Res. 184 (1), 132-137 (2013).
  4. Erickson, C. S., Zaitoun, I., Haberman, K. M., Gosain, A., Druckenbrod, N. R., Epstein, M. L. Sacral neural crest-derived cells enter the aganglionic colon of Ednrb(-/-) mice along extrinsic nerve fibers. J Comp Neurol. 20 (3), 620-632 (2011).
  5. Zaitoun, I., Erickson, C. S., et al. Altered neuronal density and neurotransmitter expression in the ganglionated region of Ednrb null mice: implications for Hirschsprung’s disease. Neurogastroenterol Motil. , (2013).
  6. Margolis, K. G., Stevanovic, K., et al. Enteric neuronal density contributes to the severity of intestinal inflammation. Gastroenterology. 141 (2), 588-598 (2011).
  7. Qu, Z. -. D., Thacker, M., Castelucci, P., Bagyánszki, M., Epstein, M. L., Furness, J. B. Immunohistochemical analysis of neuron types in the mouse small intestine. Cell Tissue Res. 334 (2), 147-161 (2008).
  8. Bian, X. -. C., Bornstein, J. C., Bertrand, P. P. Nicotinic transmission at functionally distinct synapses in descending reflex pathways of the rat colon. Neurogastroenterol Motil. 15 (2), 161-171 (2003).
  9. Johnson, C. D., Epstein, M. L. Monoclonal antibodies and polyvalent antiserum to chicken choline acetyltransferase. J Neurochem. 46 (3), 968-976 (1986).
  10. Tooyama, I., Kimura, H. A protein encoded by an alternative splice variant of choline acetyltransferase mRNA is localized preferentially in peripheral nerve cells and fibers. J Chem Neuroanat. 17 (4), 217-226 (2000).
  11. Koga, T., Bellier, J. -. P., Kimura, H., Tooyama, I. Immunoreactivity for Choline Acetyltransferase of Peripheral-Type (pChAT) in the Trigeminal Ganglion Neurons of the Non-Human Primate Macaca fascicularis. Acta histochemica et cytochemica. 46 (2), 59-64 (2013).
  12. Sang, Q., Young, H. M. The identification and chemical coding of cholinergic neurons in the small and large intestine of the mouse. Anat Rec. 251 (2), 185-199 (1998).
  13. Lei, J., Howard, M. J. Targeted deletion of Hand2 in enteric neural precursor cells affects its functions in neurogenesis, neurotransmitter specification and gangliogenesis, causing functional aganglionosis. Development (Cambridge, England). 138 (21), 4789-4800 (2011).
  14. Erickson, C. S., Lee, S. J., Barlow-Anacker, A. J., Druckenbrod, N. R., Epstein, M. L., Gosain, A. Appearance of cholinergic myenteric neurons during enteric nervous system development: comparison of different ChAT fluorescent mouse reporter lines. Neurogastroenterol Motil. 26 (6), 874-884 (2014).
  15. Teitelbaum, D. H., Caniano, D. A., Qualman, S. J. The pathophysiology of Hirschsprung’s-associated enterocolitis: importance of histologic correlates. J Pediatr Surg. 24 (12), 1271-1277 (1989).
  16. Aslam, A., Spicer, R. D., Corfield, A. P. Children with Hirschsprung’s disease have an abnormal colonic mucus defensive barrier independent of the bowel innervation status. J Pediatr Surg. 32 (8), 1206-1210 (1997).
  17. Puig, I., Champeval, D., De Santa Barbara, P., Jaubert, F., Lyonnet, S., Larue, L. Deletion of Pten in the mouse enteric nervous system induces ganglioneuromatosis and mimics intestinal pseudoobstruction. J Clin Invest. 119 (12), 3586-3596 (2009).

Play Video

Cite This Article
Barlow-Anacker, A. J., Erickson, C. S., Epstein, M. L., Gosain, A. Immunostaining to Visualize Murine Enteric Nervous System Development. J. Vis. Exp. (98), e52716, doi:10.3791/52716 (2015).

View Video