Murine आंतों का तंत्रिका प्रणाली विकास की कल्पना करने के Immunostaining
Summary
The enteric nervous system is formed by neural crest cells that proliferate, migrate and colonize the gut. Neural crest cells differentiate into neurons with markers specific for their neurotransmitter phenotype. This protocol describes a technique for dissecting, fixing and immunostaining of the murine embryonic gastrointestinal tract to visualize enteric nervous system neurotransmitter expression.
Abstract
The enteric nervous system is formed by neural crest cells that proliferate, migrate and colonize the gut. Following colonization, neural crest cells must then differentiate into neurons with markers specific for their neurotransmitter phenotype. Cholinergic neurons, a major neurotransmitter phenotype in the enteric nervous system, are identified by staining for choline acetyltransferase (ChAT), the synthesizing enzyme for acetylcholine. Historical efforts to visualize cholinergic neurons have been hampered by antibodies with differing specificities to central nervous system versus peripheral nervous system ChAT. We and others have overcome this limitation by using an antibody against placental ChAT, which recognizes both central and peripheral ChAT, to successfully visualize embryonic enteric cholinergic neurons. Additionally, we have compared this antibody to genetic reporters for ChAT and shown that the antibody is more reliable during embryogenesis. This protocol describes a technique for dissecting, fixing and immunostaining of the murine embryonic gastrointestinal tract to visualize enteric nervous system neurotransmitter expression.
Introduction
गतिशीलता, पोषक तत्व अवशोषण, और स्थानीय रक्त के प्रवाह को नियंत्रित करता है जो एक से कार्य आंतों का तंत्रिका तंत्र (सत्ता), जीवन 1 करने के लिए आवश्यक है। सत्ता, विस्थापित और वे गैन्ग्लिया युक्त न्यूरॉन्स और glial कोशिकाओं में अंतर जहां आंत, उपनिवेश पैदा करना है कि तंत्रिका शिखा कोशिकाओं (एनसीसी) द्वारा बनाई है। हिर्स्चस्प्रुंग रोग (मनुष्य में HSCR, ऑनलाइन मेंडेलियाई भाग), 1 4000 में जीवित जन्मों की एक घटना के साथ एक multigeneic जन्मजात विकार, बाधित सत्ता गठन के अध्ययन के लिए prototypic रोग माना जा सकता है। HSCR में एनसीसी की ओर पलायन और बाहर का पश्चांत्र 2 के चर लंबाई उपनिवेश स्थापित करने में विफल। साथ ही, दूसरे आम जठरांत्र (सैनिक) ऐसे anorectal विकृतियां, आंतों atresias, और गतिशीलता विकार के रूप में बाल चिकित्सा आबादी में विकास संबंधी दोषों, बुनियादी सत्ता कार्यों में गड़बड़ी के साथ जुड़े रहे हैं, और संभावना सूक्ष्म, underappreciated, शारीरिक परिवर्तन और कार्यात्मक परिवर्तन के साथ जुड़े रहे हैंसत्ता 3-6। इसलिए, हमें सत्ता गठन की विकासात्मक निर्धारकों को समझने के लिए अनुमति देते हैं कि तकनीक रोगजनन और बाल चिकित्सा सैनिक पथ विकारों के संभावित उपचार पर प्रकाश डाला सकता है।
प्रवास और उपनिवेशन के बाद, एनसीसी उनके न्यूरोट्रांसमीटर phenotype के लिए विशिष्ट मार्कर के साथ न्यूरॉन्स में differentiates। Cholinergic न्यूरॉन्स आंतों का न्यूरॉन्स 7 की लगभग 60% शामिल है, और कोलीन acetyltransferase (चैट), उत्तेजक neurotransmitter acetylcholine के लिए synthesizing एंजाइम के लिए धुंधला से पता लगाया जा सकता है। ऐतिहासिक रूप से, कोलीनर्जिक न्यूरॉन्स केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी के प्रतिजन विशिष्टता भिन्न से चकित थे कल्पना करने के लिए प्रयास करता है (सीएनएस) 8-10 चैट परिधीय तंत्रिका तंत्र (पीएन) बनाम चैट। हालांकि, अपरा चैट के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी दोनों मध्य और परिधीय चैट 11-13 पहचान है, और हम visua के लिए अनुमति देते हैं कि हाल ही में वर्णित तकनीक हैउच्च संवेदनशीलता के साथ सत्ता कोलीनर्जिक न्यूरॉन्स की lization पहले विकास में चैट संवाददाता लाइनों के साथ 14 हासिल किया गया है।
यहाँ, हम, विदारक न्यूरॉन्स में सत्ता न्यूरोट्रांसमीटर अभिव्यक्ति कल्पना करने के लिए murine भ्रूण सैनिक पथ के फिक्सिंग और immunostaining के लिए एक तकनीक मौजूद है। निर्माण करने के लिए tdTomato जानवरों चैट-Cre; R26R: floxSTOP: इन अध्ययनों के लिए, हम R26R के साथ mated चैट-Cre चूहों का उपयोग किया है floxSTOP: (पांडुलिपि भर में चैट-Cre tdTomato के रूप में परिभाषित) tdTomato चूहों। इन जानवरों को फिर चैट अभिव्यक्ति 14 का पता लगाने कि फ्लोरोसेंट संवाददाताओं दोनों व्यक्त चूहों प्राप्त करने के लिए, समयुग्मक चैट-GFP संवाददाता चूहों के साथ mated किया गया। इन दो रिपोर्टर जानवरों एक C57BL / 6J पृष्ठभूमि पर हैं और व्यावसायिक रूप से (जैक्सन प्रयोगशालाओं, बार हार्बर, एमई) उपलब्ध हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
हमारी प्रयोगशाला और दूसरों HSCR में आंतों दोष भी ganglionated छोटी आंत 5,15,16 में, aganglionic पेट के लिए प्रतिबंधित है, लेकिन proximally बढ़ाया नहीं कर रहे हैं कि पता चला है। इन परिवर्तनों सत्ता न्यूरोनल घनत्व और न्यूरोट्रां?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम अमेरिकन बाल चिकित्सा सर्जिकल एसोसिएशन फाउंडेशन अवार्ड (एजी) और स्वास्थ्य K08DK098271 के राष्ट्रीय संस्थान (एजी) bythe का समर्थन किया था।
Materials
| Phosphate Buffered Saline | Oxoid | BR0014G | |
| Sucrose | Fisher | S2 | |
| Sodium Azide | Fisher | BP9221 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher | BP1605 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| 60 mm Petri dishes | Fisher | FB0875713A | |
| Fluorescence scope | Nikon | SMZ-18 stereoscope | |
| Dissection microscope | Nikon | SMZ-18 stereoscope | |
| Fine forceps | Fine science tools | 11252-20 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | VWR | 20170-038 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech, Birmingham, AL | 0100-01 | |
| Glass slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Cover glass | VWR | 16004-330 | |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon A1 | |
| Nikon Elements | Nikon |
References
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