Immunostaining Per visualizzare Murine enterico nervoso Sistemi Di Sviluppo
Summary
The enteric nervous system is formed by neural crest cells that proliferate, migrate and colonize the gut. Neural crest cells differentiate into neurons with markers specific for their neurotransmitter phenotype. This protocol describes a technique for dissecting, fixing and immunostaining of the murine embryonic gastrointestinal tract to visualize enteric nervous system neurotransmitter expression.
Abstract
The enteric nervous system is formed by neural crest cells that proliferate, migrate and colonize the gut. Following colonization, neural crest cells must then differentiate into neurons with markers specific for their neurotransmitter phenotype. Cholinergic neurons, a major neurotransmitter phenotype in the enteric nervous system, are identified by staining for choline acetyltransferase (ChAT), the synthesizing enzyme for acetylcholine. Historical efforts to visualize cholinergic neurons have been hampered by antibodies with differing specificities to central nervous system versus peripheral nervous system ChAT. We and others have overcome this limitation by using an antibody against placental ChAT, which recognizes both central and peripheral ChAT, to successfully visualize embryonic enteric cholinergic neurons. Additionally, we have compared this antibody to genetic reporters for ChAT and shown that the antibody is more reliable during embryogenesis. This protocol describes a technique for dissecting, fixing and immunostaining of the murine embryonic gastrointestinal tract to visualize enteric nervous system neurotransmitter expression.
Introduction
Un funzionamento del sistema nervoso enterico (ENS), che controlla la motilità, l'assorbimento dei nutrienti, e il flusso sanguigno locale, è essenziale per la vita 1. L'ENS è formata da cellule della cresta neurale (NCC) che proliferano, migrano e colonizzano l'intestino, dove si differenziano in gangli contenente neuroni e cellule gliali. Malattia di Hirschsprung (HSCR, online eredità mendeliana in Man), una malattia congenita multigeneic con un'incidenza di 1 su 4.000 nati vivi, può essere considerato il prototipo per lo studio della malattia formazione ENS perturbato. In HSCR, NCC non riescono a migrare verso e colonizzare lunghezze variabili del hindgut distale 2. Inoltre, altro gastrointestinale comune (GI) difetti di sviluppo nella popolazione pediatrica, come le malformazioni anorettali, atresie intestinali e disturbi della motilità sono associati a disturbi nelle funzioni di base ENS, e sono probabilmente associate a sottili, sottovalutati, alterazioni anatomiche e cambiamenti funzionaliENS 3-6. Pertanto, le tecniche che ci permettono di capire le determinanti dello sviluppo della formazione dell'ENS possano far luce sulla patogenesi e potenziale trattamento dei disturbi del tratto gastrointestinale in età pediatrica.
Dopo la migrazione e la colonizzazione, NCC differenzia in neuroni con marcatori specifici per il loro fenotipo neurotrasmettitore. Neuroni colinergici comprendono circa il 60% dei neuroni enterici 7, e possono essere rilevate mediante colorazione per la colina acetiltransferasi (ChAT), l'enzima di sintesi per il neurotrasmettitore acetilcolina eccitatorio. Storicamente, i tentativi di visualizzare i neuroni colinergici sono stati confusi da diverse specificità antigenica di anticorpi diretti contro il sistema nervoso centrale (SNC) Discuti contro il sistema nervoso periferico (SNP) ChAT 8-10. Tuttavia, gli anticorpi diretti contro placentare ChAT riconoscere sia centrale che periferico ChAT 11-13, e noi abbiamo le tecniche recentemente descritte che permettono di visualizzazione di ENS neuroni colinergici ad alta sensibilità in precedenza in sviluppo che è stato raggiunto con chat line giornalista 14.
Qui vi presentiamo una tecnica per dissezione, fissaggio e immunostaining del tratto GI murino embrionale visualizzare espressione neurotrasmettitore ENS nei neuroni. Per questi studi, abbiamo utilizzato topi ChAT-Cre accoppiate con R26R: animali tdTomato per produrre chat Cre; R26R:: floxSTOP topi tdTomato (definiti come chat Cre tdTomato tutto il manoscritto): floxSTOP. Questi animali sono stati poi accoppiati con omozigoti topi reporter chat-GFP, per ottenere topi che esprimono entrambi giornalisti fluorescenti che consentono di rilevare l'espressione ChAT 14. Questi due animali giornalista sono su uno sfondo C57BL / 6J e sono disponibili in commercio (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME).
Protocol
Representative Results
Discussion
Il nostro laboratorio e altri hanno dimostrato che i difetti intestinali in HSCR non sono limitati al colon agangliare ma esteso prossimalmente, anche nel piccolo intestino ganglionated 5,15,16. Queste alterazioni sono cambiamenti nella ENS neuronale densità e neurotrasmettitore fenotipo e possono rappresentare dismotilità che è stata osservata nei pazienti con HSCR. Abbiamo utilizzato le tecniche di cui sopra nei nostri sforzi per comprendere le determinanti della formazione ENS. In particolare, queste te…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato bythe americana Pediatric Surgical Association Foundation Award (AG) e il National Institutes of Health K08DK098271 (AG).
Materials
| Phosphate Buffered Saline | Oxoid | BR0014G | |
| Sucrose | Fisher | S2 | |
| Sodium Azide | Fisher | BP9221 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher | BP1605 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| 60 mm Petri dishes | Fisher | FB0875713A | |
| Fluorescence scope | Nikon | SMZ-18 stereoscope | |
| Dissection microscope | Nikon | SMZ-18 stereoscope | |
| Fine forceps | Fine science tools | 11252-20 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | VWR | 20170-038 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech, Birmingham, AL | 0100-01 | |
| Glass slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Cover glass | VWR | 16004-330 | |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon A1 | |
| Nikon Elements | Nikon |
References
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