쥐 장내 신경 시스템 개발을 시각화하는 면역 염색
Summary
The enteric nervous system is formed by neural crest cells that proliferate, migrate and colonize the gut. Neural crest cells differentiate into neurons with markers specific for their neurotransmitter phenotype. This protocol describes a technique for dissecting, fixing and immunostaining of the murine embryonic gastrointestinal tract to visualize enteric nervous system neurotransmitter expression.
Abstract
The enteric nervous system is formed by neural crest cells that proliferate, migrate and colonize the gut. Following colonization, neural crest cells must then differentiate into neurons with markers specific for their neurotransmitter phenotype. Cholinergic neurons, a major neurotransmitter phenotype in the enteric nervous system, are identified by staining for choline acetyltransferase (ChAT), the synthesizing enzyme for acetylcholine. Historical efforts to visualize cholinergic neurons have been hampered by antibodies with differing specificities to central nervous system versus peripheral nervous system ChAT. We and others have overcome this limitation by using an antibody against placental ChAT, which recognizes both central and peripheral ChAT, to successfully visualize embryonic enteric cholinergic neurons. Additionally, we have compared this antibody to genetic reporters for ChAT and shown that the antibody is more reliable during embryogenesis. This protocol describes a technique for dissecting, fixing and immunostaining of the murine embryonic gastrointestinal tract to visualize enteric nervous system neurotransmitter expression.
Introduction
운동성, 영양소 흡수 및 지방 혈액 흐름을 제어 작동 장용 신경계 (ENS)는, 생명에 필수적 일 것이다. ENS는 마이그레이션 그들이 신경 함유 신경 세포와 신경 교세포로 분화 장을, 식민지 증식 신경 능선 세포 (NCC)에 의해 형성된다. 히 르츠 프룽의 질병 (남자 HSCR, 온라인 멘델의 유전 법칙), 1 4,000에서 출산의 빈도와 multigeneic 선천성 장애, 중단 ENS 형성을 연구의 전형 질병으로 간주 될 수있다. HSCR에서 NCC는 마이그레이션 및 말초 hindgut 2의 가변 길이를 식민지화하는 데 실패. 또한, 다른 일반적인 위장 (GI) 등의 항문 직장 기형, 장 atresias 및 운동 장애와 소아의 발달 결함, 기본 ENS 기능의 장애와 연관되고, 가능성이 미묘한, 과소, 해부학 적 변화와 기능적 변화와 관련이있다ENS 3-6. 따라서, 우리는 ENS 형성의 발달 결정을 이해 할 수 있도록 기술은 병인과 소아 위장관 질환의 치료 가능성을 밝혀 수 있습니다.
마이그레이션 및 식민지에 따라, NCC는 신경 전달 물질의 표현형에 대한 특정 마커 신경 세포로 분화. 콜린성 뉴런 장용성 뉴런 (7)의 대략 60 %를 포함하고, 콜린 아세틸 트랜스퍼 라제 (하는 ChAT), 흥분성 신경 전달 물질 인 아세틸 콜린 (acetylcholine)에 대한 합성 효소에 대한 염색하여 검출 할 수있다. 역사적으로, 콜린성 신경 세포가 중추 신경계에 대한 항체의 항원 특이성을 달리하여 혼동하고 시각화하는 시도 (CNS)는 8 ~ 10 채팅 말초 신경계 (PNS) 대 채팅. 그러나 태반 채팅에 대한 항체 모두 중추 및 말초하는 ChAT 11-13을 인식, 우리는 visua 수 있도록 최근에 설명 된 기술을 가지고고감도 ENS의 콜린성 뉴런의 사용 효율 초기 개발에서 채팅 기자 라인 (14) 달성되었다보다.
여기서는, 해부 뉴런 ENS 신경 전달 물질의 발현을 시각화 뮤린 배아 위장관 고정 및 면역 염색을위한 방법을 제시한다. 생산 tdTomato 동물 채팅-Cre 호텔을, R26R을 : floxSTOP :이 연구를 위해, 우리는 R26R와 성관계 간담 Cre 호텔 쥐를 활용 한 floxSTOP : (원고를 통해 간담 Cre 호텔 tdTomato로 정의) tdTomato 마우스. 이들 동물은 다음 식 (14)하는 ChAT를 검출 형광 리포터를 모두 발현하는 마우스를 얻기 위해, 호모 간담 GFP 리포터 생쥐와 교배시켰다. 이 두 기자 동물 C57BL / 6J 배경에 있습니다 상업적 (잭슨 연구소, 바 하버, ME)을 사용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리의 실험실과 다른 사람은 HSCR의 장 결함도 ganglionated 소장 5,15,16에, aganglionic 콜론으로 제한하지만 근위 확장되지 않는 것으로 나타났습니다. 이러한 변화는 ENS 신경 세포 밀도와 신경 전달 물질 표현형의 변화를 포함 HSCR 환자에서 관찰 된 운동 장애에 대해 설명 할 수있다. 우리는 ENS 형성의 결정을 이해하는 우리의 노력에 위의 기술을 활용했다. 구체적으로는, 이들 기술은 신경 산화…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 미국 소아 외과 협회 재단 상 (AG) 및 건강 K08DK098271의 국립 연구소 (AG) bythe 지원되었다.
Materials
| Phosphate Buffered Saline | Oxoid | BR0014G | |
| Sucrose | Fisher | S2 | |
| Sodium Azide | Fisher | BP9221 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher | BP1605 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| 60 mm Petri dishes | Fisher | FB0875713A | |
| Fluorescence scope | Nikon | SMZ-18 stereoscope | |
| Dissection microscope | Nikon | SMZ-18 stereoscope | |
| Fine forceps | Fine science tools | 11252-20 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | VWR | 20170-038 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech, Birmingham, AL | 0100-01 | |
| Glass slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Cover glass | VWR | 16004-330 | |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon A1 | |
| Nikon Elements | Nikon |
References
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