Introduction
تعديل الكوليني من الدائرة استثارة يساهم في الجوانب الأساسية للمعرفة، وتغيير التشكيل الكوليني هو سمة من سمات اضطرابات الاعصاب والعصبية والنفسية بما في ذلك مرض الزهايمر ومرض باركنسون والفصام والإدمان 1-4. آلية المتبعة في تسهيل الكوليني من انتقال متشابك في الجهاز العصبي المركزي هي عن طريق تفعيل مباشر من nAChRs المحلية في مواقع ما قبل متشابك. تفعيل هذه المستقبلات ما قبل متشابك يؤدي إلى زيادة الكالسيوم داخل الخلايا 2+ ([كا 2+] ط) في محطات ما قبل متشابك - سواء بصورة مباشرة، وذلك بسبب تصرف الكالسيوم عالية نسبيا لبعض الأنواع الفرعية nAChR، وبشكل غير مباشر، عبر إشارات بين الخلايا شلالات 5، وبالتالي تعزيز الإفراج العصبي. في الواقع، وقد تم ربط تفعيل nAChRs قبل متشابك مع التغيرات في الإفراج عن مجموعة واسعة من الناقلات العصبية بما في ذلك الغلوتامات، GABA، أدن تشافيز، لالثاني الدوبامين 10/06. وإن كان قد درس هذه العملية بصورة غير مباشرة باستخدام الطرق الكهربية في مختلف نقاط الاشتباك العصبي، للصحفيين البصري [كا 2+] ط وإعادة تدوير حويصلة متشابك تسمح بمزيد من القياس المباشر والدقيق زمنيا للظواهر ما قبل متشابك.
وقد ثبت التعريب قبل متشابك من nAChRs مقنع مع وضع العلامات المناعية الذهب مباشرة من nAChRs في مجهرية الإلكترون (EM) مستوى 11،12. كما تم استخدام عدة تقنيات أخرى للتصدي لتوطين nAChR غير مباشرة، بما في ذلك الكشف عن مواقع nAChRs subunit- الوهم بروتين فلوري في الخلايا العصبية مثقف 13،14، تسجيل الكهربية من التيارات nAChR في محطات متشابك 15،16، رصد النيكوتين الناجم عن التغيرات في [كا 2+] أنا في النهايات العصبية متشابك بواسطة التصوير الحي الخلية 17، والرصد غير المباشر لإطلاق النواقل العصبية في محطة متشابك من قبلتقنيات التصوير الخلية الحية مع مؤشرات الفلورية، بما في ذلك إيماس من الحويصلات المشبكية ينظر إليها من قبل styryl الأصباغ متقابلة الزمر FM (FM1-43 وFM4-64) و / أو synapto-pHluorin وللصحفيين العصبي الفلورسنت معين، مثل CNiFERs لأدن تشافيز وiGluSnFr لالغلوتامات 18-20. عموما، هذه المناهج الحالية لتحديد توطين ما قبل متشابك من nAChRs معقدة، وتتطلب أنظمة وتقنيات خاصة للسماح تحديد موثوقة ورصد الفسيولوجية للنشاط قبل متشابك.
نحن هنا وصف البروتوكولات ومعدات للنظام المشترك الثقافة في المختبر من قرن آمون البطني (vHipp) - النواة المتكئة (تحقق نموا مطردا) الدائرة التي توفر الوصول المباشر إلى تحديد وتحليل كل المكونات السابقة واللاحقة متشابك من انتقال متشابك. وتبين لنا أمثلة على توطين ما قبل متشابك من nAChRs والتصوير الخلية الحية من nAChR بوساطة كا 2+ الإشارات وإطلاق الناقلات العصبية منظمة العمل العربيةالمحاور نانوغرام vHipp. A امتدادا طبيعيا (واضحة) من بروتوكول المعروضة هنا هو إعداد الاتصالات قبل وبعد متشابك تتألف من الخلايا العصبية من الأنماط الجينية المختلفة. بهذه الطريقة يمكن تقييم مساهمة منتج جين معين إلى ما قبل و / أو آليات ما بعد متشابك التشكيل مباشرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأجريت التجارب على الحيوانات فقط وفقا للمعاهد القومية للصحة الدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (NIH النشر رقم 80-23، منقحة 2012) وتمت الموافقة على الدراسات التي المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام لجان البحث في ستوني جامعة بروك (# 1618 و # 1792).
1. vHipp-تحقق نموا مطردا متشابك المشارك الثقافات
- الفئران التضحية (يوم بعد الولادة 0-3، من النوع البري (WT) أو nAChRs α7 خط الماوس المعدلة وراثيا) مع CO 2. قطع رأس كل الجرو وحفظ الذيل في أنبوب 1.5 مل الطرد المركزي لمدة رجعي التنميط الجيني. قم بتنفيذ الخطوات التالية في غطاء تعقيمها.
- إزالة الجزء العلوي من الجمجمة مع مقص وملقط لفضح الدماغ كله. بدءا من المرحلة حيث قشرات الدماغ جزء من كل caudally أخرى، الحصول على قسم الاكليلية التي تحتوي على القشور الخلفي بما في ذلك vHipp 5،21 تشريح تحت المجهر.
- تشريح الخامسشرائح الأنسجة هيب تحتوي المنطقة CA1-مرفد وفقا لوضع أطلس مخ الفأر 22 (الشكل 1A). نقل إلى صحن الثقافة 35 ملم تحتوي على وسائل الإعلام ثقافة الباردة (4 ° C)، مقطعة إلى شرائح رقيقة صغيرة (حوالي 100 ميكرون × 100 ميكرون microslices).
- قبل احتضان 12 مم بولي-D-يسين / coverslips الزجاج المطلي laminin داخل 24 جيدا لوحات زراعة الأنسجة مع وسائل الإعلام الثقافة (~ 500 ميكرولتر) لمدة 30 دقيقة على الأقل في الحاضنة عند 37 درجة مئوية. إزالة وسائل الاعلام قبل الطلاء microslices.
- لوحة مع ماصة باستير مصقول النار على مركز للساترة مع الحد الأدنى من وسائل الإعلام (~ 50 ميكرولتر، التي تحتوي على ~ 20 قطعة من microslices) لتسهيل الحجز على إإكسبلنتس. لوحة microslices vHipp القادمة من حيوان واحد (إما + / + أو - / - التركيب الوراثي للخط α7 المعدلة وراثيا) على كل ساترة.
- بعد تسوية لل explants على ساترة، إضافة بلطف وسائط إضافية (~ 100 ميكرولتر) من خلال الالجدار ه بحيث أن مستوى وسائل الإعلام مرتفع بما يكفي لتغطية كامل لل explants على المحيط، ولكن ليس تلك في وسط ساترة.
- بعد O / N الحضانة في 37 ° C، 5٪ CO 2 الحاضنة، تفريق الخلايا العصبية تحقق نموا مطردا من أيام الجنينية 18 إلى ما بعد الولادة يوم 1 الفئران WT وإضافة إلى إإكسبلنتس.
- تشريح خارج الأنسجة تحقق نموا مطردا وفقا لوضع أطلس مخ الفأر 20 (الشكل 1B).
- مقطعة إلى قطع صغيرة (حوالي 500 ميكرون × 500 ميكرون microslices) ونقل إلى أنبوب 15 مل.
- علاج مع 0.25٪ التربسين (2 مل) لمدة 15 دقيقة عند 37 ° C. غسل قطع الأنسجة ثلاث مرات مع وسائل الاعلام غسل الباردة (5 مل، 4 ° C)، يليه غسل واحد في وسائل الإعلام ثقافة البارد (5 مل، 4 ° C). تسمح تعليق للراحة لمدة 5 دقائق في كل خطوة غسل، ثم تخلصي من طاف بعناية.
- فصل الخلايا عن طريق سحن لطيف في 2 مل من وسائل الإعلام الثقافة مع ماصة باستير طفيفة مصقول النار.
- عبرتعليق خلية فر إلى أنبوب آخر 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في 2000 دورة في الدقيقة س لمدة 5 دقائق. إزالة طاف و resuspend الخلايا في وسائل الإعلام الثقافة في 1 مل لكل 6 الجراء. تفريق الخلايا عن طريق pipetting بلطف في وسائل الإعلام عدة مرات مع باستور ماصة مصقول النار.
- إضافة 0.25 مل من الخلايا تحقق نموا مطردا انتشروا في كل ساترة مع إإكسبلنتس vHipp.
- الحفاظ على الثقافات في ترطيب 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 الحاضنة. وضع لوحات الثقافة على المبلل منصات شاش معقم لتحقيق الاستقرار ميكانيكيا والحفاظ على الرطوبة، وتسهيل تشكيل المشبك.
2. سيتولوجية مناعية
- إصلاح الثقافات (5-7 أيام في المختبر) في بارافورمالدهيد 4٪ / 4٪ سكروز / PBS (~ 500 ميكرولتر في ساترة، 20 دقيقة، RT).
- ثقافات Permeabilize مع 0.25٪ تريتون X-100 / PBS (~ 500 ميكرولتر في ساترة، 5 دقائق، RT).
- ثقافات كتلة مع 10٪ مصل حمار عادي في برنامج تلفزيوني (~ 500 ميكرولتر في ساترة، 30 دقيقة، RT) قبل antibodذ تلطيخ. احتضان مع الأجسام المضادة الأولية O / N عند 4 درجات مئوية. استخدام الأجسام المضادة الأولية التالية: nAChRs المضادة (α 4 -ECD 1: 500، مضادة للα 5 وحدات فرعية، 1: 500)، نقل الغلوتامات مكافحة حويصلي 1 (1: 250)، ومكافحة GAD65 (1: 100).
- يغسل الأجسام المضادة الأولية خارجا مع PBS (3 مرات / ~ 500 ميكرولتر في ساترة، 5 دقائق) ثم احتضان الثقافات في الأجسام المضادة الثانوية مترافق لاليكسا 488 (~ 500 ميكرولتر في ساترة، 1: 500) أو اليكسا 594 (~ 500 ميكرولتر في ساترة ، 1: 500) لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية.
- احتضان الثقافات في αBgTx مترافق لاليكسا 594 (~ 500 ميكرولتر في ساترة، 1: 1000 في وسائل الإعلام الثقافة) لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية قبل التثبيت لوضع العلامات α7 سطح * nAChRs.
- جبل وختم coverslips.
- التقاط الصور مع المجهر مضان مجهزة أهداف الخطة-امزيغ (20X مع 0.8 NA أو 63X النفط مع 1.4 NA) وكاميرا CCD.
3. FM1-43 القائم الحويصلي فيوجن
- الحفاظ على الثقافات (5-7 أيام في المختبر) في غرفة التصوير، جبل الغرفة على الغزل القرص المجهر متحد البؤر. يروي باستمرار (1 مل / دقيقة) مع HBS كوكتيل في RT.
- وقف نضح وتحميل الثقافات مع 10 ميكرومتر FM1-43 في 56 ملي K + ACSF (~ 500 ميكرولتر) لمدة 90 ثانية (تلوين)، وغسل صبغ الخارجي بعيدا لمدة 15 دقيقة مع الكالسيوم 2+ HBS مجانية تحتوي على ADVASEP-7 (0.1 ملم) لكنس بغشاء FM1-43.
- تحفيز الثقافات مع 56 ملي K + ACSF (~ 500 ميكرولتر) دون FM1-43 لمدة 120 ثانية (destaining)، تحميل الثقافات مع FM1-43 باستخدام نفس الظروف، ويغسل مرة أخرى مع الكالسيوم 2+ HBS مجانية تحتوي على ADVASEP-7 ل 15 دقيقة.
- الحصول FM1-43 الصور مضان مع القرص الغزل المجهر متحد البؤر مجهزة هدف خطة-امزيغ (60X المياه مع 1.4 NA، الإثارة 488 نانومتر، وانبعاث 530 نانومتر) والتقاط الصور مع كاميرا CCD.
- جمع الأساس الصور FM1-43 مضان (كل 2 ثانية لمدة 1 دقيقة) كما تحكم مسبقا النيكوتين. تطبيق النيكوتين (1 ميكرومتر) من خلال نضح السريع (2 مل / دقيقة) لمدة 1 دقيقة، ثم يغسل النيكوتين خارجا مع HBS كوكتيل. إبقاء الوقت الفاصل بين الصور التقاط قبل وأثناء وبعد التطبيق النيكوتين كل 2 ثانية لمدة 5 دقائق.
- تحديد FM1-43 كثافة مضان قبل (F تلطيخ) وبعد (F destaining) تطبيق النيكوتين في كل حبة متشابك.
- حساب المبلغ الإجمالي من نشره مضان FM1-43 على طول المحاور vHipp عن طريق قياس الفرق من FM1-43 كثافة مضان قبل وبعد تطبيق النيكوتين (ΔF = F تلطيخ -F destaining). تحليل جزء من انخفاض كثافة مضان بعد النيكوتين مع المعادلة التالية: F = انخفاض٪ ΔF / F تلطيخ.
4. التصوير الكالسيوم
- شطف الثقافات (5-7 أيام في المختبر) بسرعة مع HBS العادية، ثم تحميل الثقافات مع 5 ميكرومتر فلوو-4 كا 2+ مؤشر (AM استر) و 0.02٪ Pluronic F-127 في HBS (2 مل) لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية و CO 2 5٪.
- تغسل فلوو-4 حل مع HBS (3 مرات / 5 دقائق). عودة الثقافات إلى الحاضنة (37 ° C / 5٪ CO 2) لمدة 30 دقيقة على الأقل.
- الحفاظ على الثقافات في نفس غرفة التصوير ونفس الشروط كما هو موضح في FM1-43 مقرها قسم الانصهار الحويصلي (راجع الخطوة 3.1).
- جمع الصور فلوو-4 مضان من التوقعات محور عصبي من vHipp شرائح صغيرة مع هدف الخطة-امزيغ (60X المياه مع 1.4 NA، الإثارة 488 نانومتر، وانبعاث 530 نانومتر) وكاميرا CCD.
- جمع الأساسية فلوو-4 صور مضان (كل 10 ثانية لمدة 2 دقيقة) عن السيطرة قبل النيكوتين، وتطبيق النيكوتين (1 ميكرومتر) من خلال نضح السريع (2 مل / دقيقة) لمدة 1 دقيقة، ثم يغسل النيكوتين خارجا مع HBS كوكتيل. إبقاء الوقت الفاصل بين الصور التقاط قبل وأثناء وبعد التطبيق النيكوتين كل 10 ثانية لمدة 30 دقيقة.
- حفظ جميع الأطر من الخام فلوو-4 صور مضان والتصدير على شكل سلسلة منصور تنسيق TIFF لمزيد من التحليل.
- جمع شدة متكاملة من فلوو-4 مضان على طول المحاور vHipp قبل وبعد تطبيق النيكوتين.
- تطبيع كثافة مضان متكاملة مع المعادلة التالية: ΔF / F 0 = (FF 0) / F 0، حيث F 0 هو قبل النيكوتين كثافة مضان متكامل لتصحيح الخلفية وF هو كثافة مضان متكاملة على طول المحاور vHipp في كل نقطة زمنية بعد تطبيق النيكوتين. تحليل ورسم تطبيع كثافة مضان متكاملة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
إعداد العاملين يتكون من جينات خيالية شارك الثقافات الدوائر vHipp-تحقق نموا مطردا في المختبر. التوقعات الصادرة عن microslices vHipp، كمدخل المحاور قبل متشابك، يمكن أن تجعل الاتصالات متشابك مع أهداف ما بعد متشابك، والخلايا العصبية تفرق من تحقق نموا مطردا. النيكوتين التي يسببها مستدام (≥ 30 دقيقة) تيسير انتقال glutamatergic من الخلايا العصبية تحقق نموا مطردا معصب vHipp محاور 21 والكالسيوم لفترات طويلة مما يدل على طول المحاور vHipp 5 عبر α7 قبل متشابك * nAChRs.
الشكل 1 يوضح مباشرة أن التوقعات من vHipp شرائح الصغرى هي glutamatergic (vGluT1 إيجابية) والتي تمت اتصالات مع المتفرقة GABAergic الخلايا العصبية الشوكية المتوسطة من تحقق نموا مطردا (GAD إيجابية، الشكل 1C، D). تم العثور على حد سواء α7 * وغير α7 nAChRs * (بما في ذلك α4 وα5 مفارز) على طول المحاور vHipp (الشكل 1E-G) وتحديدا في مواقعحيث تشير الإسقاطات vHipp الاتصال الخلايا العصبية تحقق نموا مطردا. تجدر الإشارة إلى أن الخلايا العصبية متفرقة من تحقق نموا مطردا لا تعبر عن nAChRs * α7 (الشكل 1H)؛ أي تجمعات مستقبلات في الاتصالات بشكل صارم قبل المشبكي (الشكل 1I)، وأيضا انظر الشكل 1 في المرجع 5.
مرة واحدة وقد تم تأسيس خيالية المشترك الثقافات، والتصوير المباشر ل[كا 2+] أنا ومتشابك الحويصلات الانصهار على طول المحاور vHipp مع و / أو بدون النيكوتين يمكن أن تسجل لمدة تصل إلى 30 دقيقة دون أي ضرر واضح على الخلايا العصبية.
وتظهر الصور التمثيلية والأفلام الوقت الفاصل بين وquantifications لالناجم عن النيكوتين فلوو-4 [كا 2+] ط يشير على طول المحاور vHipp في الشكل 2 والتكميلي الفيلم 1 و 2. لقد وجدنا أن تفعيل vHipp nAChRs بواسطة الحث النيكوتين يستمر كاليفورنيا 2+ تدفق إلى المحاور قبل متشابك (الشكل 2A، D). المرحلة مستدامةالنيكوتين الناجم عن الزيادات في [كا 2+] ط يشير على طول المحاور vHipp ارتدت من α7 محددة * nAChR خصم αBgTx ولكن ليس من قبل غير α7 * nAChR خصم DHβE (الشكل 2A-C).
وقد استخدم التصوير المباشر التي تعتمد على النشاط FM1-43 صبغ الإلتقام وإيماس لمراقبة قبل المشبكي بشكل غير مباشر الإفراج العصبي 23، 24، وهنا تظهر الصور التمثيلية والكمي لالناجم عن النيكوتين الانصهار حويصلي على طول المحاور vHipp التي تصور FM1-43 في الشكل 3 (3A الشكل، C). وجود α7 قبل متشابك * مطلوب nAChRs لأقصى النيكوتين الناجم عن الانصهار الحويصلة وإطلاق الناقلات العصبية (الشكل 3B، C).
الشكل 1. متشابك ثقافة مشتركة من vHipp مع تحقق نموا مطردا يسمح examinatioن التعريب قبل متشابك من nAChRs. (AC) الكرتون تخطيطي في المختبر الدوائر النمط الجيني محددة (C) بواسطة الطلاء منفصل من بطني الحصين / مرفد (A) التي أعدت. شرائح من الفردية WT أو α7 - / - الخلايا العصبية الماوس وتفرقوا من WT النواة المتكئة (B). عبد القدير، قناة (سلفيوس)؛ DG، التلفيف المسنن، MM، وسطي نواة الثديية؛ PMCo، خلفي إنسي نواة القشرية اللوزية، الترددات اللاسلكية، شق أنفي، FMI، ملقط صغير من الجسم الثفني، LV، البطين الجانبي، تو، الحديبة الشمية؛ VP ، الشاحبة بطني. microslices (D) vHipp تمديد vGluT1 إيجابية (أحمر) التوقعات محور عصبي أن الاتصال GAD65 الإيجابي (الأخضر) الخلايا العصبية تحقق نموا مطردا (السهام البيضاء هي أمثلة على تلك المواقع الاتصال). شريط النطاق: 10 ميكرون (E.وترد -G) الميكروسكوب التمثيلية للمحاور WT vHipp (تلطيخ مع vGluT1 والأخضر) لα4 * nAChR (E)، α5 * nAChR (F) وα7 سطح * nAChR (G) تلطيخ في مجموعات الحمراء (السهام البيضاء). شريط النطاق: 5 ميكرون (H) لا توجد α7 سطح * مجموعات nAChR على الخلايا العصبية GABAergic تفرقوا (GAD65 إيجابية) من تحقق نموا مطردا وحدها (I) الأحمر "مجموعات" من α7 سطح * nAChR (السهام البيضاء) يمكن أن ينظر إليه في تلك الخلايا العصبية تفرق شارك في تربيتها مع microslices vHipp. شريط النطاق: 5 ميكرون الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. متشابك ثقافة مشتركة من vHipp مع تحقق نموا مطردا يسمح فحص النيكوتين التي يسببها إشارة الكالسيومجي على طول المحاور vHipp. (A) التمثيلية فلوو-4 صور من الكالسيوم ملزمة فلوو-4 في الزائفة مقياس اللون على طول محور عصبي WT vHipp قبل (أعلى)، 1 '(الشرق)، و 30 "(القاع) بعد تطبيق النيكوتين. يتم التخلص من مرحلة مستمرة (30 ') من التي يسببها النيكوتين الكالسيوم 2+ استجابة إضافة α7 * nAChR خصم انتقائي αBgTx (100 نيوتن متر) (B)، ولكن ليس عن طريق إضافة غير α7 * nAChR خصم انتقائي DHβE (1 ميكرومتر) (C). شريط النطاق: 5 ميكرومتر (D) قطعة التمثيلية للتطبيع فلوو-4 كثافة مضان متكاملة من حي محور عصبي WT vHipp مع perfused النيكوتين (1 ميكرومتر) لمدة 1 دقيقة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. متشابك ثقافة مشتركة من vHipp مع تحقق نموا مطردا يسمح فحص النيكوتين التي يسببها حويصلي الإفراج العصبي (مع FM1-43) على طول المحاور vHipp. (A) صور الممثل من المحاور WT vHipp (محملة FM1-43 والأخضر) قبل (أعلى) وبعد (أسفل) تطبيق النيكوتين. (B) صور الممثل من المحاور WT vHipp (محملة FM1-43، سابقة التجهيز مع α7 * nAChR خصم انتقائي αBgTx لمدة 15 دقيقة) قبل (أعلى) وبعد (أسفل) تطبيق النيكوتين. شريط النطاق: 5 ميكرون (C) ويظهر القياس الكمي للتغيرات في محور عصبي FM1-43 مضان (F النقص) بعد العلاج النيكوتين في غياب (WT) أو وجود (WT + αBgTx) من α7 * nAChR خصم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الفيلم التكميلي 1: الوقت الفاصل بين التصوير المباشر لالقاعدية فلوو-4 / كا 2+ مضان على طول المحاور vHipp.
تم الحصول على الصور الوقت الفاصل بين من فلوو-4 / كا 2+ مضان على طول المحاور vHipp مع 60X عدسة المياه موضوعية كل 10 ثانية لمدة 30 دقيقة مع المجهر الغزل القرص مبائر. وأشار الصور المكتسبة على مقياس اللون الزائفة ولعب مرة أخرى كفيلم في 2 لقطة في الصورة. ويبين هذا الفيلم الأساس من فلوو-4 / كا 2+ النشاط مضان على طول العيش WT vHipp محور عصبي مع perfused HBS كوكتيل.
الفيلم التكميلي 2: الوقت الفاصل بين التصوير الحي من النيكوتين التي يسببها يستمر فلوو-4 / كا 2+ مضان على طول المحاور vHipp.
تم الحصول على الصور الوقت الفاصل بين من فلوو-4 / كا 2+ مضان على طول المحاور vHipp مع 60X عدسة المياه موضوعية كل 10 ثانية لمدة 30 دقيقة مع المجهر الغزل القرص مبائر. وأشار الصور المكتسبة على مقياس اللون الزائفة ولعب مرة أخرى كفيلم في 2 لقطة في الثانية. ويبين هذا الفيلم النيكوتين (1 ميكرومتر، perfused لفي في نقطة زمنية 43، جرفت مع HBS كوكتيل في نقطة زمنية 49) التي يسببها فلوو-4 / كا 2+ النشاط مضان على طول العيش WT vHipp محور عصبي. زيادة الطلب على النيكوتين فلوو-4 / كا كثافة 2+ مضان على طول المحاور vHipp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وصف إعداد شارك في ثقافة إعادة يستسلم بطني الدوائر قرن آمون-المتكئة في المختبر. هذا الفحص تصاريح إعداد بسيط نسبيا ويمكن الاعتماد عليها لمحات المكانية والزمانية التي تفعيل nAChRs قبل متشابك تنتزع تعزيز نقل glutamatergic 5، 21.
يتم تعريف المشترك الثقافات باعتبارها نمو مختلف أنواع معينة من الخلايا في صحن واحد التي يمكن أن توفر الظروف الفسيولوجية في المختبر لإظهار في الجسم الحي تشبه وظيفة. أدخلت التقليدية الخلايا العصبية، الخلايا العصبية المشترك الثقافات للبحوث علم الأعصاب لدراسة التفاعلات متشابك بين أنواع مختلفة من الخلايا. ومع ذلك، فإنه من الصعب تحديد ما قبل وما بعد المواقع من نقاط الاشتباك العصبي في هذه الثقافات المشترك. هذا البروتوكول الخلايا العصبية المشارك ثقافة فصل microslice يسمح التعرف بسهولة على المحاور قبل متشابك وأهداف ما بعد المشبكية. باستخدام microslices من مناطق الدماغ المختلفة سو خط الماوس المعدلة وراثيا معربا عن البروتينات الفلورية مختلفة، وهذا البروتوكول يمكن أن تستخدم أيضا لدراسة التفاعلات محور عصبي محور عصبي.
الخطوة الحاسمة لهذه الخلايا العصبية نأت microslice بروتوكول الثقافة شارك في هو توفير بيئة مستقرة للسماح الحجز على إإكسبلنتس، وثمرة من التوقعات وتشكيل نقاط الاشتباك العصبي. الطلاء وmicroslices في حجم الحد الأدنى من وسائل الإعلام والحفاظ على لوحات ثقافة على المبلل منصات شاش معقم هما الخطوات الرئيسية لمرفق microslice وتشكيل المشبك. القيد الرئيسي من هذا البروتوكول شارك في الثقافة هو أن الخلايا العصبية تحقق نموا مطردا لا تفرق كل شكل نقاط الاشتباك العصبي وظيفية مع المحاور vHipp.
عن طريق تغيير التركيب الوراثي للمكونات متشابك قبل وبعد، ويوفر هذا المستحضر نهج إعلامي لدراسة الآليات السابقة واللاحقة متشابك من اللدونة متشابك. ثلاث سمات مميزة لهذا المستحضر تجعله مثاليا لهذه الدراسات. المخ صegions التي ترتبط عادة في الجسم الحي عبر مسارات الألياف التي لا يمكن الحفاظ عليها، أو تحديدها بسهولة في شرائح الحادة، ويمكن الجمع بين في هذا الإعداد في المختبر. قبل ومكونات ما بعد متشابك تأتي من الفئران مختلفة تجعل السماح تغيير مستقل إما قبل أو التركيب الوراثي بعد متشابك. بواسطة الطلاء مكونات ما قبل وما بعد متشابك في أوقات مختلفة، فمن الممكن للتعبير عن الجينات بشكل انتقائي الخارجية سواء في مرحلة ما قبل أو الخلايا العصبية بعد متشابك.
النيكوتين يتسبب الكالسيوم 2+ العابرين (بالثواني لمجموعة دقيقة) من خلال تفعيل قد ذكرت في الخلايا العصبية مثقف، النجمية nAChRs وفي العديد من خطوط الخلايا التي تعبر عن nAChRs 25-27. ومع ذلك، فإن معظم هذه الدراسات لم يكشف الآثار الطويلة الأجل (أكثر من 10 دقيقة) من وقت قصير التعرض النيكوتين إلى حد كبير بسبب الضرر الصورة أثناء التصوير على المدى الطويل. باستخدام بروتوكول ثقافة المذكورة أعلاه وسريع الغزل قرص جمع الصور مبائر،النيكوتين التي يسببها الكالسيوم 2+ الإشارات، متشابك الانصهار الحويصلة وإطلاق الغلوتامات يمكن أن تسجل لمدة تصل إلى 1 ساعة بدون أي ضرر واضح على الخلايا العصبية (الفيلم التكميلي 1، 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Culture Media (50 ml) | |||
| Neurobasal | GIBCO | 10888022 | 48 ml |
| B-27 Supplements | GIBCO | 0080085-SA | 1 ml |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 10908-010 | 0.5 ml |
| GlutaMAX Supplement | GIBCO | 35050-061 | 0.5 ml |
| Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | GIBCO | 15140-122 | 20 ng/ml |
| 2. washing media (HBSS, 100 ml) | |||
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | GIBCO | 14175-095 | 99 ml |
| HEPES ( 1M) | GIBCO | 15630-130 | 1 ml |
| 3. HEPES buffered saline (HBS) pH=7.3 | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | 135 mM |
| KCl | Sigma | P9333 | 5 mM |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | 1 mM |
| CaCl2, | Sigma | C1016 | 2 mM |
| HEPES | Sigma | H3375 | 10 mM |
| Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |
| 4. HBS Cocktail for live imaging pH=7.3 | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | 135 mM |
| KCl | Sigma | P9333 | 5 mM |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | 1 mM |
| CaCl2, | Sigma | C1016 | 2 mM |
| HEPES | Sigma | H3375 | 10 mM |
| Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |
| tetrodotoxin | Tocris | 1078 | 2 µM |
| bicuculline | Tocris | 131 | 10 µM |
| D-AP-5 | Tocris | 105 | 50 µM |
| CNQX | Tocris | 1045 | 20 µM |
| LY341495 | Tocris | 1209 | 10 µM |
| 5. Calcium-free HBS pH=7.3 | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | 135 mM |
| KCl | Sigma | P9333 | 5 mM |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | 1 mM |
| HEPES | Sigma | H3375 | 10 mM |
| Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |
| 6. 56 mM Potassium ACSF pH=7.4 | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | 119 mM |
| KCl | Sigma | P9333 | 56 mM |
| MgSO4.7H | Sigma | M1880 | 1.3 mM |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | 2.5 mM |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | 1 mM |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | 26.2 mM |
| Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |
References
- Changeux, J. P., et al. Brain nicotinic receptors: structure and regulation, role in learning and reinforcement. Brain Res Brain Res Rev. 26 (2-3), 198-216 (1998).
- Levin, E. D. Nicotinic receptor subtypes and cognitive function. J Neurobiol. 53 (4), 633-640 (2002).
- Dani, J. A., Bertrand, D. Nicotinic acetylcholine receptors and nicotinic cholinergic mechanisms of the central nervous system. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 47, 699-729 (2007).
- Mineur, Y. S., Picciotto, M. R. Nicotine receptors and depression: revisiting and revising the cholinergic hypothesis. Trends Pharmacol Sci. 31 (12), 580-586 (2010).
- Zhong, C., Talmage, D. A., Role, L. W. Nicotine elicits prolonged calcium signaling along ventral hippocampal axons. PloS one. 8 (12), e82719 (2013).
- McGehee, D. S., Heath, M. J., Gelber, S., Devay, P., Role, L. W. Nicotine enhancement of fast excitatory synaptic transmission in CNS by presynaptic receptors. Science. 269 (5231), 1692-1696 (1995).
- Gray, R., Rajan, A. S., Radcliffe, K. A., Yakehiro, M., Dani, J. A. Hippocampal synaptic transmission enhanced by low concentrations of nicotine. Nature. 383 (6602), 713-716 (1996).
- Dickinson, J. A., Kew, J. N., Wonnacott, S. Presynaptic alpha 7- and beta 2-containing nicotinic acetylcholine receptors modulate excitatory amino acid release from rat prefrontal cortex nerve terminals via distinct cellular mechanisms. Mol Pharmacol. 74 (2), 348-359 (2008).
- Zappettini, S., Grilli, M., Salamone, A., Fedele, E., Marchi, M. Pre-synaptic nicotinic receptors evoke endogenous glutamate and aspartate release from hippocampal synaptosomes by way of distinct coupling mechanisms. Br J Pharmacol. 161 (5), 1161-1171 (2010).
- Zappettini, S., et al. Presynaptic nicotinic alpha7 and non-alpha7 receptors stimulate endogenous GABA release from rat hippocampal synaptosomes through two mechanisms of action. PloS one. 6 (2), e16911 (2011).
- Fabian-Fine, R., et al. Ultrastructural distribution of the alpha7 nicotinic acetylcholine receptor subunit in rat hippocampus. J Neurosci. 21 (20), 7993-8003 (2001).
- Jones, I. W., Barik, J., O'Neill, M. J., Wonnacott, S. Alpha bungarotoxin-1.4 nm gold: a novel conjugate for visualising the precise subcellular distribution of alpha 7* nicotinic acetylcholine receptors. J Neurosci Methods. 134 (1), 65-74 (2004).
- Nashmi, R., et al. Assembly of alpha4beta2 nicotinic acetylcholine receptors assessed with functional fluorescently labeled subunits: effects of localization, trafficking, and nicotine-induced upregulation in clonal mammalian cells and in cultured midbrain neurons. J Neurosci. 23 (37), 11554-11567 (2003).
- Drenan, R. M., et al. Subcellular trafficking, pentameric assembly, and subunit stoichiometry of neuronal nicotinic acetylcholine receptors containing fluorescently labeled alpha6 and beta3 subunits. Mol Pharmacol. 73 (1), 27-41 (2008).
- Wu, J., et al. Electrophysiological, pharmacological, and molecular evidence for alpha7-nicotinic acetylcholine receptors in rat midbrain dopamine neurons. J Pharmacol Exp Ther. 311 (1), 80-91 (2004).
- Parikh, V., Ji, J., Decker, M. W., Sarter, M. Prefrontal beta2 subunit-containing and alpha7 nicotinic acetylcholine receptors differentially control glutamatergic and cholinergic signaling. J Neurosci. 30 (9), 3518-3530 (2010).
- Nayak, S. V., Dougherty, J. J., McIntosh, J. M., Nichols, R. A. Ca(2+) changes induced by different presynaptic nicotinic receptors in separate populations of individual striatal nerve terminals. J Neurochem. 76 (6), 1860-1870 (2001).
- Richards, C. I., et al. Trafficking of alpha4* nicotinic receptors revealed by superecliptic phluorin: effects of a beta4 amyotrophic lateral sclerosis-associated mutation and chronic exposure to nicotine. J Biol Chem. 286 (36), 31241-31249 (2011).
- Colombo, S. F., Mazzo, F., Pistillo, F., Gotti, C. Biogenesis, trafficking and up-regulation of nicotinic ACh receptors. Biochem Pharmacol. 86 (8), 1063-1073 (2013).
- St John, P. A. Cellular trafficking of nicotinic acetylcholine receptors. Acta Pharmacol Sin. 30 (6), 656-662 (2009).
- Zhong, C., et al. Presynaptic type III neuregulin 1 is required for sustained enhancement of hippocampal transmission by nicotine and for axonal targeting of alpha7 nicotinic acetylcholine receptors. J Neurosci. 28 (37), 9111-9116 (2008).
- Jacobowitz, D. M., Abbott, L. C. Chemoarchitectonic Atlas of the Developing Mouse Brain. , CRC Press. New York. (1998).
- Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. J Neurosci. 12 (2), 363-375 (1992).
- Amaral, E., Guatimosim, S., Guatimosim, C. Using the fluorescent styryl dye FM1-43 to visualize synaptic vesicles exocytosis and endocytosis in motor nerve terminals. Methods Mol Biol. 689, 137-148 (2011).
- Garduno, J., et al. Presynaptic alpha4beta2 nicotinic acetylcholine receptors increase glutamate release and serotonin neuron excitability in the dorsal raphe nucleus. J Neurosci. 32 (43), 15148-15157 (2012).
- Guo, J. Z., Liu, Y., Sorenson, E. M., Chiappinelli, V. A. Synaptically released and exogenous ACh activates different nicotinic receptors to enhance evoked glutamatergic transmission in the lateral geniculate nucleus. J Neurophysiol. 94 (4), 2549-2560 (2005).
- Szabo, S. I., Zelles, T., Vizi, E. S., Lendvai, B. The effect of nicotine on spiking activity and Ca2+ dynamics of dendritic spines in rat CA1 pyramidal neurons. Hippocampus. 18 (4), 376-385 (2008).
