Introduction
Modulation cholinergique du circuit excitabilité contribue à des aspects fondamentaux de la cognition, et la modulation cholinergique modifié est une caractéristique de neurodégénératives et neuropsychiatriques troubles y compris la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, la schizophrénie et la toxicomanie 1-4. Un mécanisme établi de la facilitation de la transmission synaptique cholinergique dans le SNC est via l'activation directe de nAChRs localisées sur des sites pré-synaptiques. L'activation de ces récepteurs pré-synaptiques entraîne une augmentation de Ca 2+ intracellulaire ([Ca2 +] i) dans les terminaux présynaptiques - à la fois directement, en raison de la conductance de calcium relativement élevé de certains sous-types de nAChR, et indirectement, par l'intermédiaire de cascades de signalisation intracellulaires 5, améliorant ainsi la libération de neurotransmetteurs. En effet, l'activation des nAChR pré-synaptiques a été liée à des changements dans la libération d'une grande variété de neurotransmetteurs, y compris le glutamate, GABA, acétylcholine, une dopamine 6-10. Bien que ce processus a été étudié indirectement en utilisant des méthodes électrophysiologiques à divers synapses, les journalistes optiques de [Ca 2+] i et vésicule synaptique recyclage permettent de mesurer plus directe et temporellement précise des phénomènes pré-synaptiques.
Localisation pré-synaptique de nAChR a été démontré de façon convaincante direct étiquetage immuno-or de nAChRs au microscope électronique (EM) de niveau 11,12. Plusieurs autres techniques ont également été utilisés pour traiter la localisation nAChR indirectement, y compris la détection de l'emplacement des chimères protéiques fluorescents de nAChR dans des neurones en culture 13,14, enregistrement électrophysiologique des courants nAChR dans les terminaux synaptiques 15,16, la surveillance des changements induits par la nicotine en [Ca 2+] i dans les terminaisons nerveuses synaptiques par imagerie de cellules vivantes 17, et la surveillance indirecte de la libération des neurotransmetteurs à la terminaison synaptique partechniques d'imagerie cellulaire en direct avec des indicateurs fluorescents, y compris l'exocytose des vésicules synaptiques vus par les colorants de styryle amphipathiques FM (FM1-43 et FM4-64) et / ou synapto-pHluorin et par des journalistes de neurotransmetteurs fluorescentes spécifiques, tels que CNiFERs pour ACh et iGluSnFr pour le glutamate 18-20. Globalement, ces approches actuelles pour identifier la localisation pré-synaptique de nAChRs sont complexes, et nécessitent des systèmes et des techniques spéciales pour permettre une identification fiable et surveillance physiologique de l'activité pré-synaptique.
Nous décrivons ici les protocoles et l'équipement pour un système de co-culture in vitro d'un hippocampe ventral (vHipp) - noyau accumbens (NACC) circuit qui offre un accès direct à identifier et analyser les deux composants pré et post-synaptiques de la transmission synaptique. Nous montrons des exemples de localisation pré-synaptique de nAChRs et l'imagerie des cellules vivantes de nAChR médiation Ca 2+ signalisation et de la libération de neurotransmetteurs aloaxones ng vHipp. Une extension naturelle (et simple) du protocole présenté ici est la préparation des contacts pré- et post-synaptiques constitués de neurones à partir de différents génotypes. De cette manière, la contribution d'un produit de gène particulier de la pré- et / ou post-synaptiques des mécanismes de modulation peut être évaluée directement.
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Protocol
Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les National Institutes of Health Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire (NIH Publications n ° 80-23, révisé 2012) et des études ont été approuvés par Institutional Animal Care et à utiliser pour les comités de recherche à Stony Brook University (# 1618 et # 1792).
1. vHipp ANCC synaptiques Co-cultures
- souris Sacrifice (jour postnatal 0 - 3, de type sauvage (WT) ou nAChRs α7 de ligne de souris transgénique) avec CO 2. Décapitez chaque chiot et enregistrer la queue dans un tube de 1,5 ml de centrifugeuse pour le génotypage post facto. Effectuez les étapes suivantes dans une hotte stérile.
- Retirez le sommet du crâne avec des ciseaux et des pinces pour exposer l'ensemble du cerveau. À partir de la jonction où les cortex cérébraux partie caudale de l'autre, d'obtenir une section coronale qui contient les cortex postérieur dont la vHipp 5,21 sous un microscope à dissection.
- Disséquer vBandes de tissu Hipp contenant la région CA1-subiculum selon un cerveau de souris en développement atlas 22 (figure 1A). Transfert à une boîte de culture de 35 mm contenant des milieux de culture froid (4 ° C), les couper en petites tranches minces (environ 100 um x 100 um de microslices).
- Pré-incuber 12 mm de poly-D-lysine / laminine lamelles de verre revêtu à l'intérieur 24 des plaques de culture de tissu avec un milieu de culture (~ 500 ul) pendant au moins 30 min à l'étuve à 37 ° C. Retirez le support avant l'étalement microslices.
- Plaque avec une pipette Pasteur polie au feu au centre de la lamelle avec une quantité minimale de médias (~ 50 pi, contenant ~ 20 morceaux de microslices) pour faciliter la fixation des explants. Plate microslices vHipp provenant d'un seul animal (soit le + / + ou - / - génotype de la ligne de α7 transgénique) sur chaque lamelle.
- Après les explants se déposent sur la lamelle, ajouter doucement les médias supplémentaires (~ 100 pi) par ee mur de sorte que le niveau des médias est suffisamment élevé pour couvrir complètement les explants sur la périphérie, mais pas ceux qui sont au centre de la lamelle.
- Après un O / N incubation dans 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur, disperser neurones embryonnaires CNAC de jours 18 en jour 1 souris WT postnatales et ajouter à des explants.
- Disséquer les tissus CNAC selon un développement du cerveau de la souris atlas 20 (figure 1B).
- Coupez-les en petits morceaux (environ 500 um x 500 um microslices) et transférer dans un tube de 15 ml.
- Traiter avec 0,25% de trypsine (2 ml) pendant 15 min à 37 ° C. Wash Les morceaux de tissus à trois reprises avec les médias de lavage à froid (5 ml, 4 ° C), suivie par un lavage dans des milieux de culture froide (5 ml, 4 ° C). Laisser la suspension reposer pendant 5 min dans chaque étape de lavage, puis versez le surnageant avec précaution.
- Dissocier les cellules par trituration ménagée dans 2 ml de milieux de culture avec une pipette Pasteur légèrement poli-le-feu.
- Transfer suspension cellulaire à un autre tube de 15 ml et on centrifuge à 2000 x rpm pendant 5 min. Retirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans des milieux de culture à 1 ml par 6 chiots. Disperser les cellules par pipetage dans les médias à plusieurs reprises avec une pipette Pasteur polie au feu.
- Ajouter 0,25 ml de cellules CNAC dispersées à chaque lamelle avec des explants vHipp.
- Maintenir les cultures dans une humidifié à 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur. Placez des plaques de culture sur des tampons de gaze stérile humide pour stabiliser mécaniquement et maintenir l'humidité, faciliter la formation des synapses.
2. Immunocytochemistry
- Fixer cultures (5 - 7 jours in vitro) en paraformaldéhyde 4% / 4% de saccharose / PBS (~ 500 pi par lamelle, 20 min, RT).
- Perméabiliser les cultures avec 0,25% de Triton X-100 / PBS (~ 500 ul par lamelle couvre-objet, 5 min, RT).
- cultures de bloc avec 10% de sérum âne normale dans PBS (~ 500 pi par lamelle, 30 min, RT) avant Antibody coloration. Incuber avec des anticorps primaires O / N à 4 ° C. Utiliser les anticorps primaires suivants: anti-nAChR (α 4 -ECD 1: 500; anti-sous-unités, α 5 1: 500), anti-glutamate transporteur vésiculaire 1 (1: 250), anti-GAD65 (1: 100).
- Laver les anticorps primaires avec du PBS (3 fois / ~ 500 ul par lamelle couvre-objet, 5 min) et ensuite incuber les cultures dans des anticorps secondaires conjugués à de l'Alexa 488 (~ 500 ul par une lamelle couvre-objet,: 500) ou Alexa 594 (~ 500 ul par lamelle couvre- , 1: 500) pendant 1 heure à 37 ° C.
- Incuber les cultures à αBgTx conjugué à Alexa 594 (~ 500 ul par une lamelle couvre-objet,: 1000 dans du milieu de culture) pendant 45 min à 37 ° C avant la fixation pour le marquage surface α7 nAChR *.
- Montage et de phoques lamelles.
- Capturez des images avec un microscope à fluorescence équipé d'objectifs Plan-Apochromat (20X avec 0,8 NA ou 63X huile avec 1,4 NA) et une caméra CCD.
3. FM1-43 Based vésiculeuse Fusion
- Maintenir cultures (5 - 7 jours in vitro) dans une chambre de l'imagerie, monter la chambre sur disque rotatif microscope confocal. Perfuser en continu (1 ml / min) avec HBS cocktail au RT.
- Arrêtez perfusion et de charge cultures avec 10 uM FM1-43 dans 56 mM K + ACSF (~ 500 pi) pendant 90 secondes (coloration), laver colorant externe distance pendant 15 min avec Ca 2+ HBS gratuit contenant ADVASEP-7 (0,1 mM) pour piéger FM1-43 liée à la membrane.
- Stimuler les cultures avec 56 mM K + ACSF (~ 500 pi) sans FM1-43 pendant 120 secondes (décoloration), rechargez cultures avec FM1-43 en utilisant les mêmes conditions, et lavez à nouveau avec Ca 2+ HBS gratuit contenant ADVASEP-7 pour 15 min.
- Acquérir FM1-43 images de fluorescence avec disque rotatif microscope confocal équipé d'un objectif Plan-Apochromat (60X eau avec 1,4 NA, excitation 488 nm, émission 530 nm) et de capturer des images avec une caméra CCD.
- Recueillir base d'images de fluorescence de FM1-43 (tous les 2 s pendant 1 min) Que le contrôle pré-nicotine; appliquer la nicotine (1 uM) par perfusion rapide (2 ml / min) pendant 1 min, puis laver la nicotine avec HBS cocktail. Gardez capture des images en accéléré avant, pendant, et après l'application de la nicotine toutes les 2 secondes pendant 5 min.
- Quantifier FM1-43 intensité de fluorescence avant (F de coloration) et après (F décoloration) l'application de la nicotine à chaque bouton synaptique.
- Calculer la quantité totale de fluorescence de FM1-43 amovible le long des axones vHipp en quantifiant la différence de FM1-43 intensité de fluorescence avant et après l'application de nicotine (AF = F -F coloration de décoloration). Analyser fraction de la diminution de l'intensité de fluorescence après la nicotine avec l'équation suivante: F% = diminution AF / F coloration.
4. Imagerie de calcium
- Rincer cultures (5 - 7 jours in vitro) rapidement avec HBS normale, puis charger cultures avec 5 uM Fluo-4 Ca 2+ indicateur (ester AM) et 0,02% de Pluronic F-127 dans du HBS (2 ml) pendant 30 min à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Laver Fluo-4 solution avec HBS (3 fois / 5 min). Retour cultures dans l'incubateur (37 ° C / 5% CO 2) pendant au moins 30 min.
- Maintenir les cultures dans la même chambre de l'imagerie et les mêmes conditions que celles décrites dans FM1-43 section de fusion vésiculaire à base (voir l'étape 3.1).
- Recueillir images Fluo-4 fluorescence des projections axonales des micro-tranches vHipp avec un objectif Plan-Apochromat (60X eau avec 1,4 NA, excitation 488 nm, émission 530 nm) et une caméra CCD.
- Recueillir base Fluo-4 images de fluorescence (toutes les 10 sec pendant 2 min) que le contrôle pré-nicotine, appliquer la nicotine (1 uM) par perfusion rapide (2 ml / min) pendant 1 min, puis laver la nicotine avec HBS cocktail. Gardez capture des images en accéléré avant, pendant, et après l'application de la nicotine toutes les 10 secondes pendant 30 min.
- Enregistrer tous les cadres des premières fluo-4 images de fluorescence, l'exportation comme une série deLes images au format TIFF pour pousser l'analyse.
- Recueillir l'intensité intégrée de fluo-4 fluorescence le long des axones vHipp avant et après l'application de la nicotine.
- Normaliser l'intensité de fluorescence intégrée avec l'équation suivante: AF / F 0 = (FF 0) / F 0, où F 0 est la pré-nicotine intensité de fluorescence intégrée de fond corrigé et F est l'intensité de fluorescence intégrée le long des axones vHipp à chaque point de temps après l'application de la nicotine. Analyser et tracer l'intensité de fluorescence intégrée normalisée.
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Representative Results
La préparation employée se compose de gènes chimère co-cultures de circuits vHipp ANCC in vitro. Projections émanant microslices vHipp, comme entrée axonale pré-synaptique, peuvent faire des contacts synaptiques avec les objectifs post-synaptiques, les neurones dispersés du CNAC. La nicotine induit une (≥ 30 min) la facilitation de la transmission glutamatergique soutenue à partir de neurones CNAC innervés par vHipp axones 21 et prolongée calcium signalisation le long des axones vHipp 5 via α7 pré-synaptique * nAChRs.
La figure 1 montre directement que les projections à partir des micro-tranches vHipp sont glutamatergique (VGLUT1 positif) et que des contacts sont pris avec les neurones épineux moyens dispersés GABAergiques du CNAC (GAD positif, figure 1C, D). * Les deux α7 et non-α7 nAChR * (y compris les sous-unités α4 et α5) ont été trouvés le long des axones vHipp (figure 1E-G) et en particulier sur les sitesoù les projections vHipp contacter neurones CNAC. Il convient de noter que les neurones dispersés du CNAC ne reflètent pas nAChRs * α7 (Figure 1H); dire les amas de récepteurs à contacts sont strictement présynaptique (Figure 1I), vous pouvez aussi consulter la Figure 1 dans la référence 5.
Une fois que les co-cultures chimériques ont été établis, l'imagerie en direct de [Ca 2+] i et synaptique vésicules fusion le long des axones vHipp avec et / ou sans la nicotine peut être enregistré pour un maximum de 30 minutes sans aucun dommage apparent pour les neurones.
Des images représentatives, des films et des quantifications time-lapse pour induite par la nicotine fluo-4 [Ca 2+] i signalisation le long des axones vHipp sont présentés dans la figure 2 et complémentaire Film 1 et 2. Nous avons trouvé que l'activation de vHipp nAChRs par la nicotine induit soutenue Ca 2+ afflux vers les axones pré-synaptiques (figure 2A, D). La phase soutenuedes augmentations de nicotine induit dans [Ca 2+] i signalisation le long des axones vHipp a été bloqué par le α7 nAChR antagoniste spécifique * αBgTx mais pas par le non-α7 nAChR * antagoniste DHβE (Figure 2A-C).
La visualisation directe de l'activité dépendant de colorant FM1-43 l'endocytose et l'exocytose a été utilisé pour contrôler la libération de neurotransmetteurs indirectement présynaptique 23, 24. Ici, des images représentatives et de quantification pour la fusion vésiculaire induite par la nicotine long des axones vHipp visualisées par FM1-43 sont présentés sur la figure 3 (figure 3A, C). La présence de pré-synaptique α7 nAChR * maximale est requise pour la fusion des vésicules induites par la nicotine et la libération de neurotransmetteurs (figure 3B, C).
Figure 1. Synaptic co-culture de vHipp avec CNAC permet examination de localisation pré-synaptique des nAChR. (AC) des vidéos schématique de circuits spécifiques au génotype in vitro (C) préparé par dépôt séparé de l'hippocampe ventral / subiculum (A). tranches de un ou WT α7 individuels - / - neurones souris et dispersées dans WT noyau accumbens (B). Aq, aqueduc (Sylvius); DG, gyrus denté; MM, médial noyau mamillaire; OCMP, noyau postéro-corticale amygdalien; rf, fissure rhinale, fmi, Pince mineure du corps calleux; LV, ventricule latéral; Tu, le tubercule olfactif; VP , pallidum. microslices (D) vHipp étendent VGLUT1 positif (rouge) projections axonales qui contactent GAD65 positive (vert) neurones CNAC (flèches blanches sont des exemples de ces points de contact). Barre d'échelle: 10 um (E.-G) Les micrographies représentatifs de axones WT vHipp (de coloration avec VGLUT1, vert) est indiqué pour α4 * nAChR (E), α5 * nAChR (F) et α7 de surface * nAChR (G) coloration en grappes rouges (flèches blanches). Barre d'échelle:.. 5 um (H) Il n'y a pas α7 de surface * grappes nAChR sur les neurones GABAergiques dispersées (GAD65 positif) du CNAC seul «clusters» (I) rouges de α7 de surface * nAChR (flèches blanches) peut être vu dans les neurones dispersés co-cultivées avec microslices vHipp. Barre d'échelle:. 5 pm S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Synaptic co-culture de vHipp avec CNAC permet l'examen de la nicotine induit signal calciquement le long des axones vHipp. (A) représentatifs fluo-4 images de calcium liés fluo-4 dans l'échelle de couleur le long d'un axone pseudo WT vHipp avant (Haut), 1 '(Moyen) et 30' (en bas) après l'application de la nicotine. La phase continue (30 ') de la réponse Ca2 + induite par la nicotine est éliminée par addition de la α7 nAChR * αBgTx antagoniste sélectif (100 nM) (B), mais pas par l'addition du non-α7 nAChR * antagoniste sélectif DHβE (1 uM) (C). Barre d'échelle: 5 um (D) Représentant du complot normalisée fluo-4 intensité de fluorescence intégré à partir d'un axone WT vHipp direct perfusé avec de la nicotine (1 uM) pendant 1 min.. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Synaptic co-culture de vHipp avec CNAC permet l'examen de la nicotine induit la libération de neurotransmetteurs vésiculaire (avec FM1-43) le long des axones vHipp. (A) des images représentatives des axones WT vHipp (chargés de FM1-43, vert) avant (en haut) et après (en bas) l'application de la nicotine. (B) Des images représentatives d'axones WT vHipp (chargés de FM1-43, prétraité avec α7 * nAChR antagoniste sélectif αBgTx pendant 15 min) avant (en haut) et après (en bas) l'application de la nicotine. Barre d'échelle:. 5 um (C) montre la quantification des changements dans axonale FM1-43 fluorescence (F diminution) après un traitement à la nicotine en l'absence (WT) ou en présence (WT + αBgTx) de la α7 nAChR * antagoniste. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Film supplémentaire 1: Time-lapse imagerie en direct de base Fluo-4 / Ca 2+ fluorescence le long des axones vHipp.
Les images time-lapse de Fluo-4 / Ca 2+ fluorescence le long des axones vHipp ont été acquis avec une lentille d'eau objectif 60x toutes les 10 secondes pendant 30 min avec un microscope confocal disque rotatif. Les images acquises sont indiquées sur l'échelle de couleurs pseudo et lues comme un film à 2 images par s. Ce film montre la ligne de base / Ca 2+ activité Fluo-4 de fluorescence le long vivent WT vHipp axone perfusé avec HBS cocktail.
Film supplémentaire 2: Time-lapse imagerie en direct de la nicotine induit soutenue Fluo-4 / Ca 2+ vHipp fluorescence le long des axones.
Les images time-lapse de Fluo-4 / Ca 2+ fluorescence le long des axones vHipp ont été acquis avec une lentille d'eau objectif 60x toutes les 10 secondes pendant 30 min avec un microscope confocal disque rotatif. Les images acquises sont indiquées sur l'échelle de couleurs pseudo et lues comme un film à 2 images par seconde. Ce film montre la nicotine (1 uM, perfusé dans au point 43 de temps, lavé avec HBS cocktail au point dans le temps 49) induit / Ca 2+ activité Fluo-4 de fluorescence le long vivent WT vHipp axone. La nicotine a augmenté la demande / Ca intensité fluo-4 2+ de fluorescence le long des axones vHipp.
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Discussion
La préparation de co-culture décrit re-capitule circuits de l'hippocampe-accumbens ventrales in vitro. Cet examen permet de préparation relativement simple et fiable des profils spatiaux et temporels qui activation des nAChR pré-synaptiques susciter améliorée transmission glutamatergique 5, 21.
Co-cultures sont définis comme la croissance de différents types de cellules spécifiques dans un plat qui peut fournir des conditions physiologiques in vitro pour démontrer vivo -comme fonction. Neurone-neurone co-cultures conventionnelles ont été introduites pour la recherche en neurosciences pour étudier les interactions synaptiques entre les différents types de cellules. Cependant, il est difficile d'identifier le pré et post-sites de synapses dans ces co-cultures. Ce protocole neurone co-culture MicroSlice dissocié permet une reconnaissance facile des axones pré-synaptiques et des cibles post-synaptiques. Utilisation microslices de différentes régions du cerveau olignée de souris transgéniques exprimant f différentes protéines fluorescentes, ce protocole peut également être utilisé pour étudier les interactions axone axone.
L'étape critique de ce neurones dissociés MicroSlice protocole de co-culture fournit un environnement stable pour permettre la fixation des explants, l'excroissance des saillies et la formation de synapses. Placage les microslices dans un volume minimal de milieu et le maintien des plaques de culture sur des tampons de gaze stérile amorties sont les deux étapes clés pour la fixation de MicroSlice et la formation des synapses. La principale limitation de ce protocole de co-culture est que les neurones CNAC pas tous dispersées forment des synapses fonctionnelles avec axones vHipp.
En modifiant le génotype des composants pré- et post-synaptiques, cette préparation offre une approche informative pour étudier les mécanismes de pré- et post-synaptiques de la plasticité synaptique. Trois caractéristiques distinctes de cette préparation, il est idéal pour ces études. r Brainégions qui sont normalement connectées in vivo par chemins de fibre qui ne peuvent être maintenues ou facilement identifiables en tranches aiguës, peuvent être combinés dans cette préparation in vitro. Pré- et post-synaptiques composants proviennent de différentes souris rendent permettant altération indépendante soit de la pré- ou post-synaptique génotype. En étalant des composants pré- et post-synaptiques à des moments différents, il est possible d'exprimer sélectivement les gènes exogènes soit dans le pré- ou neurones post-synaptiques.
La nicotine induit des transitoires de Ca2 + (en seconde gamme de minutes) par l'activation des nAChR ont été rapportés dans les neurones, les astrocytes en culture et dans plusieurs lignées cellulaires qui expriment des nAChR 25-27. Cependant, la plupart de ces études ne détecte pas les effets à long terme (plus de 10 min) de courte durée d'exposition en grande partie due à des lésions photo de la nicotine lors de l'imagerie à long terme. En utilisant le protocole de culture décrit ci-dessus et filage-disque rapide collection d'images confocale,la nicotine induit Ca 2+ signalisation, fusion des vésicules synaptiques et la libération de glutamate peuvent être enregistrés pour un maximum de 1 heure sans dommage apparent aux neurones (Movie supplémentaire 1, 2).
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Disclosures
Les auteurs ont rien à révéler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Culture Media (50 ml) | |||
| Neurobasal | GIBCO | 10888022 | 48 ml |
| B-27 Supplements | GIBCO | 0080085-SA | 1 ml |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 10908-010 | 0.5 ml |
| GlutaMAX Supplement | GIBCO | 35050-061 | 0.5 ml |
| Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | GIBCO | 15140-122 | 20 ng/ml |
| 2. washing media (HBSS, 100 ml) | |||
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | GIBCO | 14175-095 | 99 ml |
| HEPES ( 1M) | GIBCO | 15630-130 | 1 ml |
| 3. HEPES buffered saline (HBS) pH=7.3 | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | 135 mM |
| KCl | Sigma | P9333 | 5 mM |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | 1 mM |
| CaCl2, | Sigma | C1016 | 2 mM |
| HEPES | Sigma | H3375 | 10 mM |
| Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |
| 4. HBS Cocktail for live imaging pH=7.3 | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | 135 mM |
| KCl | Sigma | P9333 | 5 mM |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | 1 mM |
| CaCl2, | Sigma | C1016 | 2 mM |
| HEPES | Sigma | H3375 | 10 mM |
| Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |
| tetrodotoxin | Tocris | 1078 | 2 µM |
| bicuculline | Tocris | 131 | 10 µM |
| D-AP-5 | Tocris | 105 | 50 µM |
| CNQX | Tocris | 1045 | 20 µM |
| LY341495 | Tocris | 1209 | 10 µM |
| 5. Calcium-free HBS pH=7.3 | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | 135 mM |
| KCl | Sigma | P9333 | 5 mM |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | 1 mM |
| HEPES | Sigma | H3375 | 10 mM |
| Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |
| 6. 56 mM Potassium ACSF pH=7.4 | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | 119 mM |
| KCl | Sigma | P9333 | 56 mM |
| MgSO4.7H | Sigma | M1880 | 1.3 mM |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | 2.5 mM |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | 1 mM |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | 26.2 mM |
| Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |
References
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