Introduction
回路の興奮性のコリン作動性調節は、認知機能の基本的な側面に寄与し、変更されたコリン作動性の調節は、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症及び中毒1-4を含む神経変性及び精神神経疾患の特徴です。 CNSにおけるシナプス伝達のコリン作動性促進の確立メカニズムは、シナプス前部位に局在するのnAChRの直接の活性化を介してです。 、間接的に特定のnAChRサブタイプ、および比較的高いカルシウムコンダクタンスの両方に直接起因を介した細胞内シグナル伝達カスケード-これらのシナプス前受容体の活性化は細胞内Ca 2+（[Ca 2+] i） のシナプス前末端での増加につながります図5は 、それによって神経伝達物質の放出を増強します。実際には、シナプス前のnAChRの活性化は、グルタミン酸、GABA、アセチルコリンなどの神経伝達物質の多種多様の放出の変化と関連している、ANDドーパミン6-10。このプロセスは、様々なシナプスにおける電気生理学的方法を用いて、間接的に研究されてきたが、の光学記者の[Ca 2+] iとシナプス小胞のリサイクルは、前シナプス現象のより直接的かつ時間的に正確な測定を可能にします。
nAChR類の前シナプス局在は、電子顕微鏡（EM）レベル11,12でのnAChRの直接の免疫金標識で説得力が実証されています。いくつかの他の技術もまた、培養ニューロン13,14でのnAChR subunit-蛍光タンパク質キメラの位置を検出するなど、間接的のnAChR局在に対処するために使用されている、シナプス端子15,16でのnAChR電流の電気生理学的記録、[内のCaニコチン誘発変化を監視しますによるシナプスターミナルでのライブセルイメージング17、及び神経伝達物質の放出を間接的に監視することにより、シナプス神経終末における2+] i のスチリル両親媒性FM色素（FM1-43とFM4-64）および/またはsynapto-pHluorinによって、そのようなグルタミン酸のためのAChとiGluSnFrためCNiFERsなどの特定の神経伝達物質の蛍光の記者、によって見シナプス小胞のエキソサイトーシスを含む蛍光指示薬と生細胞イメージング技術、 18-20。全体的に、nAChR類の前シナプス局在を同定するため、これらの現在の手法は複雑であり、信頼性の高い同定とプレシナプス活性の生理学的モニタリングを可能にするために、特別なシステム及び技術を必要とします。
識別し、シナプス伝達のシナプス前および後の両方の成分を分析するための直接アクセスを提供し、側坐核（NACC）回路-ここでは、腹側海馬（vHipp） の in vitro共培養システムのためのプロトコルおよび装置が記載されています。我々は、シナプス前のnAChRの局在およびCa 2+シグナル伝達と神経伝達物質の放出ALO媒介のnAChRのライブセルイメージングの例を示しますNG vHipp軸索。ここで紹介するプロトコルの自然（と簡単な）拡張は、異なる遺伝子型からの神経細胞からなる前と後シナプスの接点の製造です。このように、変調の前および/または後シナプスメカニズムの特定の遺伝子産物の寄与を直接評価することができます。
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Protocol
全ての動物実験は、実験動物の管理と使用に関する健康ガイドの国立研究所に従って行った（NIH出版番号80から23は、2012年改訂）し、研究は施設内動物実験によって承認されたとストーニーの研究委員会のために使用しますブルック大学（＃1618と＃1792）。
1. vHipp-NACCシナプス共培養
- 犠牲マウス（生後0日-野生型（WT）またはα7nAChR類トランスジェニックマウスラインから3）CO 2を。各子犬の首をはねると事後遺伝子型決定のための1.5ミリリットル遠心管に尾を保存します。滅菌フードで次の手順を実行します。
- 脳全体を露出させるためにハサミやピンセットで頭蓋骨の上部を取り外します。互いに尾側からの大脳皮質の部分の接合部から開始して、解剖顕微鏡下vHipp 5,21を含む後部皮質が含まれている冠状断面を得ます。
- Vを分析発展途上のマウス脳アトラス22（ 図1A）によればCA1-海馬台領域を含むヒップ組織片。 （100ミクロンmicroslices×100ミクロン程度）の小さな薄いスライスにカット冷培地（4℃）を含む35mmの培養皿に移します。
- 37℃のインキュベーター内に少なくとも30分間、培地（〜500μl）を、24ウェル組織培養プレートの内側12ミリメートルポリ-D-リジン/ラミニン被覆カバーガラスをプレインキュベートします。 microslicesをメッキする前にメディアを取り出します。
- 外植片の付着を容易にするために（microslicesの〜20個を含む〜50μL、）メディアの最小量でカバースリップの中央に火造りパスツールピペットでプレート。 1匹の動物に由来するプレートvHippのmicroslices（どちらか+ / +または - / - トランスジェニックα7ラインの遺伝子型）各カバースリップ上。
- 外植片がカバースリップ上に沈降した後、静かに目によって追加メディア（〜100μl）を追加電子壁メディアのレベルは完全に周囲の外植片ではなく、カバースリップの中央にそれらをカバーするのに十分に高いようにします。
- 37℃でO / Nインキュベートした後、5％CO 2インキュベーター、生後1日目WTマウスに胚日18からNACCニューロンを分散させ、外植片に加えます。
- 発展途上のマウス脳アトラス20（ 図1B）に応じてNACC組織を解剖。
- （500ミクロンmicroslices×500ミクロン程度）を小片に切断し、15 mlチューブに移します。
- 37℃で15分間、0.25％トリプシン（2ml）で処理します。冷培地で1回洗浄（5 mlで4°C）、続いて冷洗浄培地（5 mlで4°C）での洗浄組織塊三回。サスペンションは、各洗浄工程における5分間の休憩、その後、上清を慎重に取り除くことを可能にします。
- 軽くファイアーポリッシュパスツールピペットで培養培地2mlに優しい粉砕して細胞を解離します。
- トランス5分間、2,000 X rpmでさらに15 mlチューブと遠心分離機に細胞懸濁液FER。上清を除去し、6子犬ごとに1 mlの培養培地で細胞を再懸濁します。穏やかファイアーポリッシュパスツールピペットで培地で数回ピペッティングして細胞を分散。
- vHipp移植片と各カバースリップに分散NACC細胞の0.25ミリリットルを追加します。
- 加湿37℃、5％CO 2インキュベーター内で培養を維持します。機械的にシナプス形成を促進する、湿度を安定して維持するために、湿らせた滅菌ガーゼパッド上に培養プレートを置きます。
2.免疫細胞化学
- 4％パラホルムアルデヒド/ 4％スクロース/ PBS（カバースリップあたり〜500μL、20分、RT）における- （in vitroで 7日5）文化を修正しました。
- 0.25％トリトンX-100 / PBSで透過処理培養（〜カバースリップあたり500μL、5分、RT）。
- 不格好なやつの前に、PBS中の10％正常ロバ血清（カバースリップあたり〜500μL、30分、RT）でブロック文化Y染色。 4℃でO / N一次抗体でインキュベートします。 、抗小胞性グルタミン酸トランスポーター1（1：250）、抗GAD65（1：100）：;：抗nAChR類（抗α5サブユニット、1 500 500α4 -ECD 1：）以下の一次抗体を使用してください。
- PBSで一次抗体を洗浄（カバースリップあたり3回/〜500μL、5分間）した後、アレクサ488（カバースリップあたり〜500μlを、1：500）に結合した二次抗体で培養インキュベートまたはアレクサ594（カバースリップあたり〜500μLを、1：37℃で1時間、500）。
- 標識前表面α7*のnAChRのための固定を37℃で45分間：（培地1,000〜カバースリップあたり500μlの、1）のAlexa 594にコンジュゲートαBgTxで培養をインキュベートします。
- マウントとシールカバースリップ。
- プランアポクロマート対物レンズ（NA 0.8または1.4 NAの63X油で20X）を備えた蛍光顕微鏡とCCDカメラで画像をキャプチャします。
3. FM1-43ベースの水疱性の融合
- ディスク共焦点顕微鏡を紡糸上室マウント、撮像チャンバ内に- （in vitroで 7日、5）の文化を維持します。連続RTでHBSカクテル（1ml /分）灌流。
- 90秒間の56 mMのK + ACSF（〜500μL）（染色）で10μMのFM1-43で灌流し、負荷の文化を停止、のCa 2+ ADVASEP-7（0.1 mm）を含む無HBSで15分間離れて外部染料を洗います膜結合FM1-43を除去します。
- 、120秒（脱色）のためにFM1-43ずに56 mMのK + ACSF（〜500μL）と文化を刺激するのと同じ条件を用いて、FM1-43と文化を再ロード、およびCaで再び洗浄2+のためADVASEP-7を含む無HBS 15分。
- （1.4 NA、励起488 nmの発光530 nmのと60X水）プランアポクロマート対物レンズを搭載した回転ディスク共焦点顕微鏡でFM1-43の蛍光画像を取得し、CCDカメラで画像をキャプチャします。
- 1分間のベースラインFM1-43蛍光画像（2秒ごとに集めます）プリニコチンコントロールとして; 1分間の急速な灌流（2 ml /分）によってニコチン（1μM）を適用し、アウトHBSカクテルでニコチンを洗います。 5分ごとに2秒の間、およびニコチン適用後に、前にキャプチャタイムラプス画像を保管してください。
- （F 染色 ）の前に、各シナプスブートンにおける（F 脱色 ）ニコチン適用後FM1-43の蛍光強度を定量化します。
- ニコチンアプリケーション（ΔF= F 染色 -Fの脱色 ）の前と後のFM1-43蛍光強度の差を定量化することによってvHipp軸索に沿って解放可能FM1-43蛍光の総量を計算します。次式を有するニコチン後の蛍光強度の減少の割合を分析：F 減少 ％=ΔF/ F 染色 。
4.カルシウムイメージング
- 次に、（5μMのFluo-4のCa 2+指示薬と文化を読み込む、通常のHBSで迅速- （in vitroで 7日5）文化をすすぎますAMエステル）、37℃で30分間、5％CO 2のためにHBSで0.02％プルロニックF-127（2ml）中。
- HBSとのFluo-4溶液（3回/ 5分）洗い流します。 （37℃/ 5％CO 2）は、少なくとも30分間インキュベーターに文化を返します。
- 同じ撮像チャンバーとFM1-43ベース小胞の融合の項に記載と同様の条件で培養を維持する（ステップ3.1を参照してください）。
- プランアポクロマート対物レンズ（1.4 NAの60X水、励起488 nmの発光530 nm）をCCDカメラでvHippマイクロスライスから軸索突起のフルオ4蛍光画像を収集します。
- 1分間の急速な灌流（2 ml /分）によってニコチン（1μM）を適用、事前ニコチンコントロールとして、ベースラインのFluo-4の蛍光画像（2分10秒ごと）を採取し、アウトHBSカクテルでニコチンを洗います。 30分ごとに10秒の間、およびニコチン適用後に、前にキャプチャタイムラプス画像を保管してください。
- 一連の生のfluo-4の蛍光画像、輸出のすべてのフレームを保存さらなる分析のためのTIFF形式の画像。
- ニコチン適用前と後のvHipp軸索に沿ってFLUO-4の蛍光の積分強度を収集します。
- ΔF/ F F 0は、バックグラウンド補正前ニコチン積分蛍光強度であり、Fは、各時点におけるvHipp軸索に沿って統合された蛍光強度が0 =（FF 0）/ F 0、以下の式を有する集積蛍光強度を正規化ニコチン適用後。正規化された統合された蛍光強度を分析し、プロットします。
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Representative Results
採用製剤は、 インビトロで vHipp-NACC回路の遺伝子キメラ共培養物から構成されています。 vHippのmicroslicesから発せられる投影は、前シナプスの軸索の入力として、シナプス後の目標、NACCから分散ニューロンとシナプス接触を行うことができます。ニコチンはvHipp軸索21とシナプス前α7を介しvHipp軸索5に沿ってシグナリング長期化カルシウム*のnAChRにより神経支配NACCニューロンからのグルタミン酸伝達の持続（≥30分）円滑化を誘導しました。
図1は、vHippマイクロスライスから突起がグルタミン酸（VGLUT1正）であることを直接示し、接点がNACC（GAD正、 図1C、D）から分散GABA作動性中型有棘ニューロンで作られています。 α7*と（α4及びα5サブユニットを含む）非α7* nAChR類はvHipp軸索（ 図1E-G）に沿って、具体的に現場で発見された両方ここvHippの突起がNACCニューロンにお問い合わせください。これは、NACCから分散ニューロンはα7* nAChR類（ 図1H）を発現しないことに留意すべきです。すなわち接点での受容体クラスターは、厳密に（ 図1I）シナプス前である、また、文献5の図1を参照してください。
キメラ共培養が確立されると、ニューロンへの明らかな損傷を与えることなく、最大30分間記録することができ、および/ またはニコチンを含まないで、のライブイメージングは、の[Ca 2+] iとシナプスはvHipp軸索に沿って融合小胞。
ニコチン誘発性FLUO-4のための代表的な画像、タイムラプスムービーや定量の[Ca 2+] i の vHipp軸索に沿ってシグナリングは、 図2及び補足ムービー1及び2に示されている。我々は、ニコチン誘発によるvHippのnAChRの活性化は、Caを維持していることがわかっシナプス前軸索へ2+流入（ 図2A、D）。持続相の[Ca 2+] i の vHipp軸索に沿ってシグナル伝達におけるニコチン誘発される増加の具体的α7*のnAChRアンタゴニストαBgTxによってではなく、非α7*のnAChRアンタゴニストDHβE（ 図2A-C）によって遮断されました。
活動依存FM1-43色素エンドサイトーシスおよびエキソサイトーシスの直接可視化は間接的にシナプス前神経伝達物質の放出23、24を監視するために使用されてきた。ここでは、FM1-43によって可視化vHipp軸索に沿ったニコチンによって誘発される小胞の融合のための代表的な画像と定量化を図に示されています図3（ 図3A、C）。シナプス前α7の存在* nAChR類は、最大限のニコチン誘発される小胞融合及び神経伝達物質の放出（ 図3B、C）のために必要とされます。
NACCとvHipp図1.シナプス共培養examinatioを可能にしますnAChR類の前シナプス局在のN。（AC）腹側海馬/鉤状回（A）の別々のメッキすることにより調製遺伝子型特異的なインビトロ回路（C）の概略漫画。 - / - WTの側坐核（B）から、マウスと分散ニューロン個々のWTまたはα7からスライス。水溶液 、水道橋（シルビウス）; DG、歯状回、MM、内側乳頭核; PMCO、posteromedial皮質扁桃核、RF、鼻腔亀裂、FMI、脳梁の鉗子マイナー、LV、側脳室、 火 、嗅結; VP 、腹側淡蒼球。（D）vHippのmicroslicesはGAD65陽性（緑）NACCニューロン（白矢印は、これらの接触部位の例である）に連絡VGLUT1正（赤）軸索突起を拡張します。スケールバー：10μmの（E。赤のクラスタ（白矢印）での-G）WT vHippの軸索（VGLUT1と染色、緑）の代表的な顕微鏡写真は、α4のために示されている*のnAChR（E）、α5*のnAChR（F）と表面α7*のnAChR（G）染色。スケールバー：5μmの（H）のみNACCから分散GABA作動性ニューロン（正GAD65）には、表面α7*のnAChRクラスタはありません表面α7*のnAChR（白矢印）の（I）レッド「クラスター」は、それらの中で見ることができますvHippのmicroslicesと共培養分散ニューロン。スケールバー：5μmで、この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
NACCとvHipp図2.シナプスの共培養は、ニコチン誘導性のカルシウムシグナルの検査を可能にしますvHipp軸索に沿ってます。ニコチン塗布後の前（上）（A）代表FLUO-4 WT vHippの軸索に沿って擬似カラースケールでのカルシウム結合したFLUO-4の画像、1 '（中央）、および30'（下）。ニコチン誘発性のCa 2+応答の持続相（30 '）はα7を添加することによって解消される*のnAChR選択的アンタゴニストαBgTx（100 nM）を（B）ではなく、非α7*のnAChR選択的アンタゴニストDHβEの添加により（1μM）（C）。スケールバー：5μmの（D）1分間のニコチン（1μM）で灌流ライブWT vHipp軸索からの正規化のfluo-4の集積蛍光強度の代表的なプロットこの図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
NACCとvHipp図3.シナプスの共培養は、vHipp軸索に沿って（FM1-43で）ニコチン誘発される小胞の神経伝達物質の放出を検査することができます。 （A）の前（ 上 ）と（ 下 ）、ニコチン適用後（FM1-43、緑でロード）WT vHipp軸索の代表的な画像。（B）FM1-43を搭載したWT vHipp軸索の代表的な画像（、α7で前処理* （ 上 ）と後（ 下 ）ニコチン適用前のnAChR選択的アンタゴニストで15分間αBgTx）。スケールバー：5μmの（C）は、のnAChR拮抗剤*α7のニコチン不在（WT）での処理または存在（WT +αBgTx）以下の軸索FM1-43蛍光（Fの減少 ）の変化の定量化を示すには、 こちらをクリックしてくださいこの図の拡大版を表示します。
補足ムービー1：vHipp軸索に沿って基礎のFluo-4 /のCa 2+蛍光のタイムラプスライブイメージング。
vHipp軸索に沿ってのFluo-4 /のCa 2+蛍光のタイムラプス画像は、回転するディスク共焦点顕微鏡を用いて30分間、10秒ごとに60倍対物水レンズを得ました。取得された画像は、擬似カラースケールで示し、S当たり2フレームでムービーとして再生されました。この映画は、HBSカクテルを灌流ライブWT vHippの軸索に沿ってのFluo-4 /のCa 2+蛍光活性のベースラインを示しています。
補足ムービー2：誘発されるニコチンのタイムラプスライブイメージングは、フルオ4 / Ca比を維持し2+ vHipp軸索に沿って蛍光。
vHipp軸索に沿ってのFluo-4 /のCa 2+蛍光のタイムラプス画像は、回転するディスク共焦点顕微鏡を用いて30分間、10秒ごとに60倍対物水レンズを得ました。取得された画像は、擬似カラースケールで示され、毎秒2フレームでムービーとして再生されました。この映画は、ニコチンを示している（1μM、時点43でで灌流し、時点49でHBSカクテルで洗い流す）ライブWT vHipp軸索に沿ってのFluo-4 /のCa 2+蛍光活性を誘導しました。ニコチンアプリケーションはvHipp軸索に沿ってFLUO-4 /のCa 2+蛍光強度を増加させました。
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Discussion
共培養の準備は、in vitroで前シナプスのnAChRの活性化が強化されたグルタミン酸作動性伝達5、21を誘発することにより、空間的および時間的プロファイルのこの準備を許可比較的簡単で信頼性の高い検査を再降伏し、腹側海馬側坐核回路を説明しました。
共培養は、インビボ様の機能を実証するために、インビトロでの生理学的条件を提供することができる一皿内の異なる特定の細胞型の増殖として定義されます。従来のニューロン - ニューロン共培養物は、異なる細胞型の間のシナプスの相互作用を研究するための神経科学の研究に導入されています。しかしながら、前及びこれらの共培養におけるシナプスの後の部位を同定することは困難です。このmicroslice解離ニューロンの共培養プロトコルは、シナプス前軸索とシナプス後の標的の容易に認識することができます。異なる脳領域からの使用microslices O異なる蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックマウス、Fラインが、このプロトコルは、軸索、軸索相互作用を研究するために使用することができます。
このmicroslice解離神経細胞共培養プロトコルの重要なステップは、外植片の取り付け、突起の伸長とシナプスの形成を可能にする安定した環境を提供しています。メディアの最小量でmicroslicesをメッキし、湿らせた滅菌ガーゼパッド上に培養プレートを維持することはmicrosliceアタッチメントとシナプス形成のための2つの重要なステップです。この共培養プロトコルの主な制限は、すべての分散しないNACCニューロンはvHipp軸索と機能的シナプスを形成することです。
前後のシナプスのコンポーネントの遺伝子型を変更することにより、この製剤は、シナプス可塑性のシナプス前および後のメカニズムを研究するための有益なアプローチを提供します。この準備の三つの明確な特徴は、これらの研究に最適です。脳R通常維持、または容易に急性スライス中で同定することができないファイバ経路を介して、 生体内で接続されているegionsこのインビトロ製剤で組み合わせることができます。シナプス前および後の構成要素は、異なるマウスから来る前または後シナプスの遺伝子型のいずれかの独立した変更を可能にします。異なる時間に前および後シナプスの成分をメッキすることにより、選択的に前またはシナプス後ニューロンのいずれかで、外因性遺伝子を発現することが可能です。
nAChR類の活性化によって（数秒〜数分の範囲）のCa 2+トランジェントを誘発したニコチンは培養神経細胞、アストロサイトとのnAChR 25-27を表現するいくつかの細胞株で報告されています。しかし、これらの研究のほとんどは、主に長期的な撮影時の光損傷に短時間ニコチン暴露（10分以上）長期的な影響は検出されませんでした。上記の培養プロトコルと急速スピニングディスク共焦点画像コレクションを使用することにより、ニコチン誘発されたCa 2+シグナル伝達、シナプス小胞の融合とグルタミン酸放出は、ニューロンへの明らかな損傷を与えることなく、最大1時間のために記録することができます（ 補足ムービー1、2）。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Culture Media (50 ml) | |||
| Neurobasal | GIBCO | 10888022 | 48 ml |
| B-27 Supplements | GIBCO | 0080085-SA | 1 ml |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 10908-010 | 0.5 ml |
| GlutaMAX Supplement | GIBCO | 35050-061 | 0.5 ml |
| Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | GIBCO | 15140-122 | 20 ng/ml |
| 2. washing media (HBSS, 100 ml) | |||
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | GIBCO | 14175-095 | 99 ml |
| HEPES ( 1M) | GIBCO | 15630-130 | 1 ml |
| 3. HEPES buffered saline (HBS) pH=7.3 | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | 135 mM |
| KCl | Sigma | P9333 | 5 mM |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | 1 mM |
| CaCl2, | Sigma | C1016 | 2 mM |
| HEPES | Sigma | H3375 | 10 mM |
| Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |
| 4. HBS Cocktail for live imaging pH=7.3 | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | 135 mM |
| KCl | Sigma | P9333 | 5 mM |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | 1 mM |
| CaCl2, | Sigma | C1016 | 2 mM |
| HEPES | Sigma | H3375 | 10 mM |
| Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |
| tetrodotoxin | Tocris | 1078 | 2 µM |
| bicuculline | Tocris | 131 | 10 µM |
| D-AP-5 | Tocris | 105 | 50 µM |
| CNQX | Tocris | 1045 | 20 µM |
| LY341495 | Tocris | 1209 | 10 µM |
| 5. Calcium-free HBS pH=7.3 | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | 135 mM |
| KCl | Sigma | P9333 | 5 mM |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | 1 mM |
| HEPES | Sigma | H3375 | 10 mM |
| Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |
| 6. 56 mM Potassium ACSF pH=7.4 | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | 119 mM |
| KCl | Sigma | P9333 | 56 mM |
| MgSO4.7H | Sigma | M1880 | 1.3 mM |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | 2.5 mM |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | 1 mM |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | 26.2 mM |
| Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |
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