Introduction
회로 흥분성의 콜린성 변조인지의 기본적인 양태에 기여하고, 변경된 콜린성 변조는 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 정신 분열증 및 중독 1-4 포함한 신경 퇴행성 질환 및 신경 기능이다. 중추 신경계의 시냅스 전달의 콜린성 촉진의 설립 메커니즘은 사전 시냅스 사이트에서 번역 된 nAChRs 직접 활성화를 통해입니다. 간접적으로 특정 nAChR을 서브 타입, 그리고 상대적으로 높은 칼슘 전도에 직접적으로 인해를 통해 세포 내 신호 폭포 -이 사전 시냅스 수용체의 활성화는 세포 내 칼슘 ([칼슘 2 +] I) 전 시냅스 터미널의 증가에 이르게 5함으로써 신경 전달 물질 방출을 향상. 실제로, 프리 시냅스 nAChRs의 활성화는 글루타메이트 신경 전달 물질을 포함한 다양한, GABA, 아세틸 콜린의 방출의 변화와 연관되어있다차 도파민 6-10. 이 프로세스는 다양한 간접적 시냅스 전기 생리 학적 방법을 이용하여 검토했지만, 광학 기자 [CA는 2+] i 및 시냅스 소포 재활용 프리 시냅스 현상의 직접적인 시간적으로 정확한 측정을 허용한다.
nAChRs의 사전 시냅스 현지화는 전자 현미경 (EM) 레벨 11, 12에 nAChRs 직접 면역 금 표지와 함께 설득력있게 입증되었다. 다른 여러 기술들은 배양 된 신경 세포 (13, 14)에 nAChRs subunit- 형광 단백질 키메라의 위치를 검출 포함한 간접적 nAChR을 현지화를 해결하기 위해 사용되고, 시냅스 말단 (15, 16)에 nAChR을 전류의 전기 생리 학적 기록 [캘리포니아 니코틴 유도 변화를 모니터링 에 의해 시냅스 터미널에서 라이브 세포 이미징 (17), 및 신경 전달 물질 방출의 간접적 인 모니터링에 의한 시냅스 신경 터미널에서 2 +] I스티 릴 양친 매성 FM 염료 (FM1 - 43와 FM4-64) 및 / 또는 synapto-pHluorin에 의해 및 글루타메이트에 대한 아세틸 콜린과 iGluSnFr에 대한 CNiFERs 같은 특정 형광 신경 전달 물질 기자, 볼 시냅스 소포의 세포 외 유출을 포함 형광 지표와 라이브 세포 이미징 기법, 18 ~ 20. 전반적으로, nAChRs의 사전 시냅스 현지화를 식별이 현재의 접근 방법이 복잡하고, 신뢰할 수있는 식별 및 사전 시냅스 활동의 생리 학적 모니터링을 할 수 있도록 특별한 시스템과 기술을 필요로한다.
확인하고 시냅스 전달의 사전 및 사후 시냅스 구성 요소를 모두 분석에 직접 액세스를 제공합니다 핵 중격 의지 (NACC) 회로 - 여기서 우리는 복부 해마 (vHipp)의 체외 공동 문화 시스템에 대한 프로토콜 및 장비에 대해 설명합니다. 우리는 전 시냅스 nAChRs의 현지화 및 칼슘 신호와 신경 전달 물질 방출 ALO 매개 nAChR을의 라이브 세포 이미징의 예를 보여NG vHipp 축삭. 여기에 제시된 프로토콜 천연 (및 간단한) 확장은 다른 유전자형으로부터 뉴런 구성된 전후 시냅스 접촉의 제조이다. 이러한 방식으로 변조 전 및 / 또는 후 - 시냅스 메커니즘 특정 유전자 산물의 기여는 직접 평가할 수있다.
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Protocol
모든 동물 실험 (2012 개정, NIH 간행물 번호 80-23) 실험 동물의 관리 및 사용을위한 건강 가이드의 국립 연구소에 따라 수행되었고, 연구 기관 동물 관리의 승인을 스토니에 연구위원회에 사용되었다 브룩 대학 (# 1618과 # 1792).
1. vHipp-NACC 시냅틱 공동 문화
- 희생 마우스 (출생 후의 일 0 - 야생형 (WT) 또는 α7 nAChRs 유전자 변형 마우스 라인 3) CO 2. 각각의 강아지 목을 벨 및 사후 사실상의 유전자형에 대한 1.5 ml의 원심 분리기 튜브에 꼬리를 저장합니다. 멸균 후드에서 다음 단계를 수행합니다.
- 전체 뇌를 노출 가위와 집게로 두개골의 상단을 제거합니다. 서로 꼬리 쪽의 대뇌 피질 부분은, 해부 현미경 vHipp 5,21 등 후방 피질을 포함하는 코로나 섹션을 얻을 시점에서 시작.
- V를 해부하다개발 마우스 뇌 아틀라스 (22) (그림 1A)에 따라 CA1-subiculum 지역을 포함 HIPP 조직을 제거합니다. 추운 문화 미디어 (4 ° C의)를 포함하는 35mm 배양 접시로 전송, 작은 얇은 조각 (μm의 약 100 × 100 μm의 microslices)으로 잘라.
- 37 ° C의 배양기에서 적어도 30 분 동안 배지 (~ 500 μL)를 24 웰 조직 배양 플레이트 내부 12mm 폴리 D 라이신 / 라미닌 - 코팅 유리 커버 슬립을 사전 부화. microslices 도금하기 전에 용지를 제거합니다.
- (microslices의 ~ 20 개 함유 ~ 50 μL) 미디어의 최소량과 커버 슬립의 중심에서 화재 연마 파스퇴르 피펫 접시는 이식편의 부착을 용이하게한다. 하나의 동물에서 발생하는 플레이트 vHipp의 microslices (중 + / + 또는 - / - 유전자 변형 α7 라인의 유전자형) 각 coverslip에에.
- 외식은 커버 슬립에 정착 한 후, 부드럽게 일까지 추가 미디어 (~ 100 μL)를 추가E 벽되도록 매체의 레벨은 아니지만 그 커버 슬립의 중앙에서 완전히 둘레에 이식편을 커버하기에 충분히 높다.
- 37 ° C에서 O / N 배양 한 후, 5 % CO 2 배양기, 출생 후 1 일 (WT) 쥐에 배아 일 18 NACC 신경을 분산하고 외식에 추가 할 수 있습니다.
- 개발 마우스 뇌 아틀라스 (20) (그림 1B)에 따라 NACC 조직을 해부하다.
- 15 ML 튜브 및 전송 (500 500 μm의 microslices × μm의 주위에) 작은 조각으로 잘라.
- 37 ° C에서 15 분 동안 0.25 % 트립신 (2 ㎖)로 처리. 워시 조직 덩어리를 차가운 세척 미디어 3 회 (5 ㎖, 4 ° C의) 차가운 문화 매체에서 한 세척 한 다음 (5 ㎖, 4 ℃). 서스펜션은 각 세척 단계에서 5 분간 휴식 한 다음 조심스럽게 상층 액을 부어하도록 허용합니다.
- 가볍게 화재 광택 파스퇴르 피펫으로 배양 배지 2 ㎖ 부드러운 분쇄하여 세포를 떼어 놓다.
- 트랜스5 분 동안 2,000 X rpm에서 또 다른 15 ML 튜브와 원심 분리기에 FER 세포 현탁액. 상층 액을 제거하고 6 새끼 당 1 ml의에서 배양 배지에서 세포를 재현 탁. 부드럽게 화재 연마 파스퇴르 피펫으로 언론에 여러 번 피펫 팅하여 세포를 분산.
- vHipp 외식 각 coverslip에에 분산 NACC 세포의 0.25 ML을 추가합니다.
- 가습 37 ° C의에서 문화를 유지, 5 % CO 2 배양기. 기계적으로 시냅스 형성을 촉진, 안정 및 습도를 유지하기 위해 적신 멸균 거즈 패드에 문화 판을 놓습니다.
2. 면역 세포 화학
- 문화 수정 - 4 % 파라 포름 알데히드 / 4 %의 자당 (5 체외에서 7 일) / PBS (~ coverslip에 500 μL, 20 분, RT).
- 0.25 % 트리톤 X-100 / PBS와 Permeabilize 하시려면 배양 (~ 커버 슬립 당 500 μL, 5 분, RT).
- PBS 10 % 정상 당나귀 혈청 블록 문화 (~ coverslip에 500 μL, 30 분, RT) antibod 이전Y 염색. 4 ° C에서 O / N 일차 항체에 품어. 안티 포성 글루타메이트 트랜스 포터 1 (1 : 250), 안티 GAD65 (1 : 100); 안티 nAChRs (항 α 5 소단위, 1 500 500 α 4 -ECD 1) 다음과 같은 일차 항체를 사용합니다.
- (coverslip에 3 회 / ~ 500 μL, 5 분) PBS로 일차 항체를 세척 한 후 (~ coverslip에 500 μL, 1 : 500) 알렉사 488에 복합 이차 항체에 문화를 품어 또는 커버 슬립 당 알렉사 594 (~ 500 μl를 1 : 37 ℃에서 1 시간 동안 500).
- 이전 라벨 표면 α7 * nAChRs에 대한 고정 37 ° C에서 45 분 (문화 미디어에서 1,000 ~ coverslip에 500 μL, 1) 알렉사 594에 결합 αBgTx의 문화를 품어.
- 마운트 및 밀봉 된 커버.
- 플랜-고차 색지움 목표 (0.8 NA 1.4 또는 NA와 오일 63X 20X)을 구비 한 형광 현미경과 CCD 카메라로 이미지를 캡처.
3. FM1 - 43 기반 소낭 퓨전
- , 영상 실 - (체외에서 7 일 5) 디스크 공 초점 현미경을 회전에 챔버를 탑재 문화를 유지한다. 지속적으로 실온에서 HBS 칵테일 (1 ml / 분)를 관류.
- 90 초 동안 56 mM의 K + ACSF (~ 500 μL) (염색)에 10 μm의 FM1 - 43와 관류 및로드 문화를 중지, 칼슘 ADVASEP-7 (0.1 mm)를 포함하는 무료 HBS로 15 분 거리에 외부 염료를 씻어 막 결합 FM1 - 43을 청소할 수 있습니다.
- 120 초 동안 FM1 - 43없이 56 mM의 K + ACSF (~ 500 μL) (탈색)과 문화를 자극 같은 조건을 사용하여 FM1 - 43와 문화를 다시로드, 및 CA 다시 포함 2+ 무료 HBS 씻어 ADVASEP-7 15 분.
- CCD 카메라와 계획 - 고차 색지움 목표 (1.4 NA와 60X 물, 여기 488 nm의, 방출 530 ㎚)과 캡처 이미지를 갖춘 회전 디스크 공 초점 현미경으로 FM1 - 43 형광 이미지를 획득.
- 1 분 기준 FM1 - 43 형광 이미지 (매 2의 수집) 사전 니코틴 제어와 같은; 1 분 동안 빠른 관류 (2 ml / 분)에 의해 니코틴 (1 μM)를 적용하고 밖으로 HBS 칵테일 니코틴을 씻어. 5 분 동안 매 2 초 동안, 니코틴 신청 후, 전에 캡처 시간 경과 이미지를 유지합니다.
- 전에 FM1 - 43 형광 강도 (F 염색)과 후 (F의 탈색) 각 시냅스의 부통에서 니코틴 응용 프로그램을 정량화.
- 이전과 니코틴 응용 프로그램 (ΔF = F 염색 -F의 탈색) 후 FM1 - 43 형광 강도의 차이를 정량화하여 vHipp 축삭을 따라 해제 FM1 - 43 형광의 총량을 계산합니다. 다음 식에 니코틴 후 형광 강도 저하의 비율을 분석 : F 감소 % = ΔF / F 염색.
4. 칼슘 이미징
- 다음 (5 μm의 FLUO-4 칼슘 2 + 지표와 문화를로드, 정상 HBS 빠르게 - (체외에서 7 일 5) 문화를 씻어AM 에스테르) 및 37 ° C에서 30 분, 5 % CO 2의 HBS 0.02 % 플루로 닉 F-127 (2 mL)을 첨가 하였다.
- (3 회 / 5 분) HBS와 FLUO-4 솔루션을 세척 할 것. (37 ° C / 5 % CO 2) 적어도 30 분 동안 인큐베이터 문화를 돌려줍니다.
- 동일한 촬상 실과 FM1 - 43 기반 소포 융합 절에서 설명한 바와 같이 동일한 조건으로 배양 물을 유지한다 (단계 3.1 참조).
- 계획 - 고차 색지움 목표 (1.4 NA와 60X 물, 여기 488 nm의, 방출 530 ㎚)와 CCD 카메라와 vHipp 마이크로 조각에서 축삭 돌기의 FLUO-4 형광 이미지를 수집합니다.
- 1 분 동안 빠른 관류 (2 ml / 분)에 의해 니코틴 (1 μM)를 적용, 사전 니코틴 컨트롤로 기준 FLUO-4 형광 이미지 (2 분마다 10 초)을 수집 한 다음 밖으로 HBS 칵테일 니코틴을 씻어. 30 분마다 10 초 동안, 니코틴 신청 후, 전에 캡처 시간 경과 이미지를 유지합니다.
- 일련의 원시 FLUO-4 형광 이미지, 수출의 모든 프레임을 저장추가 분석을 위해 TIFF 포맷 이미지.
- 전에 vHipp 축삭을 따라 니코틴 신청 후 FLUO-4 형광의 통합 강도를 수집합니다.
- 하기 식으로 통합 된 형광 강도를 정규화한다 ΔF / F = 0 (FF 0) / F 0 배경 보정 전 니코틴 집적 형광 강도이며, F는 각각의 시점에서 vHipp 축삭을 따라 집적 형광 강도 F 0, 니코틴 신청 후. 분석하고 정규화 집적 형광 강도를 플롯.
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Representative Results
사용 준비는 체외에서 vHipp-NACC 회로의 유전자 키메라 공동 문화로 구성되어 있습니다. vHipp의 microslices에서 냄새가 나는데 계획은 사전 시냅스 축삭 입력으로, 후 시냅스 대상, NACC에서 분산 된 뉴런과 시냅스 연락처를 만들 수 있습니다. vHipp에 의해 신경 지배 NACC 신경 세포에서 글루타메이트 전송의 지속 (≥ 30 분) 촉진을 유도 니코틴은 사전 시냅스 α7 * nAChRs 통해 vHipp 축삭 (5)에 따라 신호 (21)와 연장 칼슘을 축삭.
그림 1은 vHipp 마이크로 조각에서 돌기 (vGluT1 긍정적) 글루타메이트하고 있음을 직접 보여 연락처가 NACC에서 분산 된 GABA 성 중간 가시 신경 세포로 만든 것을 (GAD 긍정적, 그림 1C, D). (α4 및 α5 서브 유닛 포함) α7 *와 비 α7 모두 * nAChRs는 현장에서 구체적으로 vHipp 축삭 (그림 1E-G)과 함께 발견되었다여기서 vHipp 예측이 NACC 뉴런에 문의하십시오. 그것은 NACC에서 분산 된 신경 세포가 α7 * nAChRs (그림 1H)를 표현하지 않는 것을 주목해야한다; 즉 접촉의 수용체 클러스터는 엄격하게 (그림 1I) 시냅스있는도 참조 5 그림 1을 참조하십시오.
키메라 공동 문화가 확립되면, 라이브 영상은 [칼슘 2 +] i와 시냅스가와 / 또는 니코틴은 신경 세포에 명백한 손상없이 최대 30 분 동안 기록 할 수없는 vHipp 축삭을 따라 융합 소포.
대표 이미지, 니코틴에 의한 FLUO-4 [칼슘 2 +] 내가 vHipp 축삭을 따라 신호 시간 경과 영화와 정량화가 그림 2와 보충 영화 1과 2에 나타내었다. 우리는 니코틴를 유도하여 vHipp nAChRs의 활성화가 칼슘을 지속 발견 사전 시냅스 축삭에 2 + 유입 (그림 2A, D). 지속적인 상[칼슘 2 +] 내가 vHipp 축삭을 따라 신호의 니코틴 유도 증가의 특정 α7 * nAChR을 길항제 αBgTx하지만 비 α7 * nAChR을 길항제 DHβE (그림 2A-C)에 의해 차단되었다.
활성 의존적 FM1 - 43 염료 이입 및 세포 외 유출의 직접적인 시각화 간접적 시냅스 전 신경 전달 물질 방출 (23), (24)를 모니터링하는 데 사용되었다. 여기서, FM1 - 43에 의해 가시화 vHipp 축삭을 따라 니코틴 유도 소포 융합 대표적인 이미지 및 정량은도에 나타내었다 (3) (도 3A, C). 사전 시냅스 α7의 존재는 * nAChRs는 최대 니코틴 유도 소포 융합과 신경 전달 물질 방출 (그림 3B, C)가 필요합니다.
NACC와 vHipp 그림 1. 시냅스의 공동 문화 examinatio 수 있습니다nAChRs의 사전 시냅스 현지화 명. (AC) 복부 해마 / subiculum (A)의 별도의 도금에 의해 제조 된 유전자형 별 체외 회로 (C)의 도식 만화. - / - 또는 개별 WT α7에서 슬라이스 WT 핵로부터 마우스 분산 뉴런 (B) 중격 의지. AQ, 수로 (Sylvius), DG, 치아 이랑, MM, 중간 mammillary 핵, PMCo, 후 내측 피질 amygdaloid 핵, RF, rhinal 균열은, FMI, 뇌량의 작은 포셉, 라스베가스, 뇌실, 화, 후각 결절을, 부사장 , 배쪽 창백. (D) vHipp의 microslices는 GAD65 긍정적 (녹색)에 문의 vGluT1 긍정적 인 (적색) 축삭 돌기 NACC 신경 세포 (흰색 화살표는 그 접촉 사이트의 예이다) 확장. 스케일 바 : 10 μm의 (E.-G)), 녹색 vGluT1와 WT vHipp 축삭의 대표 현미경 사진 (염색 α4에 대해 표시됩니다 * nAChR을 (E), α5 * nAChR을 (F) 및 표면 α7 * 레드 클러스터 (흰색 화살표)에 nAChR을 (G) 염색. 스케일 바 :.. 5 μm의 (H)에는 표면 α7 혼자 NACC에서 분산 GABA 성 신경 세포에 * nAChR을 클러스터는 (GAD65 긍정적 인)이 없습니다 표면 α7 * nAChR을 (흰색 화살표)의 (I) 레드 "클러스터"그에서 볼 수 있습니다 분산 된 신경 세포 공동 배양 vHipp의 microslices와. 스케일 바 :. 5 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
NACC와 vHipp 그림 2. 시냅스의 공동 문화는 니코틴에 의한 칼슘 신호의 검사를 할 수 있습니다vHipp 축삭 함께 보내고. 칼슘의 (A) 대표 FLUO-4 이미지 (WT) vHipp 축삭 전 (위), 1 함께 FLUO-4 의사 색 눈금에 바인딩 '(중동), 30'니코틴 신청 후 (아래). 니코틴 - 유도 된 칼슘 응답의 지속 상 (30 ') α7의 첨가에 의해 제거된다 * nAChR을 선택적 길항제 αBgTx (100 ㎚) (B)이 아닌 비 α7 nAChR을 선택적 길항제 * DHβE 첨가하여 (1 μM) (C). 스케일 바 : 5 μm의 1 분 동안 니코틴 (1 ㎛)로 관류 라이브 (WT) vHipp 축삭에서 정규화 FLUO-4 통합 형광 강도의 (D) 대표 플롯.. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
NACC와 vHipp 그림 3. 시냅스의 공동 문화 vHipp 축삭을 따라 (FM1 - 43)와 니코틴에 의한 수 포성 신경 전달 물질 방출의 검사를 할 수 있습니다. () 전 (위)과 (아래) 니코틴 신청 후 (FM1 - 43, 녹색로드) (WT) vHipp 축삭의 대표 이미지. (B) FM1 - 43로드 (WT) vHipp 축삭의 대표 이미지 (, α7 전처리 * (위)과 후 (아래) 니코틴 신청 전에 nAChR을 선택적 길항제 15 분 동안 αBgTx). 스케일 바 :.. 5 μm의 (C)는 니코틴이없는 경우 치료 (WT) 또는 α7의 * nAChR을 길항제 존재 (WT + αBgTx) 다음 축삭 FM1 - 43 형광 (F 감소)의 변화의 정량화를 보여줍니다 여기를 클릭하세요 이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.
보충 영화 1 : vHipp 축삭을 따라 기초 FLUO-4 / 칼슘 형광의 시간 경과 라이브 영상.
vHipp 축삭을 따라 FLUO-4 / 칼슘 형광의 시간 경과 화상이 회전 디스크 공 촛점 현미경으로 30 분 동안 물 60 배 대물 렌즈로 매 10 초를 취득 하였다. 획득 된 영상은 의사 색 눈금에 표시된와의 당 2 프레임에서 동영상으로 재생했다. 이 영화는 함께 HBS 칵테일 관류 (WT) vHipp의 축삭을 살고 FLUO-4 / 칼슘 2 + 형광 활동의 기준을 보여줍니다.
보충 영화 2 : 유도 니코틴의 시간 경과 라이브 영상은 FLUO-4 / CA를 유지 2+ vHipp 축삭을 따라 형광>까지.
vHipp 축삭을 따라 FLUO-4 / 칼슘 형광의 시간 경과 화상이 회전 디스크 공 촛점 현미경으로 30 분 동안 물 60 배 대물 렌즈로 매 10 초를 취득 하였다. 획득 된 영상은 의사 색 눈금에 표시하고 초당 2 프레임에서 동영상으로 재생했다. 이 영화는 니코틴을 보여줍니다 (시점 (43)에서의 관류를 1 μm의, 시점 49 HBS 칵테일 세척은) 함께 (WT) vHipp의 축삭을 살고 FLUO-4 / 칼슘 2 + 형광 활동을 유도. 니코틴 응용 프로그램은 vHipp 축삭을 따라 FLUO-4 / 칼슘 2 + 형광 강도를 증가했다.
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Discussion
공동 배양 제제는 기재된 재 저항하는 것을 시험 관내 복부 해마-중격 의지 회로. 프리 시냅스 nAChRs의 활성화는 글루타메이트 변속기 (5), (21)를 강화 유도하는 공간 및 시간 프로파일이 제조 허가 비교적 간단하고 신뢰성 시험.
공동 배양 생체 -like 함수를 보여주는 시험 관내에서 생리적 조건을 제공 할 수있는 하나의 접시에 다른 특정 세포 유형의 증식으로 정의된다. 기존의 신경 세포 신경 세포의 공동 문화는 서로 다른 종류의 세포 사이의 시냅스 상호 작용 연구를위한 신경 과학 연구에 도입되었다. 그러나, 이러한 사전 및 공동 배양에서 시냅스 후 사이트를 식별하기 어렵다. 이 microslice - 해리 신경 공동 문화 프로토콜은 사전 시냅스 축삭 및 사후 시냅스 목표를 쉽게 인식 할 수 있습니다. 다른 뇌 영역에서 사용 microslices O다른 형광 단백질을 발현하는 형질 전환 마우스 F 라인은,이 프로토콜은 또한 엑손 - 엑손 상호 작용을 연구하는데 사용될 수있다.
이 microslice - 해리 뉴런 공동 배양 프로토콜의 중요한 단계는, 체외 이식편의 부착을 허용하도록 안정된 환경을 제공하고, 돌기의 생장 및 시냅스 형성. 미디어의 최소한의 볼륨 microslices 도금 및 적신 멸균 거즈 패드에 배양 플레이트를 유지하는 것은 microslice 부착과 시냅스 형성을위한 두 가지 핵심 단계입니다. 이 공 배양 프로토콜의 주요 한계는 모든 분산되지 NACC 뉴런 vHipp 축삭과 기능적 시냅스를 형성한다는 것이다.
사전 및 사후 시냅스 구성 요소의 유전자형을 변경하여,이 혼합물은 시냅스 가소성의 사전 및 사후 시냅스 메커니즘을 연구하는 정보 접근을 제공한다. 이러한 준비의 세 가지 특징은 이러한 연구에 이상적이다. 뇌 R정상적으로 유지하거나 용이 급성 슬라이스에서 식별 할 수없는 광섬유 경로를 통해 생체 내에서 접속되어 egions이 시험 관내 제조에 결합 될 수있다. 사전 및 사후 시냅스 구성 요소는 사전 또는 사후 시냅스 유전자형 중 하나의 독립적 인 변경을 허용하는 다른 마우스에서 만든다 온다. 다른 시간 전후 시냅스 성분 도금함으로써, 선택적으로 전 또는 시냅스 후 뉴런 하나로 외래 유전자를 발현시킬 수있다.
니코틴은 배양 된 신경 세포, 성상 세포에서보고되었다 nAChRs의 활성화에 의해 nAChRs 25-27을 표현하는 여러 세포 라인 (분 범위에 초) 칼슘에게 2 + 과도를 유도. 그러나, 이러한 연구의 대부분은 장기적인 효과 장기간 동안 이미징 포토 손상에 크게 기인 단시간 니코틴 노출 (10 분) 검출되지 않았다. 신속한 스피닝 디스크 공 촛점 이미지 컬렉션 상술 배양 프로토콜을 사용하여,니코틴에 의한 칼슘 신호 전달, 시냅스 소포 융합의 글루타메이트 방출은 신경 세포에 명백한 손상없이 최대 1 시간 동안 녹화 할 수 있습니다 (보충 영화 1, 2).
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Culture Media (50 ml) | |||
| Neurobasal | GIBCO | 10888022 | 48 ml |
| B-27 Supplements | GIBCO | 0080085-SA | 1 ml |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 10908-010 | 0.5 ml |
| GlutaMAX Supplement | GIBCO | 35050-061 | 0.5 ml |
| Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | GIBCO | 15140-122 | 20 ng/ml |
| 2. washing media (HBSS, 100 ml) | |||
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | GIBCO | 14175-095 | 99 ml |
| HEPES ( 1M) | GIBCO | 15630-130 | 1 ml |
| 3. HEPES buffered saline (HBS) pH=7.3 | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | 135 mM |
| KCl | Sigma | P9333 | 5 mM |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | 1 mM |
| CaCl2, | Sigma | C1016 | 2 mM |
| HEPES | Sigma | H3375 | 10 mM |
| Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |
| 4. HBS Cocktail for live imaging pH=7.3 | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | 135 mM |
| KCl | Sigma | P9333 | 5 mM |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | 1 mM |
| CaCl2, | Sigma | C1016 | 2 mM |
| HEPES | Sigma | H3375 | 10 mM |
| Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |
| tetrodotoxin | Tocris | 1078 | 2 µM |
| bicuculline | Tocris | 131 | 10 µM |
| D-AP-5 | Tocris | 105 | 50 µM |
| CNQX | Tocris | 1045 | 20 µM |
| LY341495 | Tocris | 1209 | 10 µM |
| 5. Calcium-free HBS pH=7.3 | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | 135 mM |
| KCl | Sigma | P9333 | 5 mM |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | 1 mM |
| HEPES | Sigma | H3375 | 10 mM |
| Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |
| 6. 56 mM Potassium ACSF pH=7.4 | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | 119 mM |
| KCl | Sigma | P9333 | 56 mM |
| MgSO4.7H | Sigma | M1880 | 1.3 mM |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | 2.5 mM |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | 1 mM |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | 26.2 mM |
| Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |
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