Introduction
电路的兴奋性胆碱能调制有助于认识的基本方面，并改变胆碱能调制的神经变性和神经精神障碍的特征，包括阿耳茨海默氏病，帕金森氏病，精神分裂症和成瘾1-4。建立突触传递在中枢神经系统的胆碱能便利化机制是通过直接激活烟碱受体定位在突触前部位。这些突触前受体的激活导致增加的细胞内Ca 2+（内[Ca 2+] i）的突触前端子-包括直接，由于某些胆碱受体亚型，并间接的相对高的钙传导，通过细胞内的信号级联5，由此增强神经递质释放。事实上，突触前烟碱受体的激活已与变化的各种各样的神经递质包括谷氨酸，GABA，乙酰胆碱，释放一个第二多巴胺6-10。尽管间接使用电生理学方法在各种突触这一过程进行了研究，光学记者的[Ca 2+] i和突触小泡循环允许更直接的和时间上精确测量的突触前的现象。
烟碱受体的突触前本地化已被证明具有令人信服的烟碱受体在电子显微镜（EM）水平11,12直接免疫金标记。几个其它技术也被用于间接寻址nAChR的定位，包括：检测在培养的神经元13,14的nAChRs的亚单位的荧光蛋白嵌合体的位置，电生理记录的nAChR电流在突触末端15,16，监测尼古丁引起的变化的[Ca 2+] 我由活细胞成像17，和神经递质释放的间接监控在由突触终端突触神经末梢用荧光指示剂活细胞成像的技术，包括由苯乙烯两亲调频染料（FM1-43和FM4-64）和/或突触-pHluorin与由特定的荧光神经递质记者，如CNiFERs为乙酰胆碱和iGluSnFr谷氨酸观察突触小泡的胞吐18-20。总体而言，目前的这些方法鉴定烟碱受体的突触前本地化是复杂的，并且需要特殊的系统和技术，让可靠的鉴定和生理监测突触前活动。
在这里，我们描述的协议和设备进行了腹海马（vHipp）的体外共培养体系-伏隔核（NACC）电路，可直接访问识别和分析前和突触后突触传递的组成部分。我们发现烟碱受体的突触前本地化和胆碱受体的活细胞成像介导的钙信号和神经递质的释放ALO的例子NG vHipp轴突。这里介绍的协议的一个自然（和直接的）扩展是由来自不同基因型的神经元前和突触后接触的制备方法。以这种方式，特定的基因产物，以调制的前和/或突触后的机制的贡献可以直接评估。
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Protocol
所有的动物实验是按照卫生指南实验动物的护理和使用国家研究院（NIH出版物号80-23 2012年修订），并研究批准了机构动物护理和使用研究委员会石溪布鲁克大学（＃1618和＃1792）。
1. vHipp-NACC突触共培养
- 牺牲小鼠（出生后第0天- 3，从野生型（WT）或α7烟碱受体的转基因小鼠品系）用CO 2。斩首每个小狗和保存的尾部在1.5毫升离心管，用于事后的基因分型。执行在无菌罩下面的步骤。
- 除去用剪刀和镊子的颅骨顶部以暴露整个大脑。开始于时刻所在的大脑皮层部分彼此尾端，得到冠状部，其包含的后皮质包括vHipp 5,21在解剖显微镜下。
- 解剖v含有CA1〜下脚区域出根据显影小鼠脑图谱22（ 图1A）希普组织条。转移到含有冷培养基（4℃）35毫米培养皿，切成小薄片（约100微米×100微米microslices）。
- 预孵育12毫米聚-D-赖氨酸/层粘连蛋白包被的玻璃内的24孔组织培养板用培养基（〜500微升）的盖玻片在培养箱中在至少30分钟，在37℃。电镀microslices前取出介质。
- 板用火抛光的巴斯德吸移管在用媒体最小量盖玻片的中心（约50微升，含有〜20件microslices的），以促进附着外植体。板vHipp microslices从一个单一的动物起源（无论是+ / +或 - / - 基因型转基因α7线）上的每个盖玻片。
- 后定居植到盖玻片，轻轻日增加额外的媒体（约100微升）Ë壁上，使得介质的水平高到足以完全覆盖在周边的外植体，而不是那些在盖玻片的中心。
- 的O / N培养在37℃后，5％CO 2培养箱，分散NACC神经元从胚胎天18到产后第1天WT小鼠，并加入到植。
- 根据显影小鼠脑图谱20（ 图1B）解剖出来NACC组织。
- 切成小块（约500微米×500微米microslices），并转移到15毫升管。
- 治疗与0.25％胰蛋白酶（2ml）中进行15分钟，在37℃。洗涤组织块接着在冷的培养基一个洗涤三次用冷洗涤介质（5毫升，4℃）（5毫升，4℃）。允许悬挂休息5分钟，每个洗涤步骤，然后小心地倒出上清液。
- 游离细胞轻轻研磨在2毫升培养基用轻火抛光的巴斯德吸管。
- 反FER细胞悬液至另一个15ml试管并离心以2,000×rpm离心5分钟。去除上清和悬浮细胞培养液中，每6幼仔1毫升。在媒体几次轻轻吹打用火抛光的巴斯德吸管分散细胞。
- 添加0.25毫升分散NACC细胞对每个盖玻片与vHipp植。
- 保持培养物在加湿37℃，5％CO 2培养箱。广场上蘸消毒纱布垫培养板机械稳定和保持湿度，促进突触的形成。
2.免疫细胞化学
- 固定培养物（5 - 7日在体外 ）在4％低聚甲醛/ 4％蔗糖/ PBS（〜每盖玻片500微升，20分钟，室温）。
- 透培养用0.25％的Triton X-100 / PBS（〜每盖玻片500微升，5分钟，室温）。
- 块培养物用PBS中的10％正常驴血清（〜每盖玻片500微升，30分钟，室温），以antibod之前ÿ染色。孵育一抗O / N在4℃。使用下列一抗：抗nAChRs的（α4 -ECD 1：500;抗α5亚基，1：500），抗囊泡膜谷氨酸转运蛋白1（1：250），抗GAD 65（1：100）。
- 洗一次抗体用PBS（3次/〜500每盖玻片微升，5分钟），然后孵育培养物中结合Alexa 488二抗（〜每盖玻片500微升，1：500）或Alexa 594（〜500微升每盖玻片，1：500），1小时，在37℃。
- 固定之前用于标记表面α7* nAChRs的45分钟，在37℃：孵育培养物中αBgTx缀合的Alexa 594（1000在培养基〜每盖玻片500微升，1）。
- 安装和密封盖玻片。
- 用装有计划复消色差透镜的目标（20X用0.8的NA或63X油1.4 NA）为荧光显微镜和CCD照相机捕捉图像。
3.基于FM1 - 43水疱融合
- 保持文化（5 - 7日在体外 ）在成像室，安装室内的旋转盘共聚焦显微镜。连续灌注（1毫升/分钟）与哈佛商学院的鸡尾酒在室温。
- 停止灌注和负载的文化与10μMFM1 - 43在56毫米的K +学联（〜500微升），90秒（染色），15分钟与钙含ADVASEP-7（0.1毫米）免费洗HBS外部客场染料以清除膜结合FM1-43。
- 刺激的培养物用56毫K + ACSF（〜500微升），而不FM1-43 120秒（脱色），用同样的条件下重新加载培养用FM1-43，并与钙洗一遍2+含有游离的HBS ADVASEP-7为15分钟。
- 获得FM1-43荧光图像与旋转盘共聚焦显微镜配备一个计划复消色差透镜物镜（60X水与1.4的NA，激发488纳米，发射530 nm），并将捕获的图像用CCD照相机。
- 收集基线FM1 - 43荧光图像（每2秒1分钟）作为预尼古丁控制;应用尼古丁（1μM）通过快速灌注（2毫升/分钟），持续1分钟，然后再洗涤尼古丁出用HBS鸡尾酒。保持捕获时间推移图像之前，期间和烟碱施用后每2秒5分钟。
- 量化前FM1-43荧光强度（F 染色 ）和后（F 脱色 ）在每个突触布顿烟碱应用。
- 由前和尼古丁应用（ΔF= F 染色 -F 脱色 ）后定量FM1-43荧光强度的差计算沿vHipp轴突释放的FM1-43荧光总量。尼古丁下面的公式后分析的荧光强度降低分数：F 减少 （％）=ΔF/女染色 。
4.钙成像
- 与正常HBS快速- （7天在体外 5），然后加载与文化5微米荧光- 4 钙指标（冲洗文化调幅酯）和0.02％的Pluronic F-127在HBS（2ml）中进行30分钟，在37℃和5％的CO 2。
- 洗出的Fluo-4溶液用HBS（3次/ 5分钟）。返回培养孵化器（37℃/ 5％CO 2）为至少30分钟。
- 文化保持在相同的成像室，并在基于FM1 - 43水泡融合节所述相同条件下（见步骤3.1）。
- 收集来自vHipp微片，用计划复消色差透镜物镜（60X水与1.4的NA，激励488纳米，发射530纳米）和CCD照相机的轴突突起的Fluo-4的荧光图像。
- 收集基线的Fluo-4的荧光图像（每10秒，2分钟）作为预尼古丁控制，应用尼古丁（1μM）通过快速灌注（2毫升/分钟），持续1分钟，然后再洗涤尼古丁出用HBS鸡尾酒。保持捕获时间推移图像之前，期间和烟碱施用后，每10秒30分钟。
- 保存原始FLUO-4的荧光图像，出口的所有帧作为一系列TIFF格式的图片进行进一步分析。
- 收集荧光 - 4荧光沿轴突vHipp前和尼古丁申请后的整合力度。
- 正常化集成荧光强度用下列方程：ΔF/ f 0的 =（FF 0）/ F 0，其中F 0是背景校正的预尼古丁集成荧光强度和F是在每个时间点沿vHipp轴突的积分荧光强度尼古丁后应用。分析并绘制标准化综合荧光强度。
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Representative Results
所使用的制剂包括基因嵌合体外 vHipp-NACC电路的共培养物。从预测microslices vHipp发出，作为突触前神经轴突的输入，可与突触后的目标，从NACC分散的神经元突触联系。尼古丁引起的由vHipp支配神经元NACC持续（≥30分）促进谷氨酸传输轴突21和长期钙通过突触前α7nAChRs的*沿轴突vHipp信号5。
图1显示了直接从vHipp微切片的投影是谷氨酸（VGLUT1正），并且触头从NACC制成具有分散的GABA能中型多棘神经元（GAD阳性， 图1C，D）。无论α7*和非α7nAChRs的*（包括α4和α5亚基）分别沿轴突vHipp（ 图1E-G），并在专门网站上发现其中，vHipp突起接触NACC神经元。应当指出的是，从NACC分散的神经元不表达α7* nAChRs的（ 图1H）;即受体集群的联系方式是严格突触前（ 图1I），也见参考图5 1。
一旦嵌合共培养已建立，对实时成像的[Ca 2+] i和突触囊泡融合沿vHipp轴突和/或无尼古丁可以在不向神经元的任何明显的损坏被记录长达30分钟。
代表图像，定时短片和量词为烟碱诱导的FLUO-4的[Ca 2+] i的沿vHipp轴突信令示于图2和补充电影1和2。我们发现，活化vHipp nAChRs的由烟碱诱导持续的Ca 2+流入突触前轴突（ 图2A中的D）。持续阶段的烟碱诱导的增加的[Ca 2+] i的沿vHipp轴突信令被阻断的特定α7*胆碱受体拮抗剂αBgTx但不被非α7*胆碱受体拮抗剂DHβE（ 图2A-C）。
的活性依赖性FM1-43染料的内吞作用和胞吐直接可视化已用于监测间接突触前神经递质释放23，24，在这里，代表图像和定量为沿着由FM1-43可视vHipp轴突烟碱诱导的囊泡融合示于图3（ 图3A中的C）。突触前α7的存在* nAChRs的需要最大烟碱诱导的囊泡融合和神经递质的释放（ 图3B，C）。
vHipp与NACC图1.突触共培养允许examinatioñ烟碱受体的突触前本地化。（AC）的制备腹侧海马/下脚（A）的单独电镀基因型特异性体外电路（C）卡通示意图。 / - -从单个WT或α7切片来自WT核小鼠和分散的神经元伏（B）中。 AQ，渡槽（西尔维于斯）; DG，齿状回; MM，乳头内侧核; PMCo，后内侧皮质杏仁核; RF，鼻腔裂缝，FMI，钳未成年人的胼胝体; LV，侧脑室; 屠 ，嗅结节; VP ，腹侧苍白球。（D）vHipp microslices延伸VGLUT1阳性（红色）轴突投射的联系GAD65阳性（绿色）NACC神经元（白色箭头是那些接触部位的例子）。比例尺：10微米（E。-G）的WT vHipp轴突代表显微照片（染色VGLUT1，绿色）显示为α4*胆碱受体（E），α5*胆碱受体（F）和表面α7*胆碱受体（G）染色红团簇（白色箭头）。比例尺：5微米（H）没有表面α7*胆碱受体簇分散的GABA能神经元（谷氨酸脱羧酶阳性）从NACC单独面α7*胆碱受体（白色箭头）（I）红“集群”可以在那些可见分散的神经元共培养与vHipp microslices。比例尺：5微米请点击此处查看该图的放大版本。
vHipp与NACC图2.突触共培养允许检查尼古丁引起的钙信号荷兰国际集团沿轴突vHipp。 （一）代表FLUO-4图像钙结合的荧光- 4伪色标沿WT vHipp轴突前（顶），1（中）和30'（底部）尼古丁申请后。烟碱诱导的Ca 2+响应的持续期（30'）是通过将所述α7的消除* nAChR的选择性拮抗剂αBgTx（100 nm）的（B）中 ，但不加入非α7* nAChR的选择性拮抗剂DHβE的（1μM）（℃）。比例尺：5微米（D）代表归FLUO-4集成荧光强度从现场WT vHipp轴突灌注与尼古丁（1μM）1分钟的情节。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3.突触共培养vHipp与NACC允许检查尼古丁引起的水泡神经递质的释放（与FM1 - 43）沿轴突vHipp的。 （一）WT vHipp轴突代表图像（满载FM1 - 43，绿色）前（ 上 ）后（ 下 ）的尼古丁应用。（二）WT vHipp轴突代表图像（满载FM1 - 43，预处理α7*前（ 上 ）和后（ 底 ）烟碱应用胆碱受体的选择性拮抗剂αBgTx15分钟）。比例尺：5微米（C）显示的变化轴突FM1 - 43荧光（F 减少 ）以下在没有烟碱治疗（WT）或存在（WT +αBgTx）的α7的*胆碱受体拮抗剂定量。 请点击这里查看该图的放大版本。
补充电影1：基底荧光- 4 / 钙离子荧光沿轴突vHipp定时实时成像。
购入用60倍的物镜水透镜的Fluo-4 / 钙荧光沿vHipp轴突时间推移图象每10秒进行30分钟，一个旋转盘共聚焦显微镜。获得的图像显示在伪彩色规模和回放的电影，每第2帧。这部电影显示的Fluo-4 / 钙离子荧光活动的基准线沿线居住WT vHipp轴突灌注HBS的鸡尾酒。
补充电影2：尼古丁引起的定时实时成像持续的Fluo-4 / 钙 沿轴突vHipp荧光。
购入用60倍的物镜水透镜的Fluo-4 / 钙荧光沿vHipp轴突时间推移图象每10秒进行30分钟，一个旋转盘共聚焦显微镜。获得的图像显示在伪彩色规模和回放的电影在每秒2帧。这部电影显示尼古丁（1微米，在时间点43灌流，洗出与哈佛商学院在鸡尾酒时间点49）诱导荧光- 4 / 钙离子荧光沿活动现场WT vHipp轴突。尼古丁应用增加沿轴突vHipp的FLUO-4 / 钙离子荧光强度。
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Discussion
共培养制备所述重新投降体外腹侧海马伏电路。该制剂允许相对简单和可靠的空间和时间曲线通过该激活突触前烟碱受体引起增强谷氨酸传输5,21检查。
共培养物被定义为不同的特定细胞类型的在一个菜的生长，可以提供在生理条件的体外证明体内样功能。常规神经元的神经元共培养相继出台神经科学的研究为研究不同类型的细胞之间突触的相互作用。然而，这是难以确定的前和后的位点在这些共培养物的突触。此microslice解离神经元共培养协议允许容易识别突触前轴突和突触后的目标的。从不同的大脑区域使用microslicesØ表达不同的荧光蛋白˚F转基因小鼠系，该协议也可以用来研究轴突轴突相互作用。
此microslice解离的神经元共培养协议的关键步骤是提供一个稳定的环境，以允许外植体的附着，突起的生长和突触的形成。电镀microslices在媒体最小的体积和维护上蘸消毒纱布垫在培养皿是microslice附着和突触形成的两个关键步骤。此共培养协议的主要限制是，并不是所有的分散NACC神经元形成功能性突触vHipp轴突。
通过改变前和突触后的组件的基因型，该制剂为研究突触可塑性的前和突触后的机制的信息的方法。该制剂的三个显着特征使其非常适合于这些研究。脑 - [R被经由不能维持，或在急性切片容易鉴定光纤路径，通常连接在体内 egions可以在该体外制备组合。前和突触后成分来自不同的小鼠使使无论是前或突触后基因型独立的改变。通过在不同的时间电镀前和突触后的组件，它可以选择性地表达在任一前或突触后神经元的外源基因。
烟碱诱导的Ca 2+瞬变（在几秒到几分钟的范围）通过激活nAChRs的已报道在培养的神经元，星形胶质细胞和在表达nAChRs的25-27几个细胞系。然而，大多数这些研究没有发现长期效果（超过10分钟）短的时间内接触尼古丁主要是由于光损伤在长期成像。通过上面的和快速的旋转盘共聚焦图像采集描述的文化协议，烟碱诱导的Ca 2+信号，突触小泡的融合和谷氨酸释放可记录长达1小时，但无神经元的任何明显的损害（ 参考电影1，2）。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Culture Media (50 ml) | |||
| Neurobasal | GIBCO | 10888022 | 48 ml |
| B-27 Supplements | GIBCO | 0080085-SA | 1 ml |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 10908-010 | 0.5 ml |
| GlutaMAX Supplement | GIBCO | 35050-061 | 0.5 ml |
| Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | GIBCO | 15140-122 | 20 ng/ml |
| 2. washing media (HBSS, 100 ml) | |||
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | GIBCO | 14175-095 | 99 ml |
| HEPES ( 1M) | GIBCO | 15630-130 | 1 ml |
| 3. HEPES buffered saline (HBS) pH=7.3 | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | 135 mM |
| KCl | Sigma | P9333 | 5 mM |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | 1 mM |
| CaCl2, | Sigma | C1016 | 2 mM |
| HEPES | Sigma | H3375 | 10 mM |
| Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |
| 4. HBS Cocktail for live imaging pH=7.3 | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | 135 mM |
| KCl | Sigma | P9333 | 5 mM |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | 1 mM |
| CaCl2, | Sigma | C1016 | 2 mM |
| HEPES | Sigma | H3375 | 10 mM |
| Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |
| tetrodotoxin | Tocris | 1078 | 2 µM |
| bicuculline | Tocris | 131 | 10 µM |
| D-AP-5 | Tocris | 105 | 50 µM |
| CNQX | Tocris | 1045 | 20 µM |
| LY341495 | Tocris | 1209 | 10 µM |
| 5. Calcium-free HBS pH=7.3 | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | 135 mM |
| KCl | Sigma | P9333 | 5 mM |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | 1 mM |
| HEPES | Sigma | H3375 | 10 mM |
| Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |
| 6. 56 mM Potassium ACSF pH=7.4 | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | 119 mM |
| KCl | Sigma | P9333 | 56 mM |
| MgSO4.7H | Sigma | M1880 | 1.3 mM |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | 2.5 mM |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | 1 mM |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | 26.2 mM |
| Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |
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