Introduction
Cholinergen Modulation Schaltung Erregbarkeit trägt zur grundlegenden Aspekte des Erkennens und verändert cholinergen Modulation ist eine Funktion von neurodegenerativer und neuropsychiatrischen Störungen, einschließlich Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, Schizophrenie und Sucht 1-4. Eine etablierte Mechanismus der cholinergen Erleichterung der synaptischen Übertragung im ZNS ist über eine direkte Aktivierung von nAChR in präsynaptischen Websites lokalisiert. Aktivierung dieser präsynaptischen Rezeptoren führt zur intrazellulären Ca 2+ ([Ca 2+] i) in präsynaptischen Terminals erhöht - sowohl direkt, aufgrund der relativ hohen Calcium Leitfähigkeit bestimmter nAChR-Subtypen, und indirekt über die intrazellulären Signalkaskaden 5, wodurch die Freisetzung von Neurotransmittern. In der Tat hat die Aktivierung der präsynaptischen nAChRs mit Veränderungen in der Freisetzung von einer Vielzahl von Neurotransmittern wie Glutamat, GABA, Acetylcholin, in Verbindung gebracht worden einnd Dopamin 6-10. Obwohl dieser Prozess wurde indirekt mit elektrophysiologischen Methoden an verschiedenen Synapsen untersucht, optische Reportern von [Ca 2+] i und synaptischen Vesikel-Recycling ermöglichen mehr direkte und zeitlich präzise Messung der präsynaptischen Phänomene.
Präsynaptischen Lokalisation nAChRs überzeugend mit direktem Immunogold-Markierung von nAChR in der elektronenmikroskopische (EM) Ebene 11,12 demonstriert. Mehrere andere Verfahren wurden ebenfalls verwendet, um die Lokalisierung nAChR indirekt zu adressieren, einschließlich Erfassen Standorte nAChRs subunit- fluoreszierendes Protein-Chimären in kultivierten Neuronen 13,14, elektrophysiologischen Aufzeichnung von nAChR Ströme in synaptische Anschlüssen 15,16, Überwachung Nikotin induzierte Veränderungen von [Ca 2+] i in synaptischen Nervenendigungen durch Live Cell Imaging 17 und indirekte Überwachung der Freisetzung von Neurotransmittern im synaptischen Terminal durchLive Cell Imaging-Techniken mit Fluoreszenzindikatoren, einschließlich Exozytose synaptischer Vesikel durch styryl amphipathischen FM Farbstoffe (FM1-43 und FM4-64) und / oder synapto-pHluorin und durch spezifische fluoreszierende Neurotransmitter Reportern, wie CNiFERs für ACh und iGluSnFr für Glutamat angesehen 18-20. Insgesamt sind diese aktuelle Ansätze zur Identifizierung von präsynaptischen Lokalisierung nAChRs sind kompliziert und erfordern spezielle Systeme und Techniken, um eine zuverlässige Identifizierung und physiologische Überwachung der präsynaptischen Aktivität zu ermöglichen.
Hier beschreiben wir Protokolle und Ausrüstung für die in vitro Co-Kultursystem eines ventralen Hippocampus (vHipp) - Nucleus accumbens (NAKR) Schaltung, die einen direkten Zugang zu identifizieren und zu analysieren, sowohl vor als auch postsynaptischen Komponenten der synaptischen Übertragung bietet. Wir zeigen Beispiele von präsynaptischen Lokalisierung nAChRs und Live Cell Imaging von nAChR vermittelte Ca 2+ Signalisierung und die Freisetzung von Neurotransmittern along vHipp Axone. Eine natürliche (und unkompliziert) Erweiterung der hier vorgestellten Protokoll ist die Herstellung von Pre- und Post-synaptische Kontakte von Nervenzellen aus unterschiedlichen Genotypen besteht. Auf diese Weise wird der Beitrag eines bestimmten Genprodukts an der Vor- und / oder postsynaptische Mechanismen der Modulation kann direkt bewertet werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt (NIH Publications No. 80-23, überarbeitet 2012) und Studien wurden von Institutional Animal Care genehmigt und Verwenden für Forschung Ausschüsse at Stony Brook University (# 1618 und # 1792).
1. vHipp-NACC Synaptic Co-Kulturen
- Sacrifice Mäuse (postnatalen Tag 0-3, aus Wildtyp (WT) oder α7 nAChR transgene Mauslinie) mit CO 2. Enthaupten jeder Welpe und speichern Sie das Heck in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen für post facto Genotypisierung. Führen Sie folgende Schritte in einem sterilisierten Kapuze.
- Entfernen Sie die Oberseite des Schädels mit Schere und Pinzette, um das gesamte Gehirn aus. Beginnend an der Verbindungsstelle, wo die zerebralen Kortex Teil voneinander kaudal, erhalten einen Frontalschnitt, der die hinteren Kortex einschließlich der vHipp 5,21 unter einem Binokular enthält.
- Sezieren vHipp Gewebestreifen, die die CA1-Region subiculum gemäß einem entwickelnden Mausgehirnatlas 22 (Figur 1A). Übertragung auf eine 35 mm Kulturschale mit kaltem Kulturmedien (4 ° C), in kleine dünne Scheiben (ca. 100 & mgr; m × 100 & mgr; m microslices) geschnitten.
- Pre-inkubiere 12 mm Poly-D-Lysin / Laminin beschichteten Deckgläschen Inneren 24-Well-Gewebekulturplatten mit Kulturmedien (~ 500 & mgr; l) für mindestens 30 min im Brutschrank bei 37 ° C. Entfernen Sie das Medium vor dem Ausplattieren microslices.
- Platte mit einer feuerpolierten Pasteur-Pipette in der Mitte des Deckglases mit einer minimalen Menge an Medium (~ 50 & mgr; l, enthaltend ~ 20 Stücke microslices), um die Befestigung der Explantate erleichtern. Platte vHipp microslices aus einer tierischen Ursprung (entweder der + / + oder - / - Genotyp der transgenen α7 Linie) für jedes Deckglas.
- Nachdem die Explantate auf das Deckglas absetzen, sanft fügen Sie zusätzliche Medien (~ 100 & mgr; l) von the Wand, so dass der Pegel des Mediums hoch genug ist, um die Explantate am Umfang vollständig abdecken, nicht aber die in der Mitte des Deckglases.
- Nach einer O / N Inkubation in 37 ° C, 5% CO 2 Inkubator, zerstreuen NACC Neuronen von embryonalen Tagen 18 bis postnatalen Tag 1 WT-Mäusen und zu den Explantaten.
- Sezieren NACC Gewebe gemäß einer entwickelnden Mausgehirnatlas 20 (1B).
- In kleine Stücke geschnitten (ca. 500 & mgr; m × 500 & mgr; m microslices) aufnehmen und in einem 15-ml-Tube.
- Behandlung mit 0,25% Trypsin (2 ml) für 15 min bei 37 ° C. Dreimal mit kaltem Waschmedien (5 ml, 4 ° C), gefolgt von einer Wäsche in kaltem Kulturmedium (5 ml, 4 ° C) Waschgewebebrocken. Erlauben Suspension für 5 Minuten in jedem Waschschritt ausruhen und dann abgießen Stand vorsichtig.
- Dissoziieren Zellen durch vorsichtiges Zerreiben in 2 ml Kulturmedium mit einem leicht feuerpolierten Pasteur-Pipette.
- Transfer Zellsuspension in einen anderen 15 ml-Tube und Zentrifugation bei 2.000 x rpm für 5 min. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Zellen in Kulturmedium bei 1 ml pro 6 Welpen. Zerstreuen Zellen durch vorsichtiges Pipettieren in Medien mehrmals mit einer feuerpolierten Pasteur-Pipette.
- Zugabe von 0,25 ml dispergiert NACC-Zellen zu jedem Deckglas mit vHipp Explantate.
- Aufrechtzuerhalten, die Kulturen in einer befeuchteten 37 ° C, 5% CO 2 -Inkubator. Zeigen Kulturplatten auf gedämpft steriler Gaze-Pads, um mechanisch zu stabilisieren und zu pflegen Feuchtigkeit, Synapsenbildung zu erleichtern.
2. Immunocytochemistry
- Fix Kulturen (5 - 7 Tage die in vitro) in 4% Paraformaldehyd / 4% Saccharose / PBS (~ 500 & mgr; l pro Deckglas, 20 min, RT).
- Permeabilisieren Kulturen mit 0,25% Triton X-100 / PBS (~ 500 & mgr; l pro Deckglas, 5 min, RT).
- Block Kulturen mit 10% normalem Eselserum in PBS (~ 500 & mgr; l pro Deckglas, 30 min, RT) vor Antibody Färbung. Inkubieren mit primären Antikörpern O / N bei 4 ° C. Verwenden Sie die folgenden primären Antikörpern: anti nAChRs (α 4 -ECD 1: 500; anti-α-Untereinheiten 5, 1: 500), anti-vesikulären Glutamattransporter 1 (1: 250), anti-GAD65 (1: 100).
- Waschen Sie primäre Antikörper mit PBS (3 mal / ~ 500 ul pro Deckglas, 5 min) und dann inkubieren Kulturen in Sekundärantikörper Alexa 488 konjugierten (~ 500 & mgr; l pro Deckglas, 1: 500) oder Alexa 594 (~ 500 & mgr; l pro Deckglas , 1: 500) für 1 h bei 37 ° C.
- Vor der Fixierung für Etikettieroberfläche α7 * nAChRs für 45 min bei 37 ° C: Kulturen in αBgTx Alexa 594 konjugiert inkubieren (1000 in Kulturmedien ~ 500 ul pro Deckglas 1).
- Halterung und Dichtung Deckgläser.
- Machen Sie Bilder mit einem Fluoreszenzmikroskop mit Plan-Apochromat Objektive (20x mit 0,8 NA oder 63X Öl mit 1,4 NA) ausgestattet und einer CCD-Kamera.
3. FM1-43 Based Vesicular Fusion
- Pflegen Kulturen (5 - 7 Tage die in vitro) in einem bildgebenden Kammer, montieren Sie die Kammer auf Spinning Platten konfokalen Mikroskop. Kontinuierlich durchströmen (1 ml / min) mit HBS-Cocktail bei RT.
- Stoppen Perfusion und Last Kulturen mit 10 & mgr; M in 56 mM FM1-43 K + ACSF (~ 500 & mgr; l) für 90 sec (Färbung), waschen externen Farbstoff entfernt 15 Minuten mit Ca 2+ frei HBS, enthaltend ADVASEP-7 (0,1 mm) membrangebundene FM1-43 abzufangen.
- Stimulieren die Kulturen mit 56 mM K + ACSF (~ 500 & mgr; l) ohne FM1-43 für 120 sec (Entfärben), laden Kulturen mit FM1-43 unter den gleichen Bedingungen und nachwaschen mit Ca 2+ frei HBS, enthaltend ADVASEP-7 15 min.
- Erwerben FM1-43 Fluoreszenzbilder mit sich drehenden Scheibe konfokalen Mikroskop mit einem Plan-Apochromat Objektiv (60X Wasser mit 1,4 NA, Anregung 488 nm, Emission 530 nm) und die Aufnahmen mit einer CCD-Kamera ausgestattet.
- Sammeln Basis FM1-43 Fluoreszenzbilder (alle 2 s 1 min) Als Pre-Nikotin-Steuerung; gelten Nikotin (1 uM) durch schnelle Durchblutung (2 ml / min) für 1 min, und dann waschen Nikotin mit HBS-Cocktail. Halten Sie Capture-Zeitraffer-Bilder vor, während und nach dem Nikotin-Anwendung alle 2 Sek 5 Min.
- Quantifizieren FM1-43 Fluoreszenzintensität vor (F-Färbung) und nach (F Entfärben) Nikotin-Anwendung an jedem synaptischen bouton.
- Berechnen Gesamtmenge an freisetzbarem FM1-43 Fluoreszenz entlang vHipp Axone durch Quantifizierung der Differenz FM1-43 Fluoreszenzintensität vor und nach dem Nikotin-Anwendung (& Dgr; F = F Färbung -F Entfärbung). Analyse Fraktion von Fluoreszenzintensitätsabnahme nach Nikotin mit der folgenden Gleichung: F = & Dgr; F% Abnahme / F-Färbung.
4. Calcium Imaging
- (- 7 Tage in vitro 5) schnell mit normalen HBS, dann laden Kulturen mit 5 & mgr; M Fluo-4 Ca 2+ Anzeige (Kulturen SpülenAM-Ester) und 0,02% Pluronic F-127 in HBS (2 ml) für 30 min bei 37 ° C und 5% CO 2.
- Waschen Sie Fluo-4-Lösung mit HBS (3-mal / 5 min). Zurück Kulturen Inkubator (37 ° C / 5% CO 2) für mindestens 30 min.
- Aufrechtzuerhalten Kulturen in derselben Abbildungskammer und gleichen Bedingungen wie in FM1-43 basierend Vesikelfusion Abschnitt beschrieben (siehe Schritt 3.1).
- Sammeln Fluo-4 Fluoreszenzbilder der axonalen Projektionen von den vHipp Mikro-Scheiben mit einem Plan-Apochromat Objektiv (60X Wasser mit 1,4 NA, Anregung 488 nm, Emission 530 nm) und einer CCD-Kamera.
- Sammeln Basis Fluo-4 Fluoreszenzbilder (alle 10 s für 2 min) als vorge Nikotin Steuer gelten Nikotin (1 uM) durch rasche Perfusion (2 ml / min) für 1 min, und dann waschen Nikotin mit HBS-Cocktail. Halten Sie Capture-Zeitraffer-Bilder vor, während und nach dem Nikotin-Anwendung alle 10 Sek 30 Min.
- Speichern Sie alle Bilder der Ausgangs Fluo-4 Fluoreszenz-Aufnahmen, Export als eine Reihe vonTIFF-Format Bilder für die weitere Analyse.
- Sammeln Sie die integrierte Intensität der Fluo-4 Fluoreszenz entlang vHipp Axone vor und nach Nikotin-Anwendung.
- Normalisieren integrierten Fluoreszenzintensität mit der folgenden Gleichung: & Dgr; F / F 0 = (FF 0) / F 0 ist, wobei F 0 die hintergrundkorrigierten vorge Nikotin integrierten Fluoreszenzintensität und F ist die integrierte Fluoreszenzintensität entlang vHipp Axone zu jedem Zeitpunkt nach Nikotin-Anwendung. Zu analysieren und zu plotten normalisierte integrierte Fluoreszenzintensität.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Die eingesetzte Zubereitung umfasst chimäre Gen Kokulturen vHipp-NACC Schaltungen in vitro. Projektionen aus vHipp microslices ausgeht, als präsynaptischen Axon Eingang können synaptische Kontakte mit postsynaptischen Ziele, die verteilt Neuronen aus NACC machen. Nikotin induzierte eine anhaltende (≥ 30 min) Erleichterung der glutamatergen Übertragung von NACC Neuronen durch vHipp innerviert Axone 21 und verlängert Calcium-Signal entlang vHipp Axone 5 über präsynaptischen α7 nAChR *.
Abbildung 1 zeigt direkt, dass die Vorsprünge aus den vHipp Mikroscheiben sind glutamatergen (VGLUT1 positiv) und dass der Kontakt mit dispergierten GABAergen mittelgroßen Projektionsneuronen von NACC gemacht (GAD positiv, 1C, D). Sowohl α7 * und nicht * α7 nAChR (einschließlich α4 und α5-Untereinheiten) wurden entlang der Axone vHipp (1E-G) und speziell auf Seiten gefundenwo vHipp Projektionen kontaktieren NACC Neuronen. Es sollte beachtet werden, dass dispergierte Neuronen aus NACC nicht exprimieren α7 * nAChRs (Abbildung 1 H) ist; dh die Rezeptor-Cluster an Kontakten sind streng präsynaptischen (1I), siehe auch Abbildung 1 in Referenz 5.
Sobald die chimären Co-Kulturen festgelegt sind, die Live-Darstellung von [Ca 2+] i und synaptischen Vesikeln Fusion entlang vHipp Axone mit und / oder ohne Nikotin kann für bis zu 30 Minuten ohne erkennbare Schäden an den Nervenzellen aufgenommen werden.
Repräsentative Bilder, Zeitraffer-Filme und Quantifizierungen für Nikotin-induzierte Fluo-4 [Ca 2+] i Signalisierung entlang vHipp Axone sind in Abbildung 2 und Supplemental Film 1 und 2 dargestellt. Wir haben festgestellt, dass die Aktivierung von vHipp nAChRs durch Nikotin induziert anhalt Ca 2+ -Einstrom in präsynaptischen Axone (2A, D). Die anhaltende PhaseNikotin induzierte Zunahme der [Ca 2+] i Signalisierung entlang vHipp Axonen wurde durch die spezifische α7-nAChR-Antagonisten * αBgTx aber nicht durch die nicht-α7-nAChR-Antagonisten * DHβE (2A-C) blockiert.
Direkte Visualisierung der aktivitätsabhängigen FM1-43 Farbstoff Endozytose und Exocytose wurde verwendet, um indirekt die präsynaptische Freisetzung von Neurotransmittern 23, 24 zu überwachen. Hierbei sind repräsentative Bilder und Quantifizierung für nikotininduzierten Vesikelfusion entlang vHipp Axone durch FM1-43 sichtbar in Abbildung 3 (3A, C). Die Anwesenheit von präsynaptischen α7 * nAChRs ist für maximal Nikotin induzierten Vesikelfusion und Freisetzung von Neurotransmittern (3B, C) erforderlich.
Abbildung 1. Synaptic Co-Kultur von vHipp mit NACC ermöglicht examination der präsynaptischen Lokalisierung nAChRs. (AC) Schematische Karikatur von Genotyp-spezifischen in vitro-Schaltungen (C) durch separate Beschichtung von ventralen Hippocampus / Subiculum (A) hergestellt. Scheiben von einem einzelnen WT oder α7 - / - Maus und verteilt Neuronen aus WT Nucleus accumbens (B). Aq, Aquädukt (Sylvius), DG, Gyrus dentatus, MM, medial Mamillarlinie Kern; PMCO, posteromedial kortikalen Mandelkern; rf, rhinal Fissur, fmi, Zange minor des Corpus callosum, LV, Seitenventrikel; Tu, Bulbus olfactorius; VP , ventralen pallidum. (D) vHipp microslices erweitern VGLUT1 positive (rot) axonalen Projektionen, die GAD 65 positiv (grün) kontaktieren NACC Neuronen (weiße Pfeile sind Beispiele für diesen Kontaktstellen). Maßstab: 10 & mgr; m (E.-G) Repräsentative Aufnahmen von WT vHipp Axone (Färbung mit VGLUT1, grün) zur α4 gezeigt * nAChR (E), α5 * nAChR (F) und Oberflächen α7 nAChR * (G) Färbung in rot-Cluster (weiße Pfeile). Maßstab:.. 5 & mgr; m (H) Es gibt keine Oberflächen α7 nAChR * Clustern verteilt GABAergen Neuronen (GAD65 positive) von allein NACC (I) Red "Cluster" von Oberflächen α7 nAChR * (weiße Pfeile) in denen zu sehen ist dispergiert Neuronen co-kultiviert mit vHipp microslices. Maßstab:. 5 & mgr; m Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Synaptic Co-Kultur von vHipp mit NACC ermöglicht die Untersuchung von Nikotin induzierten Calcium-Signaling entlang vHipp Axone. (A) Repräsentative Fluo-4-Bilder von Kalzium gebunden Fluo-4 in Pseudofarbskala entlang einer WT vHipp Axon vor (oben), 1 '(Mitte) und 30' (unten) nach Nikotin-Anwendung. Die länger anhaltende Phase (30 ') des Nikotin-induzierte Ca 2+ Reaktion wird durch Zugabe des α7 eliminiert * nAChR selektiver Antagonist αBgTx (100 nM) (B), aber nicht durch die Zugabe des nicht-α7-nAChR-selektive Antagonisten * DHβE (1 & mgr; M) (C). Maßstab: 5 um (D) repräsentatives Diagramm der normalisierten Fluo-4 integrierte Fluoreszenzintensität von einer Live-WT vHipp Axon mit Nikotin (1 uM) für 1 min perfundiert.. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Synaptic Co-Kultur von vHipp mit NACC ermöglicht die Untersuchung von Nikotin induzierten vesikulären Freisetzung von Neurotransmittern (mit FM1-43) entlang vHipp Axone. (A) Repräsentative Bilder der WT vHipp Axone vor (oben) und nach (unten) Nikotin-Anwendung (mit FM1-43, grün geladen). (B) Repräsentative Bilder der WT vHipp Axone (mit FM1-43 geladen, mit α7 vorbehandelt * nAChR selektiver Antagonist αBgTx 15 min) vor (oben) und nach (unten) Nikotin-Anwendung. Maßstab:. 5 & mgr; m (C) zeigt die Quantifizierung der Veränderungen in der axonalen FM1-43 Fluoreszenz (F Abnahme) folgende Nikotinbehandlung in der Abwesenheit (WT) oder Anwesenheit (WT + αBgTx) des α7 * nAChR-Antagonisten. Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Supplemental Film 1: Zeitraffer-Live-Bildgebung der basalen Fluo-4 / Ca 2+ Fluoreszenz entlang vHipp Axone.
Die Zeitrafferbilder von Fluo-4 / Ca 2+ Fluoreszenz entlang vHipp Axone wurden mit einem 60x Objektivlinse Wasser alle 10 Sek für 30 min mit einer sich drehenden Scheibe konfokalen Mikroskop erworben. Erworbene Bilder wurden auf Pseudo-Farbskala angezeigt und wiedergegeben als Film auf 2 Bilder pro s. Dieser Film zeigt die Grundlinie des Fluo-4 / Ca 2+ Fluoreszenzaktivität zusammen leben WT vHipp Axon mit HBS Cocktail perfundiert.
Supplemental Movie 2: Zeitraffer-Live-Bildgebung von Nikotin induzierte anhalt Fluo-4 / Ca 2+ Fluoreszenz entlang vHipp Axone.
Die Zeitrafferbilder von Fluo-4 / Ca 2+ Fluoreszenz entlang vHipp Axone wurden mit einem 60x Objektivlinse Wasser alle 10 Sek für 30 min mit einer sich drehenden Scheibe konfokalen Mikroskop erworben. Erworbene Bilder wurden auf Pseudo-Farbskala angezeigt und wiedergegeben als Film bei 2 Bildern pro Sekunde. Dieser Film zeigt, Nikotin (1 & mgr; M, in einem Zeitpunkt 43 durchströmt, ausgewaschen mit HBS-Cocktail zu dem Zeitpunkt 49) induzierten Fluo-4 / Ca 2+ Fluoreszenzaktivität zusammen leben WT vHipp Axon. Nikotin-Anwendung erhöht die Fluo-4 / Ca 2+ Fluoreszenzintensität entlang vHipp Axone.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Das Co-Kulturpräparat beschrieben re-capitulates ventralen Hippocampus-accumbens-Schaltungen in vitro. Diese Zubereitung ermöglicht relativ einfache und sichere Überprüfung der räumlichen und zeitlichen Verläufe von denen die Aktivierung des präsynaptischen nAChRs ELICIT verbesserte glutamaterge Transmission 5, 21.
Co-Kulturen werden als das Wachstum der verschiedenen spezifischen Zelltypen in eine Schüssel, die physiologischen Bedingungen in vitro zur Verfügung stellen kann, um in vivo-ähnliche Funktion zu demonstrieren definiert. Konventionelle Neuron-Neuron-Co-Kulturen haben, neurowissenschaftlichen Forschung zur Untersuchung der synaptischen Interaktionen zwischen verschiedenen Zelltypen eingeführt. Allerdings ist es schwer, die Pre- und Post-Webseiten von Synapsen in diesen Co-Kulturen zu identifizieren. Diese Microslice-distanzierte Neuron Co-Kultur-Protokoll ermöglicht eine einfache Erkennung der präsynaptischen Axonen und postsynaptischen Ziele. Verwendung microslices aus verschiedenen Hirnregionen of transgene Mauslinie, die verschiedene fluoreszierende Proteine, kann dieses Protokoll auch verwendet, um Axon Axon-Wechselwirkungen zu untersuchen.
Der entscheidende Schritt des Microslice dissoziierten Neuronen Kokultur Protokoll stellt eine stabile Umgebung für die Anheftung der Explantate zu ermöglichen, das Auswachsen der Vorsprünge und die Bildung der Synapsen. Plattieren der microslices in einem minimalen Volumen von Medien und die Aufrechterhaltung der Kulturplatten auf angefeuchtetes steriles Gazekompressen sind die zwei wichtigsten Schritte für Microslice Befestigung und Synapsenbildung. Die wichtigste Einschränkung dieser Co-Kultur-Protokoll ist, dass nicht alle verteilt NACC Neuronen bilden funktionelle Synapsen mit vHipp Axone.
Durch die Veränderung der Genotyp der prä- und postsynaptischen Komponenten bietet dieses Präparat einen informativen Ansatz, um die Vor- und postsynaptischen Mechanismen der synaptischen Plastizität zu untersuchen. Drei unterschiedliche Funktionen dieser Vorbereitung ist es ideal für diese Studien. Gehirn rEGIONEN, die normalerweise in vivo über Lichtpfade, die nicht aufrechterhalten werden kann oder leicht in akuten Scheiben identifiziert, angeschlossen sind, können in diesem in vitro-Herstellung kombiniert werden. Pre- und Post-synaptische Komponenten kommen aus verschiedenen Mäusen machen eine unabhängige Veränderung entweder der vor oder nach der synaptischen Genotyp. Durch Plattieren prä- und postsynaptischen Komponenten zu verschiedenen Zeitpunkten, ist es möglich, selektiv exprimieren exogene Gene entweder in der prä- oder postsynaptischen Neuronen.
Nikotin-induzierte Ca 2+ Transienten (in Sekunden bis Minuten Bereich) durch Aktivierung von nAChR in kultivierten Neuronen, Astrozyten gemeldet und in verschiedenen Zelllinien, die nAChRs 25-27 auszudrücken. Allerdings sind die meisten dieser Studien nicht die Langzeitwirkungen (über 10 min) von kurzer Zeit Nikotin-Exposition vor allem auf Foto Beschädigung während langfristige Bildgebung zu erkennen. Durch Verwendung der oben und schnelle Spinnscheibe konfokale Bildsammlung beschriebenen Kulturprotokoll,Nikotin-induzierte Ca 2+ Signalisierung synaptischen Vesikel-Fusion und Glutamat-Freisetzung kann bis zu 1 h ohne sichtbare Schäden an den Nervenzellen aufgenommen werden (Supplemental Film 1, 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Culture Media (50 ml) | |||
| Neurobasal | GIBCO | 10888022 | 48 ml |
| B-27 Supplements | GIBCO | 0080085-SA | 1 ml |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 10908-010 | 0.5 ml |
| GlutaMAX Supplement | GIBCO | 35050-061 | 0.5 ml |
| Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | GIBCO | 15140-122 | 20 ng/ml |
| 2. washing media (HBSS, 100 ml) | |||
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | GIBCO | 14175-095 | 99 ml |
| HEPES ( 1M) | GIBCO | 15630-130 | 1 ml |
| 3. HEPES buffered saline (HBS) pH=7.3 | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | 135 mM |
| KCl | Sigma | P9333 | 5 mM |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | 1 mM |
| CaCl2, | Sigma | C1016 | 2 mM |
| HEPES | Sigma | H3375 | 10 mM |
| Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |
| 4. HBS Cocktail for live imaging pH=7.3 | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | 135 mM |
| KCl | Sigma | P9333 | 5 mM |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | 1 mM |
| CaCl2, | Sigma | C1016 | 2 mM |
| HEPES | Sigma | H3375 | 10 mM |
| Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |
| tetrodotoxin | Tocris | 1078 | 2 µM |
| bicuculline | Tocris | 131 | 10 µM |
| D-AP-5 | Tocris | 105 | 50 µM |
| CNQX | Tocris | 1045 | 20 µM |
| LY341495 | Tocris | 1209 | 10 µM |
| 5. Calcium-free HBS pH=7.3 | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | 135 mM |
| KCl | Sigma | P9333 | 5 mM |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | 1 mM |
| HEPES | Sigma | H3375 | 10 mM |
| Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |
| 6. 56 mM Potassium ACSF pH=7.4 | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | 119 mM |
| KCl | Sigma | P9333 | 56 mM |
| MgSO4.7H | Sigma | M1880 | 1.3 mM |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | 2.5 mM |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | 1 mM |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | 26.2 mM |
| Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |
References
- Changeux, J. P., et al. Brain nicotinic receptors: structure and regulation, role in learning and reinforcement. Brain Res Brain Res Rev. 26 (2-3), 198-216 (1998).
- Levin, E. D. Nicotinic receptor subtypes and cognitive function. J Neurobiol. 53 (4), 633-640 (2002).
- Dani, J. A., Bertrand, D. Nicotinic acetylcholine receptors and nicotinic cholinergic mechanisms of the central nervous system. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 47, 699-729 (2007).
- Mineur, Y. S., Picciotto, M. R. Nicotine receptors and depression: revisiting and revising the cholinergic hypothesis. Trends Pharmacol Sci. 31 (12), 580-586 (2010).
- Zhong, C., Talmage, D. A., Role, L. W. Nicotine elicits prolonged calcium signaling along ventral hippocampal axons. PloS one. 8 (12), e82719 (2013).
- McGehee, D. S., Heath, M. J., Gelber, S., Devay, P., Role, L. W. Nicotine enhancement of fast excitatory synaptic transmission in CNS by presynaptic receptors. Science. 269 (5231), 1692-1696 (1995).
- Gray, R., Rajan, A. S., Radcliffe, K. A., Yakehiro, M., Dani, J. A. Hippocampal synaptic transmission enhanced by low concentrations of nicotine. Nature. 383 (6602), 713-716 (1996).
- Dickinson, J. A., Kew, J. N., Wonnacott, S. Presynaptic alpha 7- and beta 2-containing nicotinic acetylcholine receptors modulate excitatory amino acid release from rat prefrontal cortex nerve terminals via distinct cellular mechanisms. Mol Pharmacol. 74 (2), 348-359 (2008).
- Zappettini, S., Grilli, M., Salamone, A., Fedele, E., Marchi, M. Pre-synaptic nicotinic receptors evoke endogenous glutamate and aspartate release from hippocampal synaptosomes by way of distinct coupling mechanisms. Br J Pharmacol. 161 (5), 1161-1171 (2010).
- Zappettini, S., et al. Presynaptic nicotinic alpha7 and non-alpha7 receptors stimulate endogenous GABA release from rat hippocampal synaptosomes through two mechanisms of action. PloS one. 6 (2), e16911 (2011).
- Fabian-Fine, R., et al. Ultrastructural distribution of the alpha7 nicotinic acetylcholine receptor subunit in rat hippocampus. J Neurosci. 21 (20), 7993-8003 (2001).
- Jones, I. W., Barik, J., O'Neill, M. J., Wonnacott, S. Alpha bungarotoxin-1.4 nm gold: a novel conjugate for visualising the precise subcellular distribution of alpha 7* nicotinic acetylcholine receptors. J Neurosci Methods. 134 (1), 65-74 (2004).
- Nashmi, R., et al. Assembly of alpha4beta2 nicotinic acetylcholine receptors assessed with functional fluorescently labeled subunits: effects of localization, trafficking, and nicotine-induced upregulation in clonal mammalian cells and in cultured midbrain neurons. J Neurosci. 23 (37), 11554-11567 (2003).
- Drenan, R. M., et al. Subcellular trafficking, pentameric assembly, and subunit stoichiometry of neuronal nicotinic acetylcholine receptors containing fluorescently labeled alpha6 and beta3 subunits. Mol Pharmacol. 73 (1), 27-41 (2008).
- Wu, J., et al. Electrophysiological, pharmacological, and molecular evidence for alpha7-nicotinic acetylcholine receptors in rat midbrain dopamine neurons. J Pharmacol Exp Ther. 311 (1), 80-91 (2004).
- Parikh, V., Ji, J., Decker, M. W., Sarter, M. Prefrontal beta2 subunit-containing and alpha7 nicotinic acetylcholine receptors differentially control glutamatergic and cholinergic signaling. J Neurosci. 30 (9), 3518-3530 (2010).
- Nayak, S. V., Dougherty, J. J., McIntosh, J. M., Nichols, R. A. Ca(2+) changes induced by different presynaptic nicotinic receptors in separate populations of individual striatal nerve terminals. J Neurochem. 76 (6), 1860-1870 (2001).
- Richards, C. I., et al. Trafficking of alpha4* nicotinic receptors revealed by superecliptic phluorin: effects of a beta4 amyotrophic lateral sclerosis-associated mutation and chronic exposure to nicotine. J Biol Chem. 286 (36), 31241-31249 (2011).
- Colombo, S. F., Mazzo, F., Pistillo, F., Gotti, C. Biogenesis, trafficking and up-regulation of nicotinic ACh receptors. Biochem Pharmacol. 86 (8), 1063-1073 (2013).
- St John, P. A. Cellular trafficking of nicotinic acetylcholine receptors. Acta Pharmacol Sin. 30 (6), 656-662 (2009).
- Zhong, C., et al. Presynaptic type III neuregulin 1 is required for sustained enhancement of hippocampal transmission by nicotine and for axonal targeting of alpha7 nicotinic acetylcholine receptors. J Neurosci. 28 (37), 9111-9116 (2008).
- Jacobowitz, D. M., Abbott, L. C. Chemoarchitectonic Atlas of the Developing Mouse Brain. , CRC Press. New York. (1998).
- Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. J Neurosci. 12 (2), 363-375 (1992).
- Amaral, E., Guatimosim, S., Guatimosim, C. Using the fluorescent styryl dye FM1-43 to visualize synaptic vesicles exocytosis and endocytosis in motor nerve terminals. Methods Mol Biol. 689, 137-148 (2011).
- Garduno, J., et al. Presynaptic alpha4beta2 nicotinic acetylcholine receptors increase glutamate release and serotonin neuron excitability in the dorsal raphe nucleus. J Neurosci. 32 (43), 15148-15157 (2012).
- Guo, J. Z., Liu, Y., Sorenson, E. M., Chiappinelli, V. A. Synaptically released and exogenous ACh activates different nicotinic receptors to enhance evoked glutamatergic transmission in the lateral geniculate nucleus. J Neurophysiol. 94 (4), 2549-2560 (2005).
- Szabo, S. I., Zelles, T., Vizi, E. S., Lendvai, B. The effect of nicotine on spiking activity and Ca2+ dynamics of dendritic spines in rat CA1 pyramidal neurons. Hippocampus. 18 (4), 376-385 (2008).
