Introduction
Cholinerge modulatie circuit exciteerbaarheid bij aan fundamentele aspecten van cognitie en veranderde cholinerge modulatie is een kenmerk van neurodegeneratieve en neuropsychiatrische stoornissen, waaronder de ziekte van Alzheimer, ziekte van Parkinson, schizofrenie en verslaving 1-4. Een gevestigde mechanisme cholinerge vergemakkelijking van synaptische transmissie in het centrale zenuwstelsel is via directe activatie van nAChRs gelokaliseerd op pre-synaptische plaatsen. Activatie van deze pre-synaptische receptoren leidt tot intracellulaire Ca2 + ([Ca2 +] i) in presynaptische terminals verhoogd - zowel direct, door de relatief hoge geleiding door calcium bepaalde nAChR subtypes en indirect via intracellulaire signalering cascades 5, en zodoende neurotransmitter release. In feite is de activatie van presynaptische nAChRs in verband met veranderingen in afgifte van diverse neurotransmitters zoals glutamaat, GABA, ACh, eennd dopamine 6-10. Hoewel deze werkwijze is onderzocht Indirect door elektrofysiologische werkwijzen op diverse synapsen, optische reporters van [Ca2 +] i en synaptische vesicles recycling mogelijk directer en tijdelijk nauwkeurige meting van presynaptische verschijnselen.
Pre-synaptische lokalisatie van nAChRs is overtuigend aangetoond met directe immuno-goud etikettering van nAChRs bij het elektron microscopische (EM) niveau 11,12. Verscheidene andere technieken zijn ook gebruikt voor de nAChR lokalisatie indirect pakken, onder detectielocaties van nAChRs subunit- fluorescerend eiwit chimaera in gekweekte neuronen 13,14, elektrofysiologische registratie van nAChR stromen in synaptische terminals 15,16, bewaken nicotine geïnduceerde veranderingen in [Ca 2+] i in synaptische zenuwuiteinden door live cell imaging 17, en indirecte controle van de neurotransmitters in de synaptische terminal doorlive cell imaging technieken fluorescente indicatoren, waaronder exocytose van synaptische blaasjes bekeken styrylkleurstoffen amfipatische FM kleurstoffen (FM1-43 en FM4-64) en / of synapto-pHluorin en specifieke neurotransmitter fluorescente reporters, zoals CNiFERs van ACh en iGluSnFr voor glutamaat 18-20. Kortom, deze de huidige benaderingen voor de identificatie van pre-synaptische lokalisatie van nAChRs zijn ingewikkeld en vereisen speciale systemen en technieken voor betrouwbare identificatie en fysiologische bewaking van pre-synaptische activiteit mogelijk.
Hier beschrijven we protocollen en apparatuur voor een in vitro co-kweeksysteem van een ventrale hippocampus (vHipp) - nucleus accumbens (NACC) schakeling die directe toegang tot het identificeren en zowel pre- en postsynaptische elementen van synaptische transmissie analyse verschaft. We tonen voorbeelden van pre-synaptische lokalisatie van nAChRs en de live-cell imaging van nAChR gemedieerde Ca 2+ signalering en neurotransmitter vrijlating along vHipp axonen. Een natuurlijke (en eenvoudige) uitbreiding van het protocol hier gepresenteerde is de bereiding van pre- en post-synaptische contacten omvat neuronen van verschillende genotypen. Op deze wijze wordt de bijdrage van een bepaald genproduct aan de pre- en / of postsynaptische mechanismen van modulatie kan direct worden bepaald.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de National Institutes of Health Guide voor de Zorg en gebruik van proefdieren uitgevoerd (NIH Publications No. 80-23, herzien 2012) en studies werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en te gebruiken voor onderzoek Commissies bij Stony Brook University (# 1618 en # 1792).
1. vHipp-NACC Synaptic Co-culturen
- Offer muizen (postnatale dag 0-3, van wild-type (WT) of α7 nAChRs transgene muis lijn) met CO 2. Onthoofden elke pup en sla de staart in een 1,5 ml centrifugebuis voor post facto genotypering. Voer de volgende stappen in een gesteriliseerde kap.
- Verwijder de bovenkant van de schedel met een schaar en forceps de gehele hersenen bloot. Vanaf het moment waar de cerebrale cortex gedeelte van elkaar caudaal, het verkrijgen van een coronale sectie die het achterste cortex inclusief de vHipp 5,21 onder een dissectie microscoop bevat.
- Ontleden vHipp weefsel stroken met het CA1-subiculum regio volgens een ontwikkeling van de hersenen van muizen atlas 22 (Figuur 1A). Transfer naar een 35 mm cultuur schotel met koude cultuur media (4 ° C), snijd ze in kleine dunne plakjes (ongeveer 100 micrometer x 100 micrometer microslices).
- Pre-incubeer 12 mm poly-D-lysine / laminine beklede dekglaasjes in 24 well weefselkweek platen met kweekmedium (~ 500 ul) gedurende ten minste 30 min in de incubator bij 37 ° C. Verwijder media voordat plating microslices.
- Plaat met een vuur gepolijste Pasteur pipet in het midden van het dekglaasje met een minimale hoeveelheid medium (~ 50 pi gemaakt met ~ 20 stuks microslices) voor bevestiging van de explantaten vergemakkelijken. Plate vHipp microslices afkomstig van een enkel dier (ofwel de + / + of - / - genotype van de transgene α7 lijn) op elke dekglaasje.
- Na de explantaten vestigen op de dekglaasje, zachtjes toe te voegen extra media (~ 100 pi) door The wand zodat het niveau van het materiaal hoog genoeg is om volledig te bedekken de explantaten op de periferie, maar niet die in het midden van het dekglaasje.
- Na een O / N incubatie bij 37 ° C, 5% CO 2-incubator, dispergeren NACC neuronen uit embryonale dag 18 tot postnatale dag 1 WT-muizen en aan de explantaten.
- Ontleden NACC weefsels volgens een zich ontwikkelende hersenen van muizen atlas 20 (Figuur 1B).
- In kleine stukjes gesneden (ongeveer 500 pm × 500 micrometer microslices) en transfer naar een 15 ml buis.
- Behandel met 0,25% trypsine (2 ml) gedurende 15 min bij 37 ° C. Wash weefsel brokken driemaal wassen met koud medium (5 ml, 4 ° C), gevolgd door een wassing in koud kweekmedium (5 ml, 4 ° C). Laat schorsing te rusten voor 5 min in elke wasbeurt stap, en giet af supernatant zorgvuldig.
- Distantiëren cellen door zachte trituratie in 2 ml van de cultuur media met een licht-vuur gepolijste Pasteur pipet.
- Transfer celsuspensie aan een andere 15 ml buis en centrifugeer bij 2000 x rpm gedurende 5 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in kweekmedia op 1 ml per 6 pups. Verspreiden cellen door voorzichtig pipetteren in de media meerdere malen met een vuur gepolijste Pasteur pipet.
- Voeg 0,25 ml van verspreide NACC cellen om elke dekglaasje met vHipp explantaten.
- Handhaaf de kweken in een bevochtigde 37 ° C, 5% CO2 incubator. Plaats de cultuur platen op bevochtigde steriele gaasjes mechanisch stabiliseren en luchtvochtigheid te behouden, het vergemakkelijken van synapsvorming.
2. Immunocytochemie
- Fix kweken (5-7 dagen in vitro) in 4% paraformaldehyde / 4% sucrose / PBS (~ 500 ul per dekglaasje, 20 min, RT).
- Permeabilize kweken met 0,25% Triton X-100 / PBS (~ 500 ul per dekglaasje, 5 min, kamertemperatuur).
- Block kweken met 10% normaal donkey serum in PBS (~ 500 ul per dekglaasje, 30 min, RT) voordat Antibody kleuring. Incubeer met primaire antilichamen O / N bij 4 ° C. Gebruik de volgende primaire antilichamen: anti-nAChRs (α 4 -ECD 1: 500, anti-α 5 subunits, 1: 500), anti-vesiculaire glutamaat transporter 1 (1: 250), anti-GAD65 (1: 100).
- Was de primaire antilichamen met PBS (3 keer / ~ 500 ul per dekglaasje, 5 min) en vervolgens incubeer culturen in secundaire antilichamen geconjugeerd met Alexa 488 (~ 500 ul per dekglaasje, 1: 500) of Alexa 594 (~ 500 ul per dekglaasje , 1: 500) gedurende 1 uur bij 37 ° C.
- Incubeer culturen αBgTx geconjugeerd met Alexa 594 (~ 500 ul per dekglaasje, 1: 1000 in cultuurmedia) gedurende 45 min bij 37 ° C voorafgaand aan fixatie etiketteren oppervlak α7 * nAChRs.
- Mount en seal dekglaasjes.
- Beelden vastleggen met een fluorescentiemicroscoop uitgerust met Plan-Apochromat doelstellingen (20X met 0,8 NA of 63x olie met 1.4 NA) en een CCD-camera.
3. FM1-43 Based Vesicular Fusion
- Handhaving van culturen (5-7 dagen in vitro) in een imaging kamer, monteren de kamer op de draaiende schijf confocale microscoop. Continu perfuseren (1 ml / min) met HBS cocktail bij RT.
- Stop perfusie en belasting culturen met 10 uM FM1-43 in 56 mM K + ACSF (~ 500 ul) gedurende 90 sec (vlekken), wassen externe kleurstof weg gedurende 15 minuten met Ca 2+ vrije HBS met ADVASEP-7 (0,1 mM) naar membraangebonden FM1-43 vangen.
- Stimuleren van de kweken met 56 mM K + ACSF (~ 500 ul) zonder FM1-43 voor 120 sec (ontkleuren), herladen kweken met FM1-43 onder dezelfde omstandigheden en nawassen met Ca2 + vrij HBS bevattende ADVASEP-7 voor 15 min.
- Acquire FM1-43 fluorescentie beelden met draaiende schijf confocale microscoop voorzien van een Plan-Apochromat doelstelling (60X water met 1.4 NA, excitatie 488 nm, emissie 530 nm) en foto's maken met een CCD-camera.
- Verzamel basislijn FM1-43 fluorescentiebeelden (elke 2 s gedurende 1 min) Als pre-nicotine control; toepassen nicotine (1 uM) door snelle perfusie (2 ml / min) gedurende 1 min, en daarna wassen nicotine met HBS cocktail. Houd capture time-lapse beelden voor, tijdens en na de nicotine toepassing elke 2 seconden voor 5 min.
- Kwantificeren FM1-43 fluorescentie-intensiteit vóór (F vlekken) en na (F ontkleuren) nicotine toepassing op elke synaptische Bouton.
- Bereken totale bedrag van afgeefbare FM1-43 fluorescentie langs vHipp axonen door het kwantificeren van het verschil van FM1-43 fluorescentie-intensiteit voor en na nicotine applicatie (AF = F vlekken -F ontkleuren). Analyseer fractie van de fluorescentie-intensiteit dalen na nicotine de volgende vergelijking: F = afname% AF / F kleuring.
4. Calcium Imaging
- Snel - (7 dagen in vitro 5) met een normale HBS, laad dan culturen met 5 pM Fluo-4 Ca 2+ indicator (Spoel culturenAM ester) en 0,02% Pluronic F-127 in HBS (2 ml) gedurende 30 min bij 37 ° C en 5% CO 2.
- Spoel de Fluo-4-oplossing met HBS (3 keer / 5 min). Terug culturen incubator (37 ° C / 5% CO 2) gedurende ten minste 30 min.
- Handhaving van culturen in dezelfde beeldvorming kamer en dezelfde voorwaarden als beschreven in FM1-43 gebaseerd vesiculaire fusie sectie (zie stap 3.1).
- Verzamel Fluo-4 fluorescentie beelden van axonale projecties van de vHipp micro-schijfjes met een Plan-Apochromat doelstelling (60X water met 1.4 NA, excitatie 488 nm, emissie 530 nm) en een CCD-camera.
- Verzamel basislijn Fluo-4 fluorescentiebeelden (om de 10 seconden gedurende 2 min) als pre-nicotine control toepassen nicotine (1 uM) door snelle perfusie (2 ml / min) gedurende 1 min, en daarna wassen met HBS nicotine cocktail. Blijf capture time-lapse beelden voor, tijdens en na nicotine gebruik elke 10 sec gedurende 30 minuten.
- Bewaar alle frames van de ruwe fluo-4 fluorescentie beelden, export als een reeks vanAfbeeldingen TIFF-formaat voor verdere analyse.
- Verzamel de geïntegreerde intensiteit van fluo-4 fluorescentie langs vHipp axonen voor en na nicotine applicatie.
- Normaliseren geïntegreerde fluorescentie-intensiteit met de volgende vergelijking: AF / F = 0 (FF 0) / 0 F, waarbij F 0 is de achtergrond-gecorrigeerde pre-nicotine geïntegreerde fluorescentie-intensiteit en F de geïntegreerde fluorescentie-intensiteit langs vHipp axons op elk tijdstip na nicotine applicatie. Analyseren en plot genormaliseerd geïntegreerde fluorescentie-intensiteit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De voorbereiding dienst bestaat uit gen chimerische co-culturen van vHipp-NACC circuits in vitro. Projecties afkomstig van vHipp microslices, als pre-synaptische axonale input, kan synaptische contacten met postsynaptische targets, de verspreide neuronen van NACC te maken. Nicotine veroorzaakt een aanhoudende (≥ 30 min) faciliteren van glutamatergische overdracht van NACC neuronen geïnnerveerd door vHipp axonen 21 en langdurige calcium signalering langs vHipp axonen 5 via pre-synaptische α7 * nAChRs.
Figuur 1 toont direct dat de projecties van de vHipp micro-schijfjes zijn glutamaat (vGluT1 positief) en dat de contacten zijn gemaakt met verspreide GABAergic medium stekelige neuronen van NACC (GAD positief, figuur 1C, D). Zowel α7 * en niet-α7 * nAChRs (inclusief α4 en α5 subeenheden) werden gevonden langs de vHipp axonen (Figuur 1E-G) en in het bijzonder op plaatsenwaarbij vHipp projecties contact NACC neuronen. Opgemerkt zij dat gedispergeerde neuronen tegen NACC niet α7 * nAChRs (Figuur 1H) tot expressie; dat wil zeggen de receptor clusters in contacten zijn strikt presynaptische (figuur 1I), zie ook figuur 1 in referentie 5.
Zodra het chimere co-kweken werden vastgesteld, live beeldvorming van [Ca2 +] i en synaptische vesikels fusion samen vHipp axons met en / of zonder nicotine kunnen opgenomen worden gedurende 30 min zonder zichtbare beschadiging van de neuronen.
Representatieve beelden, time-lapse filmpjes en kwantificeringen voor nicotine geïnduceerde fluo-4 [Ca 2+] i signalering langs vHipp axonen worden weergegeven in figuur 2 en Aanvullende Movie 1 en 2. We vonden dat de activering van vHipp nAChRs door nicotine induceert aanhoudende Ca 2+ influx in presynaptische axonen (Figuur 2A, D). Langdurige fasenicotine geïnduceerde stijgingen van [Ca 2,] i signalering langs vHipp axons gered door de specifieke α7 * nAChR antagonist αBgTx maar niet door de niet-α7 * nAChR antagonist DHβE (Figuur 2A-C).
Directe visualisatie van activiteitsafhankelijke FM1-43 dye endocytose en exocytose is gebruikt om te controleren indirect presynaptische neurotransmitter afgifte 23, 24. Hier representatieve beelden en kwantificering van nicotine geïnduceerde vesiculaire fusie samen vHipp axons gevisualiseerd door FM1-43 zijn getoond in figuur 3 (Figuur 3A, C). De aanwezigheid van pre-synaptische α7 * nAChRs is vereist voor maximale nicotine geïnduceerde vesikel fusie en neurotransmitters (Figuur 3B, C).
Figuur 1. Synaptic co-cultuur van vHipp met NACC laat examination van pre-synaptische lokalisatie van nAChRs. (AC) Schematische cartoon van genotype-specifieke in vitro circuits (C) bereid door afzonderlijke platen van ventrale hippocampus / subiculum (A). segmenten van een individu WT of α7 - / - muis en gedispergeerd neuronen tegen WT nucleus accumbens (B). Aq, aquaduct (Sylvius), DG, dentate gyrus, MM, mediale mammillary nucleus; PMCO, posteromediale corticale amygdaloïde nucleus, rf, rhinale spleet, FMI, tang minor van het corpus callosum, LV, laterale ventrikel; Tu, olfactorische tuberkel; VP , ventrale pallidum. (D) vHipp microslices breiden vGluT1 positieve (rood) axonale projecties die contact GAD65 positief (groen) NACC neuronen (witte pijlen zijn voorbeelden van die contact sites). Schaal bar: 10 micrometer (E.-G) Representatieve microfoto van WT vHipp axons (kleuring met vGluT1, groen) getoond voor α4 nAChR * (E), α5 * nAChR (F) en oppervlakte α7 * nAChR (G) kleuring in rood clusters (witte pijlen). Schaalbalk:.. 5 urn (H) Geen oppervlak α7 * nAChR clusters gedispergeerde GABAerge neuronen (GAD65 positief) vanaf NACC alleen (I) Red "clusters" van oppervlakte α7 * nAChR (witte pijl) zichtbaar in die verspreid neuronen co-gekweekt met vHipp microslices. Schaal bar:. 5 micrometer Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Synaptic co-cultuur van vHipp met NACC laat onderzoek van nicotine geïnduceerde calcium signaaling langs vHipp axons. (A) Vertegenwoordiger fluo-4 beelden van calcium gebonden fluo-4 in pseudo kleuren schaal langs een WT vHipp axon vóór (Top), 1 '(Midden) en 30' (onder) na nicotine applicatie. De aanhoudende fase (30 ') van de nicotine-geïnduceerde Ca2 + respons wordt geëlimineerd door toevoeging van de α7 * nAChR selectieve antagonist αBgTx (100 nM) (B), maar niet door de toevoeging van de niet-selectieve α7 * nAChR antagonist DHβE (1 uM) (C). Schaal bar: 5 micrometer (D) Vertegenwoordiger plot van genormaliseerde fluo-4 geïntegreerde fluorescentie-intensiteit van een live WT vHipp axon geperfuseerd met nicotine (1 uM) gedurende 1 min.. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Synaptic co-cultuur van vHipp met NACC laat onderzoek van nicotine geïnduceerde vesiculaire neurotransmitter vrijkomen (met FM1-43) langs vHipp axonen. (A) Representatieve beelden van WT vHipp axons (geladen met FM1-43, groen) vóór (boven) en na (onder) nicotine applicatie. (B) Representatieve beelden van WT vHipp axons (geladen met FM1-43, voorbehandeld met α7 * selectieve nAChR antagonist αBgTx gedurende 15 min) vóór (boven) en na (onder) nicotine toepassing. Schaal bar:. 5 micrometer (C) toont kwantificering van de veranderingen in de axonale FM1-43 fluorescentie (F afname) na nicotine behandeling in de afwezigheid (WT) of de aanwezigheid (WT + αBgTx) van de α7 * nAChR antagonist. Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende Film 1: Time-lapse live-imaging van basale Fluo-4 / Ca 2+ fluorescentie langs vHipp axonen.
De time-lapse beelden van Fluo-4 / Ca 2+ fluorescentie langs vHipp axonen werden verworven met een 60x objectief water lens elke 10 seconden gedurende 30 minuten met een draaiende schijf confocale microscoop. Verkregen beelden werden op pseudo kleur schaal aangegeven en afgespeeld als een film op 2 frames per s. Deze film toont de basislijn van Fluo-4 / Ca 2+ fluorescentie activiteit samen te leven WT vHipp axon geperfuseerd met HBS cocktail.
Aanvullende Movie 2: Time-lapse live-imaging van nicotine geïnduceerde aanhoudende Fluo-4 / Ca 2+ fluorescentie langs vHipp axonen.
De time-lapse beelden van Fluo-4 / Ca 2+ fluorescentie langs vHipp axonen werden verworven met een 60x objectief water lens elke 10 seconden gedurende 30 minuten met een draaiende schijf confocale microscoop. Verkregen beelden werden op pseudo kleur schaal aangegeven en afgespeeld als een film op 2 frames per seconde. Deze film toont nicotine (1 uM, perfusie in op tijdstip 43, uitgewassen met HBS cocktail op tijdstip 49) veroorzaakte Fluo-4 / Ca 2+ fluorescentie activiteit samen te leven WT vHipp axon. Nicotine toepassing verhoogde de fluo-4 / Ca 2+ fluorescentie-intensiteit langs vHipp axonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De co-kweek bereiding beschreven re-capituleert ventrale hippocampus-accumbens circuits in vitro. Dit preparaat vergunningen betrekkelijk eenvoudige en betrouwbare behandeling van de ruimtelijke en temporele profielen waardoor activatie van presynaptische nAChRs wekken verhoogde glutamaterge transmissie 5, 21.
Co-culturen worden gedefinieerd als de groei van verschillende specifieke celtypes in een gerecht die fysiologische omstandigheden kunnen verschaffen in vitro tot in vivo-achtige functie tonen. Conventionele neuron-neuron co-culturen zijn ingevoerd om neurowetenschappelijk onderzoek voor het bestuderen van synaptische interacties tussen verschillende celtypen. Het is echter moeilijk om de pre- en post-plaatsen van synapsen in deze co-kweken identificeren. Deze microslice gedissocieerde neuron co-cultuur protocol maakt gemakkelijke herkenning van de presynaptische axonen en postsynaptische targets. Met behulp van microslices uit verschillende hersengebieden of transgene muizenlijn die verschillende fluorescerende eiwitten, kan dit protocol worden gebruikt om axon axon-interacties te bestuderen.
De kritische stap van deze microslice-gedissocieerd neuronen co-kweek protocol levert een stabiele omgeving, teneinde de bevestiging van de explantaten, de uitgroei van uitsteeksels en de vorming van synapsen. Plating de microslices in een minimaal volume van de media en het behoud van de cultuur platen op bevochtigde steriele gaasjes zijn de twee belangrijke stappen voor microslice bevestiging en synapsvorming. De belangrijkste beperking van deze co-cultuur protocol is dat niet alle verspreide NACC neuronen vormen functionele synapsen met vHipp axonen.
Door het veranderen van het genotype van de pre- en post-synaptische bestanddelen, dit preparaat geeft een informatieve benadering van de pre- en postsynaptische mechanismen van synaptische plasticiteit onderzoeken. Drie verschillende kenmerken van deze voorbereiding maken het ideaal voor deze studies. Brain rREGIO 'S die normaal verbonden in vivo via vezelwegen die niet kan worden gehandhaafd, of gemakkelijk geïdentificeerd in acute plakjes kunnen worden gecombineerd in deze in vitro preparaat. Pre- en post-synaptische onderdelen komen uit verschillende muizen maken waardoor onafhankelijke wijziging van zowel de pre- of post-synaptische genotype. Door plating pre- en postsynaptische componenten op verschillende tijdstippen, is het mogelijk om exogene genen in zowel de pre- of postsynaptische neuronen selectief tot expressie.
Nicotine geïnduceerde Ca2 + transiënten (in seconden tot minuten bereik) door activering van nAChRs gerapporteerd in gekweekte neuronen, astrocyten en verschillende cellijnen die nAChRs 25-27 expressie. De meeste van deze studies niet langdurig effect (meer dan 10 min) van kort nicotine blootstelling voornamelijk door zonbeschadiging tijdens langdurige imaging detecteren. Door gebruik te maken van de cultuur protocol boven en snelle spinning-disk confocale afbeelding collectie beschreven,nicotine geïnduceerde Ca2 + signalering, synaptische vesikel fusie en glutamaat afgifte kunnen opgenomen worden gedurende 1 uur zonder zichtbare beschadiging van de neuronen (Supplemental film 1, 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Culture Media (50 ml) | |||
| Neurobasal | GIBCO | 10888022 | 48 ml |
| B-27 Supplements | GIBCO | 0080085-SA | 1 ml |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 10908-010 | 0.5 ml |
| GlutaMAX Supplement | GIBCO | 35050-061 | 0.5 ml |
| Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | GIBCO | 15140-122 | 20 ng/ml |
| 2. washing media (HBSS, 100 ml) | |||
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | GIBCO | 14175-095 | 99 ml |
| HEPES ( 1M) | GIBCO | 15630-130 | 1 ml |
| 3. HEPES buffered saline (HBS) pH=7.3 | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | 135 mM |
| KCl | Sigma | P9333 | 5 mM |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | 1 mM |
| CaCl2, | Sigma | C1016 | 2 mM |
| HEPES | Sigma | H3375 | 10 mM |
| Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |
| 4. HBS Cocktail for live imaging pH=7.3 | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | 135 mM |
| KCl | Sigma | P9333 | 5 mM |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | 1 mM |
| CaCl2, | Sigma | C1016 | 2 mM |
| HEPES | Sigma | H3375 | 10 mM |
| Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |
| tetrodotoxin | Tocris | 1078 | 2 µM |
| bicuculline | Tocris | 131 | 10 µM |
| D-AP-5 | Tocris | 105 | 50 µM |
| CNQX | Tocris | 1045 | 20 µM |
| LY341495 | Tocris | 1209 | 10 µM |
| 5. Calcium-free HBS pH=7.3 | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | 135 mM |
| KCl | Sigma | P9333 | 5 mM |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | 1 mM |
| HEPES | Sigma | H3375 | 10 mM |
| Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |
| 6. 56 mM Potassium ACSF pH=7.4 | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | 119 mM |
| KCl | Sigma | P9333 | 56 mM |
| MgSO4.7H | Sigma | M1880 | 1.3 mM |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | 2.5 mM |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | 1 mM |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | 26.2 mM |
| Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |
References
- Changeux, J. P., et al. Brain nicotinic receptors: structure and regulation, role in learning and reinforcement. Brain Res Brain Res Rev. 26 (2-3), 198-216 (1998).
- Levin, E. D. Nicotinic receptor subtypes and cognitive function. J Neurobiol. 53 (4), 633-640 (2002).
- Dani, J. A., Bertrand, D. Nicotinic acetylcholine receptors and nicotinic cholinergic mechanisms of the central nervous system. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 47, 699-729 (2007).
- Mineur, Y. S., Picciotto, M. R. Nicotine receptors and depression: revisiting and revising the cholinergic hypothesis. Trends Pharmacol Sci. 31 (12), 580-586 (2010).
- Zhong, C., Talmage, D. A., Role, L. W. Nicotine elicits prolonged calcium signaling along ventral hippocampal axons. PloS one. 8 (12), e82719 (2013).
- McGehee, D. S., Heath, M. J., Gelber, S., Devay, P., Role, L. W. Nicotine enhancement of fast excitatory synaptic transmission in CNS by presynaptic receptors. Science. 269 (5231), 1692-1696 (1995).
- Gray, R., Rajan, A. S., Radcliffe, K. A., Yakehiro, M., Dani, J. A. Hippocampal synaptic transmission enhanced by low concentrations of nicotine. Nature. 383 (6602), 713-716 (1996).
- Dickinson, J. A., Kew, J. N., Wonnacott, S. Presynaptic alpha 7- and beta 2-containing nicotinic acetylcholine receptors modulate excitatory amino acid release from rat prefrontal cortex nerve terminals via distinct cellular mechanisms. Mol Pharmacol. 74 (2), 348-359 (2008).
- Zappettini, S., Grilli, M., Salamone, A., Fedele, E., Marchi, M. Pre-synaptic nicotinic receptors evoke endogenous glutamate and aspartate release from hippocampal synaptosomes by way of distinct coupling mechanisms. Br J Pharmacol. 161 (5), 1161-1171 (2010).
- Zappettini, S., et al. Presynaptic nicotinic alpha7 and non-alpha7 receptors stimulate endogenous GABA release from rat hippocampal synaptosomes through two mechanisms of action. PloS one. 6 (2), e16911 (2011).
- Fabian-Fine, R., et al. Ultrastructural distribution of the alpha7 nicotinic acetylcholine receptor subunit in rat hippocampus. J Neurosci. 21 (20), 7993-8003 (2001).
- Jones, I. W., Barik, J., O'Neill, M. J., Wonnacott, S. Alpha bungarotoxin-1.4 nm gold: a novel conjugate for visualising the precise subcellular distribution of alpha 7* nicotinic acetylcholine receptors. J Neurosci Methods. 134 (1), 65-74 (2004).
- Nashmi, R., et al. Assembly of alpha4beta2 nicotinic acetylcholine receptors assessed with functional fluorescently labeled subunits: effects of localization, trafficking, and nicotine-induced upregulation in clonal mammalian cells and in cultured midbrain neurons. J Neurosci. 23 (37), 11554-11567 (2003).
- Drenan, R. M., et al. Subcellular trafficking, pentameric assembly, and subunit stoichiometry of neuronal nicotinic acetylcholine receptors containing fluorescently labeled alpha6 and beta3 subunits. Mol Pharmacol. 73 (1), 27-41 (2008).
- Wu, J., et al. Electrophysiological, pharmacological, and molecular evidence for alpha7-nicotinic acetylcholine receptors in rat midbrain dopamine neurons. J Pharmacol Exp Ther. 311 (1), 80-91 (2004).
- Parikh, V., Ji, J., Decker, M. W., Sarter, M. Prefrontal beta2 subunit-containing and alpha7 nicotinic acetylcholine receptors differentially control glutamatergic and cholinergic signaling. J Neurosci. 30 (9), 3518-3530 (2010).
- Nayak, S. V., Dougherty, J. J., McIntosh, J. M., Nichols, R. A. Ca(2+) changes induced by different presynaptic nicotinic receptors in separate populations of individual striatal nerve terminals. J Neurochem. 76 (6), 1860-1870 (2001).
- Richards, C. I., et al. Trafficking of alpha4* nicotinic receptors revealed by superecliptic phluorin: effects of a beta4 amyotrophic lateral sclerosis-associated mutation and chronic exposure to nicotine. J Biol Chem. 286 (36), 31241-31249 (2011).
- Colombo, S. F., Mazzo, F., Pistillo, F., Gotti, C. Biogenesis, trafficking and up-regulation of nicotinic ACh receptors. Biochem Pharmacol. 86 (8), 1063-1073 (2013).
- St John, P. A. Cellular trafficking of nicotinic acetylcholine receptors. Acta Pharmacol Sin. 30 (6), 656-662 (2009).
- Zhong, C., et al. Presynaptic type III neuregulin 1 is required for sustained enhancement of hippocampal transmission by nicotine and for axonal targeting of alpha7 nicotinic acetylcholine receptors. J Neurosci. 28 (37), 9111-9116 (2008).
- Jacobowitz, D. M., Abbott, L. C. Chemoarchitectonic Atlas of the Developing Mouse Brain. , CRC Press. New York. (1998).
- Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. J Neurosci. 12 (2), 363-375 (1992).
- Amaral, E., Guatimosim, S., Guatimosim, C. Using the fluorescent styryl dye FM1-43 to visualize synaptic vesicles exocytosis and endocytosis in motor nerve terminals. Methods Mol Biol. 689, 137-148 (2011).
- Garduno, J., et al. Presynaptic alpha4beta2 nicotinic acetylcholine receptors increase glutamate release and serotonin neuron excitability in the dorsal raphe nucleus. J Neurosci. 32 (43), 15148-15157 (2012).
- Guo, J. Z., Liu, Y., Sorenson, E. M., Chiappinelli, V. A. Synaptically released and exogenous ACh activates different nicotinic receptors to enhance evoked glutamatergic transmission in the lateral geniculate nucleus. J Neurophysiol. 94 (4), 2549-2560 (2005).
- Szabo, S. I., Zelles, T., Vizi, E. S., Lendvai, B. The effect of nicotine on spiking activity and Ca2+ dynamics of dendritic spines in rat CA1 pyramidal neurons. Hippocampus. 18 (4), 376-385 (2008).
