Introduction
Холинергическая модуляции возбудимости цепи способствует фундаментальных аспектов познания, и изменены холинергическая модуляции особенностью нейродегенеративных и психоневрологических расстройств, включая болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, шизофрения и наркомании 1-4. Установлен механизм холинергической облегчению синаптической передачи в ЦНС с помощью прямой активации nAChRs, локализованных на пресинаптических сайтов. Активация этих пресинаптических рецепторов приводит к увеличению внутриклеточного Са 2+ ([Ca 2+] I), в пресинаптических терминалах - как непосредственно, из-за относительно высокой проводимости кальция определенных подтипов нАХР, так и косвенно, через внутриклеточные сигнальные каскады 5, тем самым повышая высвобождение нейромедиаторов. В самом деле, активация пресинаптических nAChRs был связан с изменениями в выпуске широкого спектра нейротрансмиттеров, включая глутамат, ГАМК, ацетилхолина,й допамина 6-10. Хотя этот процесс был изучен с помощью электрофизиологических косвенно методы в различных синапсов, оптические репортеры [Са 2+] я и переработка синаптических пузырьков позволяют более прямой и временно точное измерение пресинаптических явлений.
Пресинаптических локализации nAChRs была убедительно показал, с прямым иммуно-золота маркировки nAChRs на электронно-микроскопических (ЭМ) уровне 11,12. Некоторые другие методы также были использованы для решения локализацию Nachr косвенно, в том числе определения местоположения nAChRs subunit- флуоресцентный белок химер в культивируемых нейронах 13,14, электрофизиологические записи нАХР токов в синаптических окончаний 15,16, мониторинг никотина индуцированных изменений в [Са 2+] я в синаптических нервных терминалов по живого изображения клеток 17 и косвенного контроля высвобождения нейромедиатора в синаптической терминала поживые методы визуализации клеток с люминесцентными показателей, в том числе экзоцитоза синаптических пузырьков просмотренных стириловых амфипатических красителей FM (FM1-43 и FM4-64) и / или synapto-pHluorin и конкретных флуоресцентных нейромедиаторов журналистами, таких как CNiFERs для АХ и iGluSnFr для глутамата 18-20. В целом, эти современные подходы для выявления пресинаптических локализации nAChRs сложны и требуют специальных систем и методов, чтобы надежно идентифицировать и физиологического мониторинга до синаптической активности.
Здесь мы опишем протоколов и оборудование для в пробирке сокультуры системы брюшной гиппокампа (vHipp) - прилежащем ядре (ССАС) цепи, которая обеспечивает прямой доступ для определения и анализа пред- и пост-синаптические компоненты синаптической передачи. Мы показываем примеры пресинаптической локализации nAChRs и живых клеток визуализации нАХР опосредованной Са 2+ сигнализации и нейромедиатор релиз Алонг vHipp аксоны. Естественно (и простой) расширение протокола, представленного здесь подготовка пред- и пост-синаптических контактов, состоящих из нейронов разных генотипов. Таким образом вклад конкретного генного продукта в пред- и / или постсинаптических механизмов модуляции может быть оценена непосредственно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с Национальными Институтами Здоровья Руководства по уходу и использованию лабораторных животных (NIH публикации N: 80-23, пересмотренная в 2012 году) и исследования были одобрены Институциональные уходу и использованию животных для научных комитетов в Стони Brook University (# 1618 и # 1792).
1. vHipp-ССАС Synaptic Co-культуры
- Жертва мышей (послеродовой день 0 - 3, от дикого типа (WT) или α7 nAChRs трансгенной линии мышей) с СО 2. Обезглавьте каждый щенок и сохранить хвост в 1,5 мл центрифужную пробирку для пост-факто генотипирования. Выполните следующие действия в стерилизованную капотом.
- Удалить верхнюю часть черепа с ножницами и щипцами, чтобы подвергнуть весь мозг. Начиная с этапе, когда кору головного мозга часть друг от друга каудально, получить корональной раздел, который содержит задние кору включая vHipp 5,21 при вскрытии микроскопом.
- Проанализируйте VТкани полоски Hipp, содержащие область СА1-подлежащая ткань в соответствии с развивающейся мозга мыши атлас 22 (рис 1А). Переход к 35-мм блюдо культуры, содержащий холодную питательных сред (4 ° C), нарезать небольшими тонкими ломтиками (около 100 мкм × 100 мкм) microslices.
- Предварительно инкубируют 12 мм поли-D-лизином / ламинин покрытием покровные стекла внутри 24-луночных планшетах для культуры тканей с культуральной среде (~ 500 мкл) в течение по крайней мере 30 мин в термостате при 37 ° С. Удалить носители до посева microslices.
- Тарелка с огневой полировкой пипетки Пастера в центре покровного стекла с минимальным количеством информации (~ 50 мкл, содержащий ~ 20 штук microslices), чтобы облегчить прикрепление эксплантов. Пластинчатые vHipp microslices происходящие из одного животного (либо + / + или - / - генотип трансгенной линии α7) на каждой покровное.
- После эксплантов оседают на покровное, мягко добавить дополнительные средства массовой информации (~ 100 мкл) по гое стенки так, чтобы уровень средств массовой информации является достаточно высоким, чтобы полностью покрыть эксплантов на периферии, а не те, в центре покровного стекла.
- После вывода / N инкубации в 37 ° C, 5% СО 2 инкубатора, разогнать ССАС нейроны из эмбриональных дней 18 послеродовой день 1 мас мышей и добавить к эксплантов.
- Рассеките из ССАС тканей в соответствии с развивающейся мозга мыши атласа 20 (рис 1B).
- Нарезать небольшими кусочками (около 500 мкм × 500 мкм) microslices и передачи в 15 мл трубки.
- Treat с 0,25% трипсина (2 мл) в течение 15 мин при 37 ° С. Стирка ткани куски три раза холодным стиральной сред (5 мл, 4 ° С), а затем одной стирки в холодной культуральной среды (5 мл, 4 ° С). Разрешить суспензии в покое в течение 5 мин в каждой стадии промывки, а затем сливают супернатант осторожно.
- Диссоциируют клетки путем осторожного растирани в 2 мл культуральной среды со слегка огневой полировкой пипетки Пастера.
- ТрансFER клеточной суспензии в другую 15 мл пробирку и центрифугируют при 2000 х оборотов в минуту в течение 5 мин. Удалить супернатант и ресуспендирования клеток в культуральной среде в количестве 1 мл на 6 детенышей. Дисперсные клеток осторожно пипеткой в СМИ несколько раз с огневой полировкой пипетки Пастера.
- Добавить 0,25 мл клеток рассеянных ССАС к каждому покровного с vHipp эксплантов.
- Поддержание культур в увлажненной 37 ° C, 5% CO 2 инкубаторе. Поместите культуры пластины на смоченной стерильной марлевой подушечки механически стабилизировать и поддерживать влажность, способствуя образованию синапсов.
2. Иммуноцитохимия
- Fix культур (5 - 7 дней в пробирке) в 4% параформальдегид / 4% сахарозы / PBS (~ 500 мкл на покровное, 20 мин, RT).
- Проницаемыми культур с 0,25% Triton X-100 / PBS (~ 500 мкл на покровное, 5 мин, RT).
- Блок культуры с 10% нормальный осел сыворотки в PBS (~ 500 мкл на покровное, 30 мин, RT) до antibodу окрашивание. Инкубируйте с первичными антителами O / N при 4 ° С. Используйте следующие первичные антитела: анти nAChRs (α 4 -ECD 1: 500; против α-субъединицы 5, 1: 500), анти-везикулярного транспортера глутамата 1 (1: 250), анти-GAD65 (1: 100).
- Вымойте первичных антител с PBS (3 раза / ~ 500 мкл на покровное, 5 мин), а затем инкубировать культур в вторичными антителами конъюгированных с Alexa 488 (~ 500 мкл на покровное, 1: 500) или Alexa 594 (~ 500 мкл на покровное , 1: 500) в течение 1 ч при 37 ° С.
- Выдержите культур в αBgTx конъюгированных с Alexa 594 (~ 500 мкл на покровное, 1: 1000 в культуральной среде) в течение 45 мин при 37 ° С до фиксации для маркировки поверхности α7 * nAChRs.
- Монтаж и уплотнение покровные.
- Захват изображений с флуоресцентного микроскопа, снабженного План-Apochromat целей (20X с 0,8 NA или 63x нефти с 1,4 NA) и ПЗС-камеры.
3. FM1-43 основе везикулярного Fusion
- Поддержание культур (5 - 7 дней в пробирке) в камере изображений, установите камеру на спиннинг диск конфокальной микроскопии. Постоянно заливать (1 мл / мин) с коктейлем HBS при комнатной температуре.
- Остановка перфузии и нагрузки культур с 10 мкМ FM1-43 в 56 мМ K + ACSF (~ 500 мкл) в течение 90 сек (окрашивание), мыть внешний краситель от 15 мин с Са 2+ свободный HBS, содержащего ADVASEP-7 (0,1 мм) чтобы убрать мусор связанный с мембраной FM1-43.
- Стимулирование культур с 56 мМ K + ACSF (~ 500 мкл) без FM1-43 в течение 120 сек (Обесцвечивание), перезагрузить культур с FM1-43 использованием тех же условий, и мыть снова Ca 2+ свободный HBS, содержащего ADVASEP-7 для 15 мин.
- Приобретение FM1-43 флуоресцентные изображения с вращающимся диском конфокальной микроскопа, снабженного цели план-Apochromat (60X воды с 1,4 NA, возбуждения 488 нм, эмиссии 530 нм) и захвата изображения с ПЗС-камерой.
- Сбор исходных изображений флуоресценции FM1-43 (каждые 2 сек в течение 1 мин), Как предварительно никотина управления; применять никотин (1 мкМ) по быстрой перфузии (2 мл / мин) в течение 1 мин, а затем промыть никотин с HBS коктейль. Держите покадровой захвата изображений до, во время и после нанесения никотина каждые 2 сек в течение 5 мин.
- Количественно FM1-43 интенсивности флуоресценции (F до окрашивания) и после (F) Обесцвечивание никотина приложение на каждом синаптической бутона.
- Рассчитать общую сумму высвобождаемым FM1-43 флуоресценции вдоль аксонов vHipp путем количественного различия интенсивности флуоресценции FM1-43 до и после нанесения никотина (; F = F -F окрашивание Обесцвечивание). Анализ фракции снижению интенсивности флуоресценции после никотина со следующим уравнением: F = уменьшение%; F / F окрашивание.
4. Кальций изображений
- Промыть культур (5 - 7 дней в пробирке) быстро с нормальной HBS, а затем загрузить культур с 5 мкМ Fluo-4 Ca 2+ индикатора (АМ эфира) и 0,02% Pluronic F-127 в HBS (2 мл) в течение 30 мин при 37 ° С и 5% СО 2.
- Промойте Fluo-4 решение с HBS (3 раза / 5 мин). Вернуться культур в инкубатор (37 ° С / 5% СО 2) в течение не менее 30 мин.
- Поддержание культуры в той же камере изображений и тех же условиях, как описано в разделе FM1-43 основе везикулярного синтеза (см шаг 3.1).
- Сбор Fluo-4 флуоресцентные изображения аксонов проекции из vHipp микро-кусочков с целью план-Apochromat (60X воды с 1,4 NA, возбуждения 488 нм, эмиссии 530 нм) и ПЗС-камеры.
- Сбор исходных Fluo-4 флуоресценции изображений (каждые 10 с в течение 2 мин), как предварительно никотина контроля, применяются никотин (1 мкМ) по быстрой перфузии (2 мл / мин) в течение 1 мин, а затем промыть никотин с HBS коктейль. Держите покадровой захвата изображений до, во время и после нанесения никотина каждые 10 сек в течение 30 мин.
- Сохранить все кадры из сырья Fluo-4 флуоресценции изображений, экспорта в серииИзображения TIFF формат для дальнейшего анализа.
- Соберите интегральной интенсивности Fluo-4 флуоресценции вдоль аксонов vHipp до и после нанесения никотина.
- Нормализация интегрированную интенсивность флуоресценции с помощью следующего уравнения:; F / F 0 = (FF 0) / F 0, где F 0 является фоном коррекцией предварительно никотина интенсивности флуоресценции и интегрированным Р интегральная интенсивность флуоресценции вдоль vHipp аксонов в каждый момент времени после нанесения никотина. Анализ и построить нормированную интегральную интенсивность флуоресценции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Подготовка занятых состоит из генов химерного сопутствующих культур vHipp-ССАС схем в пробирке. Прогнозы, исходящие от vHipp microslices, как предварительно синаптической аксонов ввода, можно сделать синаптические контакты с пост-синаптических мишеней, рассеянных нейронов ССАС. Никотин индуцированных устойчивый (≥ 30 мин) содействие глутаматергической передачи от ССАС нейронов, иннервируемых vHipp аксоны 21 и длительное кальций сигнализации вдоль аксонов vHipp 5 с помощью пресинаптических α7 * nAChRs.
На рисунке 1 показано, что непосредственно выступы из vHipp микро-ломтики глутаматергическая (vGluT1 положительный) и что контакты выполнены с дисперсными ГАМКергических нейронов среднего колючих из NACC (GAD положительным, рис 1C, D). Оба α7 * и не α7 * nAChRs (в том числе и α4 α5 субъединиц) были найдены вдоль аксонов vHipp (рис 1E-G) и конкретно на сайтахгде vHipp прогнозы связаться ССАС нейронов. Следует отметить, что дисперсные нейроны из NACC не экспрессируют α7 * nAChRs (рис 1H); т.е. кластеры рецепторов в контактах строго пресинаптический (рис 1I), а также рисунок 1 в номер 5.
После того, как химерные сокультурах были созданы, живая визуализации [Са 2+] я и слияние синаптических пузырьков вдоль аксонов vHipp с и / или без никотина могут быть записаны до 30 мин без каких-либо видимых повреждений нейронов.
Типичные изображения, покадровой фильмы и количественными для никотина-индуцированной Fluo-4 [Са 2+] я сигнализации вдоль аксонов vHipp показаны на рисунке 2 и Дополнительного Movie 1 и 2. Мы обнаружили, что активация vHipp nAChRs никотином индуцирует устойчивый Ca 2+ приток в пресинаптических аксонов (2А, Б). Устойчивый этапникотина индуцированных увеличивается в [Са 2+] я сигнализации вдоль аксонов vHipp был заблокирован конкретной α7 * нАХР антагонист αBgTx но не не-α7 * нАХР антагонист DHβE (рис 2А-C).
Прямая визуализация эндоцитоза FM1-43 красителя деятельности зависит от и экзоцитоза был использован для мониторинга косвенно пресинаптического высвобождения нейромедиатора 23, 24. Здесь, представитель изображения и количественное для никотина-индуцированной везикулярного слияния вдоль аксонов vHipp визуализированных по FM1-43 показано на рисунке 3 (3А, С). Наличие пресинаптических α7 * nAChRs требуется для максимального никотина индуцированного слияния пузырьков и высвобождение нейротрансмиттеров (фиг.3В, С).
Рисунок 1. Synaptic совместное культивирование vHipp с ССАС позволяет examinatioп пресинаптической локализации nAChRs. (AC) Схема мультфильм схем генотипа конкретного в пробирке (C), полученных путем раздельного посева брюшной гиппокамп / подлежащая ткань (A). ломтики из отдельных WT или α7 - / - мыши и рассеянных нейронов прилежащего ядра WT (Б). Ак, водопровод (Сильвий); Д.Г., зубчатая извилина; М.М., медиальная маммилярных ядро; PMCo, заднемедиальной корковых миндалевидные ядра; ВЧ, обонятельный трещина, FMI, щипцы минор мозолистого тела; Л.В., боковой желудочек; Ту, обонятельный бугорок; VP , вентральной спирохета. (D) vHipp microslices расширить vGluT1 положительные (красный) аксональные прогнозы, которые контактируют GAD65 положительный (зеленый) NACC нейроны (белые стрелки примеры этих контактных участков). Масштабная линейка: 10 мкм (Е.-G) Характерные микрофотографии WT vHipp аксонов (окрашивание vGluT1, зеленый) показаны для α4 * нАХР (Е), α5 * нАХР (F) и поверхность α7 * нАХР (G) окрашивание в красной кластеров (белые стрелки). Масштабная линейка:.. 5 мкм (Н) Там нет поверхности α7 * Nachr кластеров на рассредоточенных нейронов ГАМК (GAD65 положительный) из только ССАС (I), Красные "кластеров" поверхности α7 * Nachr (белые стрелки) можно увидеть в тех дисперсные нейроны совместно культивировали с vHipp microslices. Масштабная линейка:. 5 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Synaptic совместное культивирование vHipp с ССАС позволяет исследовать никотина индуцированных сигнала кальциянаправленных вдоль vHipp аксонов. () Типичные флуоресцентные-4 изображения кальция связаны Fluo-4 в псевдо цветовой гамме вдоль аксона WT vHipp раньше (Top), 1 '(в центре) и 30' (внизу) после нанесения никотина. Устойчивый фаза (30 ') никотина индуцированной Ca 2+ ответ устраняется путем добавления α7 * нАХР селективный антагонист αBgTx (100 нМ) (Б), но не при добавлении в не-α7 * Nachr селективного антагониста DHβE (1 мкМ) (С). Масштабная линейка: 5 мкм (D), представитель участок нормированной Fluo-4 интегральной интенсивности флуоресценции от живого WT vHipp аксона перфузии с никотином (1 мкМ) в течение 1 мин.. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Synaptic совместное культивирование vHipp с ССАС позволяет исследовать никотина индуцированной везикулярного высвобождения нейромедиаторов (с FM1-43) вдоль vHipp аксонов. () Типичные изображения WT vHipp аксонов (загруженные с FM1-43, зеленый) до (вверху) и после (внизу) применения никотиновой. (Б) Типичные изображения WT vHipp аксонов (загруженные с FM1-43, предварительно с α7 * нАХР селективный антагонист αBgTx в течение 15 мин) до (вверху) и после (внизу) применения никотиновой. Масштабная линейка:. 5 мкм (С) показывает количественную оценку изменений в аксонов FM1-43 флуоресценции (F уменьшения) следующий никотина лечения в отсутствие (WT) или в присутствии (WT + αBgTx) в α7 * нАХР антагонистом. Пожалуйста, нажмите здесь Чтобы смотреть большую версию этой фигуры.
Справочная Фильм 1: Покадровый Живая съемка базальной Fluo-4 / Ca 2+ флуоресценции вдоль vHipp аксонов.
В покадровой изображения Fluo-4 / Ca 2+ флуоресценции вдоль vHipp аксонов были приобретены с 60x объективной линзы воды каждые 10 сек в течение 30 мин с вращающимся диском конфокальной микроскопии. Приобретенные изображения были указаны на псевдо цветовой гамме и воспроизводятся как фильм на 2 кадров в сек. Этот фильм показывает базовую Fluo-4 / Ca 2+ флуоресценции деятельности по жить WT vHipp аксон перфузии с HBS коктейль.
Справочная Фильм 2: Покадровый Живая съемка никотина индуцированной устойчивый Fluo-4 / Ca 2+ флуоресценции вдоль vHipp аксонов.
В покадровой изображения Fluo-4 / Ca 2+ флуоресценции вдоль vHipp аксонов были приобретены с 60x объективной линзы воды каждые 10 сек в течение 30 мин с вращающимся диском конфокальной микроскопии. Приобретенные изображения были указаны на псевдо цветовой гамме и воспроизводятся как фильм на 2 кадров в сек. Этот фильм показывает никотин (1 мкМ, перфузии в в момент времени 43, промыть HBS коктейль в момент времени 49) индуцированное Fluo-4 / Ca 2+ флуоресценции деятельность по БТ жить vHipp аксон. Никотин приложение увеличили / Ca 2+ интенсивность флуоресценции Fluo-4 вдоль vHipp аксонов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Подготовка совместно культуры описано повторно капитулирует брюшной гиппокампа-прилежащем схем в пробирке. Это позволяет подготовка относительно проста и надежный экспертиза пространственных и временных профилей, с помощью которых активация пресинаптических nAChRs вызывают улучшенной передачи глутаматергическую 5, 21.
Совместных культурах определяется как рост различных специфических типов клеток в одной тарелке, которая может обеспечить физиологические условия в пробирке, чтобы продемонстрировать в естественных условиях подобная функция. Обычные нейрон-нейрон со-культуры были введены для нейронаук для изучения синаптических взаимодействий между различными типами клеток. Тем не менее, трудно определить до и после сайты синапсов в этих совместных культурах. Этот протокол нейрон совместно культуры microslice-диссоциируют позволяет легко признание пресинаптических аксонов и пост-синаптических целей. Использование microslices из разных областей мозга выводае трансгенных линии мыши выражая различные флуоресцентные белки, этот протокол также может быть использован для изучения аксонов-Аксон взаимодействий.
Важным шагом в этом microslice-диссоциированных нейронов протокола сокультуры обеспечивает стабильную среду для обеспечения крепления эксплантов, следствием проекций и формирование синапсов. Покрытие на microslices в минимальном объеме средств массовой информации и поддержание культуры пластины на смоченной стерильной марлевой подушечки являются двумя ключевыми шаги для присоединения microslice и формирования синапсов. Основным ограничением этого протокола сокультуры, что не все рассеянные нейроны ССАС образуют функциональные синапсы с vHipp аксонов.
Изменяя генотип до и после синаптических компонентов, этот препарат дает информативный подход для изучения пред- и пост-синаптические механизмы синаптической пластичности. Три отличительные особенности этого препарата делают его идеальным для этих исследований. Мозг гegions, которые обычно соединяются в естественных условиях с помощью волоконно путей, которые не могут быть поддержаны, или легко определены при острых кусочков, могут быть объединены в данном препарате в пробирке. До и после синаптические компоненты из разных мышей делают позволяя независимую изменение либо до или после синаптической генотипа. По покрытие до и после синаптические компоненты в разное время, можно избирательно выразить экзогенных генов либо в пре- или пост-синаптических нейронов.
Никотин индуцированной Ca 2+ (в секундах диапазоне минут) путем активации nAChRs были зарегистрированы в культивируемых нейронов, астроциты и в нескольких клеточных линий, которые выражают nAChRs 25-27. Тем не менее, большинство из этих исследований не обнаружили долгосрочные эффекты (более 10 мин) короткое время никотин воздействия в значительной степени из-за повреждения во время фото долгосрочной изображений. При использовании протокола культуры, описанной выше и быстрый спиннинг-диска коллекции конфокальной изображения,никотин индуцированных Са 2+ сигналов, слияние синаптических пузырьков и высвобождение глутамата может быть записан на срок до 1 часа без каких-либо видимых повреждений нейронов (Справочная Movie 1, 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Culture Media (50 ml) | |||
| Neurobasal | GIBCO | 10888022 | 48 ml |
| B-27 Supplements | GIBCO | 0080085-SA | 1 ml |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 10908-010 | 0.5 ml |
| GlutaMAX Supplement | GIBCO | 35050-061 | 0.5 ml |
| Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | GIBCO | 15140-122 | 20 ng/ml |
| 2. washing media (HBSS, 100 ml) | |||
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | GIBCO | 14175-095 | 99 ml |
| HEPES ( 1M) | GIBCO | 15630-130 | 1 ml |
| 3. HEPES buffered saline (HBS) pH=7.3 | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | 135 mM |
| KCl | Sigma | P9333 | 5 mM |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | 1 mM |
| CaCl2, | Sigma | C1016 | 2 mM |
| HEPES | Sigma | H3375 | 10 mM |
| Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |
| 4. HBS Cocktail for live imaging pH=7.3 | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | 135 mM |
| KCl | Sigma | P9333 | 5 mM |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | 1 mM |
| CaCl2, | Sigma | C1016 | 2 mM |
| HEPES | Sigma | H3375 | 10 mM |
| Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |
| tetrodotoxin | Tocris | 1078 | 2 µM |
| bicuculline | Tocris | 131 | 10 µM |
| D-AP-5 | Tocris | 105 | 50 µM |
| CNQX | Tocris | 1045 | 20 µM |
| LY341495 | Tocris | 1209 | 10 µM |
| 5. Calcium-free HBS pH=7.3 | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | 135 mM |
| KCl | Sigma | P9333 | 5 mM |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | 1 mM |
| HEPES | Sigma | H3375 | 10 mM |
| Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |
| 6. 56 mM Potassium ACSF pH=7.4 | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | 119 mM |
| KCl | Sigma | P9333 | 56 mM |
| MgSO4.7H | Sigma | M1880 | 1.3 mM |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | 2.5 mM |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | 1 mM |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | 26.2 mM |
| Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |
References
- Changeux, J. P., et al. Brain nicotinic receptors: structure and regulation, role in learning and reinforcement. Brain Res Brain Res Rev. 26 (2-3), 198-216 (1998).
- Levin, E. D. Nicotinic receptor subtypes and cognitive function. J Neurobiol. 53 (4), 633-640 (2002).
- Dani, J. A., Bertrand, D. Nicotinic acetylcholine receptors and nicotinic cholinergic mechanisms of the central nervous system. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 47, 699-729 (2007).
- Mineur, Y. S., Picciotto, M. R. Nicotine receptors and depression: revisiting and revising the cholinergic hypothesis. Trends Pharmacol Sci. 31 (12), 580-586 (2010).
- Zhong, C., Talmage, D. A., Role, L. W. Nicotine elicits prolonged calcium signaling along ventral hippocampal axons. PloS one. 8 (12), e82719 (2013).
- McGehee, D. S., Heath, M. J., Gelber, S., Devay, P., Role, L. W. Nicotine enhancement of fast excitatory synaptic transmission in CNS by presynaptic receptors. Science. 269 (5231), 1692-1696 (1995).
- Gray, R., Rajan, A. S., Radcliffe, K. A., Yakehiro, M., Dani, J. A. Hippocampal synaptic transmission enhanced by low concentrations of nicotine. Nature. 383 (6602), 713-716 (1996).
- Dickinson, J. A., Kew, J. N., Wonnacott, S. Presynaptic alpha 7- and beta 2-containing nicotinic acetylcholine receptors modulate excitatory amino acid release from rat prefrontal cortex nerve terminals via distinct cellular mechanisms. Mol Pharmacol. 74 (2), 348-359 (2008).
- Zappettini, S., Grilli, M., Salamone, A., Fedele, E., Marchi, M. Pre-synaptic nicotinic receptors evoke endogenous glutamate and aspartate release from hippocampal synaptosomes by way of distinct coupling mechanisms. Br J Pharmacol. 161 (5), 1161-1171 (2010).
- Zappettini, S., et al. Presynaptic nicotinic alpha7 and non-alpha7 receptors stimulate endogenous GABA release from rat hippocampal synaptosomes through two mechanisms of action. PloS one. 6 (2), e16911 (2011).
- Fabian-Fine, R., et al. Ultrastructural distribution of the alpha7 nicotinic acetylcholine receptor subunit in rat hippocampus. J Neurosci. 21 (20), 7993-8003 (2001).
- Jones, I. W., Barik, J., O'Neill, M. J., Wonnacott, S. Alpha bungarotoxin-1.4 nm gold: a novel conjugate for visualising the precise subcellular distribution of alpha 7* nicotinic acetylcholine receptors. J Neurosci Methods. 134 (1), 65-74 (2004).
- Nashmi, R., et al. Assembly of alpha4beta2 nicotinic acetylcholine receptors assessed with functional fluorescently labeled subunits: effects of localization, trafficking, and nicotine-induced upregulation in clonal mammalian cells and in cultured midbrain neurons. J Neurosci. 23 (37), 11554-11567 (2003).
- Drenan, R. M., et al. Subcellular trafficking, pentameric assembly, and subunit stoichiometry of neuronal nicotinic acetylcholine receptors containing fluorescently labeled alpha6 and beta3 subunits. Mol Pharmacol. 73 (1), 27-41 (2008).
- Wu, J., et al. Electrophysiological, pharmacological, and molecular evidence for alpha7-nicotinic acetylcholine receptors in rat midbrain dopamine neurons. J Pharmacol Exp Ther. 311 (1), 80-91 (2004).
- Parikh, V., Ji, J., Decker, M. W., Sarter, M. Prefrontal beta2 subunit-containing and alpha7 nicotinic acetylcholine receptors differentially control glutamatergic and cholinergic signaling. J Neurosci. 30 (9), 3518-3530 (2010).
- Nayak, S. V., Dougherty, J. J., McIntosh, J. M., Nichols, R. A. Ca(2+) changes induced by different presynaptic nicotinic receptors in separate populations of individual striatal nerve terminals. J Neurochem. 76 (6), 1860-1870 (2001).
- Richards, C. I., et al. Trafficking of alpha4* nicotinic receptors revealed by superecliptic phluorin: effects of a beta4 amyotrophic lateral sclerosis-associated mutation and chronic exposure to nicotine. J Biol Chem. 286 (36), 31241-31249 (2011).
- Colombo, S. F., Mazzo, F., Pistillo, F., Gotti, C. Biogenesis, trafficking and up-regulation of nicotinic ACh receptors. Biochem Pharmacol. 86 (8), 1063-1073 (2013).
- St John, P. A. Cellular trafficking of nicotinic acetylcholine receptors. Acta Pharmacol Sin. 30 (6), 656-662 (2009).
- Zhong, C., et al. Presynaptic type III neuregulin 1 is required for sustained enhancement of hippocampal transmission by nicotine and for axonal targeting of alpha7 nicotinic acetylcholine receptors. J Neurosci. 28 (37), 9111-9116 (2008).
- Jacobowitz, D. M., Abbott, L. C. Chemoarchitectonic Atlas of the Developing Mouse Brain. , CRC Press. New York. (1998).
- Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. J Neurosci. 12 (2), 363-375 (1992).
- Amaral, E., Guatimosim, S., Guatimosim, C. Using the fluorescent styryl dye FM1-43 to visualize synaptic vesicles exocytosis and endocytosis in motor nerve terminals. Methods Mol Biol. 689, 137-148 (2011).
- Garduno, J., et al. Presynaptic alpha4beta2 nicotinic acetylcholine receptors increase glutamate release and serotonin neuron excitability in the dorsal raphe nucleus. J Neurosci. 32 (43), 15148-15157 (2012).
- Guo, J. Z., Liu, Y., Sorenson, E. M., Chiappinelli, V. A. Synaptically released and exogenous ACh activates different nicotinic receptors to enhance evoked glutamatergic transmission in the lateral geniculate nucleus. J Neurophysiol. 94 (4), 2549-2560 (2005).
- Szabo, S. I., Zelles, T., Vizi, E. S., Lendvai, B. The effect of nicotine on spiking activity and Ca2+ dynamics of dendritic spines in rat CA1 pyramidal neurons. Hippocampus. 18 (4), 376-385 (2008).
