Summary

成体ラットおよびヒト脊髄の脳室周囲領域から神経幹/前駆細胞の単離

Published: May 14, 2015
doi:

Summary

The adult mammalian spinal cord contains neural stem/progenitor cells (NSPCs) that can be isolated and expanded in culture. This protocol describes the harvesting, isolation, culture, and passaging of NSPCs generated from the periventricular region of the adult spinal cord from the rat and from human organ transplant donors.

Abstract

成体ラットおよび増殖因子に富む培地中で培養したヒト脊髄神経幹/前駆細胞(NSPCs)は、自己再生、及び拡張可能な神経幹細胞の多能性の増殖を可能にします。血清条件では、これらの多能NSPCsは、ニューロン、星状細胞、およびオリゴデンドロサイトを生成し、差別化されます。採取した組織は、酵素パパイン-EDTA溶液中で解離した後、機械的に上皮成長因子(EGF)を補充した神経基礎培地中に播種された単一細胞懸濁液を、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGFを得るために、不連続密度勾配を介して分離し、分離されています)、およびヘパリン。成体ラットの脊髄NSPCsは、接着培養として成長させた自由浮動ニューロスフェアと成人の脊髄NSPCsとして培養されます。これらの条件下では、成人脊髄NSPCsは、前駆細胞のマーカーを発現し、増殖し、連続的に通過時に拡張することができます。これらの細胞は、bはできeは、様々な刺激に応答してインビトロで研究され、外因性因子は、神経幹細胞の分化を調べるために系統限定を促進するために使用することができます。多能NSPCsまたはそれらの子孫はまた、再生修復を評価するために種々の動物モデルに移植することができます。

Introduction

NSPCsは自己更新し、容易にin vitroで拡大することができる神経系統にコミット多能性細胞です。彼らは自己複製多能性幹細胞、より制限された前駆細胞のプロパティを表示するので、我々は、神経幹/前駆細胞の混合集団として、これらの細胞を指します。 NSPCsは胎児および成人の脳と脊髄の1,2の両方で発見されています。成人では、NSPCsは通常、静止状態であり、側脳室2-4を裏打ちする脳室下帯、及び脊髄5,6の中心管の周囲の脳室周囲領域を含む特定のニッチ内に存在します。

一般的に、NSPCsは、EGFおよびbFGFを添加した無血清培地中で自由に浮遊ニューロスフェアとして、または接着性単層、幹細胞/前駆細胞集団を選択マイトジェンとして培養されます。もともとレイノルズとワイス2によって開発されたニューロスフェアアッセイは、最も一般的に培養するために使用され、神経幹細胞を展開します。それらは血清を含む成長因子を含まない培地にプレーティングされている場合NSPCsは、ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイトに分化、多分化を示します。培養組織は、中心管6,7の領域を含む場合には、多能、自己複製NSPCsは、成体齧歯類脊髄から単離し、培養することができます。他の地域からの細胞を生成するのではなく、成人の脊髄から生成NSPCsを使用する際の潜在的な利点は、これらの組織特異的細胞が最も密接に損傷または疾患、次の紛失または損傷した脊髄の細胞に似ているということです。

以前の研究は、成人の脊髄から派生した神経球は、長期的に伝播またはセル8,9の十分な数を生成するために、継代することができなかったことを示しました。しかし、培養条件の変更を加えて、我々は、その自己再生を実証、成人の脊髄由来NSPCsの拡大と移植を報告しましたそして多能NSPCsは臓器移植ドナー10の成人の脊髄から単離することができます。主に、解剖時の白質の大部分を除去し、成人脊髄NSPCsの増殖のために選択され、増殖因子に富む培地中で接着性基板上にこれらの細胞を培養します。このプロトコルでは、成体ラットからと人間の臓器移植ドナーからの脊髄の収穫、脳室周囲組織の切開、および分離、文化、NSPCsの拡張について説明します。

Protocol

全ての動物手順は、カナダ、トロントは、動物ケアのカナダの評議会によって調製実験動物の管理と使用にガイドで設定したポリシーに基づいて、大学健康ネットワークの動物実験委員会によって承認されています。人間の脊髄組織の収穫のために、承認が大学健康ネットワーク研究倫理委員会からとオンタリオ州、カナダの臓器提供を監督ライフ財団のリアム·ギフトから入手しました。 <…

Representative Results

EFH培地で懸濁培養で増殖した成体ラットの脊髄の細胞は最初のプレーティングの1週間以内の小さな神経球(未分化細胞のコロニー)を形成します。初代培養では、播種した細胞のほとんどが死んでしまうと成長因子応答性幹細胞は増殖し、EFH培地中でのために選択されます。通路3により、直径100ミクロン( 図2A)について、多数の自由に浮遊神経球が存在することになります?…

Discussion

ラットの脊髄組織のケアの解剖時の椎弓切除を行いながら、脊髄を損傷しないように注意してください。これは、脊髄セグメントが完全であるときに脳室周囲の組織を分離する方が簡単です。組織セグメントは、完全に解剖バッファーに浸漬する必要があり、上に髄膜および白質はmicroscissorsと縦ストリップとして離れて切断することができます。また、微細な組織鉗子離れ白質を剥離するた…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to acknowledge support from Spinal Cord Injury Ontario, the Ontario-China Research and Innovation Fund, the Toronto General and Western Hospital Foundation, and Physicians’ Services Incorporated Foundation. The authors thank Dr. Tasneem Zahir for expert advice in human spinal cord NSPC culture, and Drs. Cindi Morshead and Iris Kulbatski for their expert advice in rat spinal cord NSPC isolation.

Materials

1X PBS Life Technologies #10010023 Dissection buffer
1X HBSS Life Technologies #14175095 Dissection buffer
D-glucose Sigma # G-6152 Prepare 30% glucose stock solution for dissection buffer and hormone mix
Penicillin-Streptomycin Life Technologies #15140-148 Dissection buffer and culture medium
Neurobasal-A  Life Technologies #10888-022 Culture medium
L-glutamine, 200mM Life Technologies #25030-081 Culture medium
B27 Life Technologies #12587010 Culture medium
DMEM Life Technologies #11885084 Hormone mix
F12 Life Technologies #21700-075 Hormone mix
NaHCO3 Sigma # S-5761 Prepare 7.5% NaHCO3 stock solution for hormone mix
HEPES Sigma #H9136 Prepare 1M HEPES stock solution for hormone mix
Insulin Sigma #I-5500 Hormone mix
Apo-transferrin Sigma #T-2252 Hormone mix
Putrescine Sigma # P7505 Hormone mix
Selenium Sigma #S-9133 Hormone mix
Progesterone Sigma #P-6149 Hormone mix
EGF, mouse Sigma #E4127 Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium
EGF, human recombinant Sigma #E9644 Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium
bFGF, human recombinant Sigma #F0291 Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium 
Heparin, 10000U Sigma #H3149 Prepare 27.3 mg/ml stocks in hormone mix and aliquot; EFH medium
Papain dissociation kit Worthington Biochemicals #LK003150 Contains EBSS, papain, DNase, ovomucoid protease inhibitor with BSA
Sodium Pentobarbital Bimeda – MTC Animal Health Inc DIN 00141704
Tissue Forceps: Addisons Fine Science Tools #11006-12  Serrated standard tip; micro-tip also available
Fine Forceps: Dumont #4 Fine Science Tools #11241-30
Microscissors Fine Science Tools #15024-10 Round-handled Vannas
Rongeurs Bausch & Lomb N1430
10mm Petri dishes  Nunc 1501
T25 Culture flasks Nunc 156367
40 μm nylon cell strainer VWR CA21008-949
6 well plates Nunc CA73520-906
Matrigel, growth factor reduced (100X) Corning 354230 Thaw according to directions and freeze aliquots; use diluted at a ratio of 40 μl Matrigel: 1 ml SFM

References

  1. Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287, 1433-1438 (2000).
  2. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
  3. Gritti, A., et al. Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. J Neurosci. 16, 1091-1100 (1996).
  4. Morshead, C. M., et al. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
  5. Weiss, S., et al. Multipotent CNS stem cells are present in the adult mammalian spinal cord and ventricular neuroaxis. J Neurosci. 16, 7599-7609 (1996).
  6. Martens, D. J., Seaberg, R. M., van der Kooy, D. In vivo infusions of exogenous growth factors into the fourth ventricle of the adult mouse brain increase the proliferation of neural progenitors around the fourth ventricle and the central canal of the spinal cord. Eur J Neurosci. 16, 1045-1057 (2002).
  7. Kulbatski, I., et al. Oligodendrocytes and radial glia derived from adult rat spinal cord progenitors: morphological and immunocytochemical characterization. J Histochem Cytochem. 55, 209-222 (2007).
  8. Akesson, E., et al. Long-term culture and neuronal survival after intraspinal transplantation of human spinal cord-derived neurospheres. Physiol Behav. 92, 60-66 (2007).
  9. Dromard, C., et al. Adult human spinal cord harbors neural precursor cells that generate neurons and glial cells in vitro. J Neurosci Res. 86, 1916-1926 (2008).
  10. Mothe, A. J., Zahir, T., Santaguida, C., Cook, D., Tator, C. H. Neural stem/progenitor cells from the adult human spinal cord are multipotent and self-renewing and differentiate after transplantation. PLoS One. 6, e27079 (2011).
  11. Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. J Neurosci. 6, 3044-3060 (1986).
  12. Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. , (2010).
  13. Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres–re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
  14. Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nat Methods. 3, 801-806 (2006).
  15. Louis, S. A., Azari, H., Sharififar, S., Vedam-Mai, V., Reynolds, B. A. Neural-colony forming cell assay: an assay to discriminate bona fide neural stem cells from neural progenitor cells. J Vis Exp. , (2011).
  16. Louis, S. A., et al. Enumeration of neural stem and progenitor cells in the neural colony-forming cell assay. Stem Cells. 26, 988-996 (2008).
  17. Conti, L., et al. Niche-independent symmetrical self-renewal of a mammalian tissue stem cell. PLoS Biol. 3, e10 (2005).
  18. Pollard, S. M., Conti, L., Sun, Y., Goffredo, D., Smith, A. Adherent neural stem (NS) cells from fetal and adult forebrain. Cereb Cortex. 16, i112-i120 (2006).

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Cite This Article
Mothe, A., Tator, C. H. Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord. J. Vis. Exp. (99), e52732, doi:10.3791/52732 (2015).

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