Abstract
Rata adulta y células humanas de la médula espinal neurales madre / progenitoras (NSPCs) cultivadas en medio enriquecido factor de crecimiento permite la proliferación de, y células madre neurales expandibles auto-renovación multipotentes. En condiciones de suero, estas NSPCs multipotentes se diferenciarán, generar neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. El tejido recogido se disocia enzimáticamente en una solución de papaína-EDTA y luego disociado mecánicamente y se separa a través de un gradiente de densidad discontinuo para producir una única suspensión celular que se sembró en medio neurobasal suplementado con factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF ), y heparina. Rata adulta NSPCs médula espinal se cultivan como neuroesferas que flotan libremente y adultos NSPCs médula espinal humanos se cultivan como cultivos adherentes. En estas condiciones, NSPCs de la médula espinal del adulto proliferan, marcadores expresas de células precursoras, y se pueden ampliar de forma continua durante el paso. Estas células pueden abe estudió in vitro en respuesta a diversos estímulos, y los factores exógenos puede ser utilizado para promover restricción linaje neural para examinar la diferenciación de células madre. Multipotentes NSPCs o su progenie también pueden ser trasplantadas en diversos modelos animales para evaluar la reparación regenerativa.
Introduction
NSPCs son células multipotentes comprometidas con el linaje neuronal que puede auto renovar y ampliar fácilmente in vitro. Nos referimos a estas células como una población mixta de células madre / progenitoras neurales ya que presentan propiedades de las células madre multipotentes auto-renovación y progenitores más restringidas. NSPCs se encuentran tanto en el cerebro fetal y adulto y la médula espinal 1,2. En el adulto, NSPCs son normalmente quiescente y residen en nichos específicos, incluyendo la zona subventricular recubre los ventrículos laterales 2-4, y la región periventricular que rodea el canal central de la médula espinal 5,6.
Típicamente, NSPCs se cultivan como neuroesferas flotantes o monocapas como adherentes en medio libre de suero suplementado con EGF y bFGF, mitógenos que seleccionan para las poblaciones de células madre / progenitoras. El ensayo neuroesfera desarrollado originalmente por Reynolds y Weiss 2, se usa más comúnmente para la cultura y laexpandir las células madre neurales. NSPCs muestran multipotencia cuando se sembraron en medio que contiene suero factor libre crecimiento, diferenciarse en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. Multipotentes, NSPCs auto-renovación pueden ser aisladas y cultivadas a partir de la roedor adulto de la médula espinal cuando el tejido cultivado incluye regiones del canal central 6,7. Una ventaja potencial en el uso de NSPCs generados a partir de la médula espinal adulta en oposición a la generación de células de otras regiones es que estas células específicas de tejido se asemejan más estrechamente células en la médula espinal que se pierde o se daña después de una lesión o enfermedad.
Trabajo previo mostró que neuroesferas derivadas de la médula espinal adulta humana no podrían ser propagadas a largo plazo o pases para generar un número suficiente de células 8,9. Sin embargo, con modificaciones en las condiciones de cultivo, se informó de la expansión y el trasplante de médula NSPCs derivadas de la médula humanos adultos, lo que demuestra que la auto-renovacióny NSPCs multipotentes se pueden aislar de la médula espinal adulto humano de donantes de trasplante de órganos 10. En primer lugar, la eliminación de la mayor parte de la materia blanca durante la disección y el cultivo de estas células sobre un sustrato adherente en un medio enriquecido con factor de crecimiento seleccionado para la proliferación de la médula espinal NSPCs adultos humanos. En este protocolo se describe la recolección de la médula espinal de rata adulta y de donantes humanos de trasplante de órganos, la disección del tejido periventricular, y el aislamiento, cultivo y expansión de NSPCs.
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Protocol
Todos los animales procedimientos son aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad Health Network, Toronto ON Canadá, de acuerdo con las políticas establecidas en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales Experimentales preparados por el Consejo Canadiense de los Animales. Para la recolección de tejido de la médula espinal humana, la aprobación se obtuvo de la Junta Ética de la Investigación Red de Salud de la Universidad y de la Trillium-regalo de la Fundación Vida, que supervisa la donación de órganos en Ontario, Canadá.
1. Preparación de Disección Los tampones y medios de cultivo
- Para el aislamiento de médula espinal de ratas, preparar 100 ml de tampón de disección (1x PBS + 0,6% de glucosa + 2% de penicilina-estreptomicina) y refrigerar. Para la médula espinal humana preparar 100 ml de tampón de disección (1x HBSS + 0,6% de glucosa + 2% de penicilina-estreptomicina) y refrigerar.
- Preparar medio 100 ml sin suero (SFM) y caliente a 37 ° C. Para preparar el MFS, agregue 2 mM L-glutamina, 100 g / ml de penicilina-estreptomicina, 2% B27, y 10% de la mezcla hormona para Neurobasal-A medio. Para preparar la mezcla de hormonas, hacer una 1: media / F12 1 DMEM que contenía 0,6% de glucosa, 3 mM NaHCO 3, 5 mM HEPES, 25 mg / ml de insulina, 100 g / ml apo-transferrina, 10 mM de putrescina, 30 nM selenio, y 20 nM de progesterona.
- Preparar el factor enriquecido medios chapado crecimiento EFH (a SFM añadir 20 ng / ml de EGF, 20 ng / ml de bFGF, y 2 mg / ml de heparina) y caliente a 37 ° C. Asegúrese de que EFH humana contiene factores de crecimiento recombinantes humanos (véase la Tabla de Materiales).
2. Recolección y Disección de adulto Rata periventricular Tejido de la médula espinal
- Esterilizar los instrumentos de disección en etanol y enjuague con solución salina estéril, o instrumentos de autoclave con antelación. Dar de rata (6 - 8 semanas de edad) una inyección letal de pentobarbital de sodio (1 cc a 65 mg / ml) o sobredosis de anestésico (es decir, 4% isofluorano) según una de institución aprobó el protocolo animal. Douse la parte trasera de la rata con 70% de etanol y quitar la piel en la superficie dorsal con grandes tijeras de disección.
- Sosteniendo las tijeras perpendiculares a la superficie dorsal, transversalmente cortar la columna vertebral por encima de las extremidades posteriores. Con unas tijeras pequeñas para cortar longitudinalmente el músculo dorsal que recubre la columna vertebral en una dirección rostral para exponer las apófisis espinosas.
- Comenzando en el extremo caudal expuesta, inserte gubia o un instrumento pequeño hueso de corte romo extradurally en la cara lateral del canal espinal en el espacio entre la médula espinal y la columna vertebral. Hacer pequeños cortes en la lámina (arcos óseos izquierdo y derecho de las apófisis espinosas en cada lado de las vértebras) y cuidadosamente retire la lámina para exponer la médula espinal (Figura 1A-D). Asegúrese de que el ángulo de las palas es poco profunda y paralela a la cuerda de modo que la médula espinal subyacente no está dañado.
- Continuar laminectomía en dirección rostral a expose la médula espinal torácica y cervical.
- Escindir suavemente la espina dorsal de la columna vertebral con pinzas de tejido contundentes y uso microtijeras para cortar cuidadosamente las raíces para liberar el cable. Coloque la médula espinal extirpado en una placa de Petri que contiene 4 ° C tampón de disección estéril rata (descrito más arriba en 1.1). Enjuague el tejido en 4 ° C tampón de disección recién preparados y con unas tijeras cortar la médula espinal transversalmente en segmentos de 1 cm (Figura 1E).
- Para cada segmento de tejido, utilice una mano para sujetar el tejido con unas pinzas finas. Con la otra mano, use microtijeras para eliminar cuidadosamente las meninges que recubren, la materia blanca, y la mayor parte de la materia gris, con la ayuda de un microscopio de disección. Alternativamente, utilizar unas pinzas finas (Dumont # 4) a despegarse la mayor parte de la materia gris y blanca, dejando sólo la región periventricular de la médula espinal que incluye el epéndimo y una pequeña cantidad de materia gris circundante (Figura 1F-H).
- En común el tejido periventricular diseccionado en una placa de Petri de 10 cm estéril que contiene tampón de disección rata frío.
3. Recolección y Disección de adulto periventricular humano Tejido de la médula espinal
Nota: el tejido de la médula espinal humana se cosecha de donantes de trasplante de órganos adultos (donantes con edades de 2 a 60 años de edad) después de que los otros órganos se han eliminado para el trasplante de órganos. El Trillium-Regalo del Programa Vida obtiene el consentimiento para la extracción de tejido con fines de investigación de la familia del paciente y notifica a nuestro equipo de recolección en el momento oportuno de tal manera que hemos sido capaces de cosechar las cuerdas dentro de 2 horas de pinzamiento aórtico. Se aceptan donantes adultos masculinos y femeninos con serología negativa y no hay infecciones.
- Tejido de cosecha de una manera estéril en el quirófano a través de un abordaje anterior usando la misma exposición anterior ya diseccionado para la extracción de órganos por el órgano Transpequipo de recolección lant.
- Exponer la columna vertebral anterior a través de la retracción con grandes esparcidores de costillas y grandes retractores de pádel de los tejidos y órganos que quedan incluidos los grandes vasos sanguíneos.
- Use una sierra esternal montado con una larga hoja para cortar a través de los discos intervertebrales en los extremos rostral y caudal de la longitud deseada de la columna vertebral a ser resecado. Ángulo de la sierra cerca de 45 ° en sentido medial para cortar un canal triangular de la parte lateral de los cuerpos vertebrales de detención justo en el canal espinal.
- Eliminar en bloque los aspectos mediales de los cuerpos vertebrales de los segmentos deseados con la ayuda de osteotomos curvos y mazo teniendo cuidado de evitar el corte a través de la duramadre. A continuación, levante suavemente la dura cubierta de la médula espinal con pinzas dentadas y agudamente incidir los extremos rostral y caudal de la médula. Use las tijeras largas y fórceps para seccionar bilateralmente las raíces individuales.
- Coloque el segmento escindido de la médula espinal en 4 °; C tampón estéril (1x HBSS + 0,6% de glucosa + 2% de penicilina-estreptomicina) en un tubo de ensayo grande para el transporte a la sala de cultivo de tejidos.
- Nota: Por lo general, un 3 - segmento de 6 cm de la médula espinal de la columna torácica superior y / o media-baja nivel torácico se retira de la sala de operaciones bajo condiciones estériles, tan pronto como sea posible después de la interrupción de la circulación y se colocaron en tampón estéril fría . El tiempo transcurrido entre el cese de la circulación y la eliminación de la médula espinal varía con el tiempo requerido para cosechar los órganos específicos para la donación y ha oscilado entre 45 min a 2 horas. Si también se han eliminado el corazón y los pulmones, la disección puede ser tomado lejos rostral para cosechar una porción de la médula cervical inferior, así.
- Diseccionar el tejido de la médula espinal humana tan pronto como sea posible después de la cosecha, generalmente dentro de 3 hrs. Retire la duramadre y otros meninges con fórceps. Enjuague el tejido de la médula espinal en recién hecho 4 ° C y tampón de diseccióncortar transversalmente en segmentos de 1 cm.
- Con la ayuda de un microscopio de disección, extirpar las meninges que recubren, la materia blanca, y la mayoría de la materia gris utilizando pinzas de tejido, unas pinzas finas y microtijeras para cada segmento de tejido. En común el tejido diseccionado periventricular, que incluye el epéndimo y una pequeña cantidad de materia gris circundante, en una placa de Petri de 10 cm estéril que contiene tampón de disección humana frío.
4. Aislamiento y cultivo de adulto Rata y NSPCs Médula Espinal Humanos
- Realice los siguientes pasos asépticamente en una campana de flujo laminar.
- Picar la rata disecada o tejido periventricular humano en 1 mm 3 piezas con micro tijeras.
- Enzimáticamente disociar el tejido picado con enzimas proteolíticas utilizando el kit de la disociación de papaína como se indica en la tabla de materiales / reactivos. Nota: Los componentes reactivos incluyen 4 viales; Vial 1: solución salina equilibrada de Earle (EBSS), Vial 2: containin papaínag L-cisteína y EDTA, Vial 3: Deoxyribonuclease I (DNasa), Vial 4: inhibidor de la proteasa ovomucoide con albúmina de suero bovino (BSA).
Nota: Nota: La papaína es una proteasa sulfhidrilo que tiene amplia especificidad de sustratos proteicos. La papaína en el presente documento se deriva a partir del látex de la planta de Carica papaya y degrada la mayoría de los sustratos de proteína más ampliamente que las proteasas pancreáticas. Durante el proceso de disociación hay algún daño celular causando ADN para ser liberado en el medio de disociación que aumentará la viscosidad y hacer pipeteando difícil. Por lo tanto, la ADNasa se incluye en el procedimiento de aislamiento de células para digerir el ADN sin dañar las células intactas. Ovomucoides se glicoproteína inhibidores de la proteasa utilizados para inhibir la actividad de papaína después de la etapa de disociación.
- En el primer uso, reconstituir la mezcla de inhibidor de ovomucoide albúmina (vial 4) con 32 ml de EBSS (vial 1), y luego almacenar a 4 ° C y el uso para aislamientos posteriores.Nota: Esto produce una solución a una concentración eficaz de 10 mg de inhibidor de ovomucoide y 10 mg de albúmina por ml.
- Añadir 5 ml de EBSS (vial 1) a un vial de papaína (vial 2), produciendo una solución en 20 unidades de papaína / ml en 1 mM de L-cisteína con EDTA 0,5 mM. Compruebe que la solución de papaína parece claro cuando está completamente disuelto, si no colocar el frasco en un 37 ° C baño de agua durante diez minutos hasta que la papaína se disuelva por completo para garantizar la plena actividad de la enzima.
- Añadir 500 l de EBSS (vial 1) a un vial de DNasa (vial 3) y mezclar suavemente como DNasa es sensible a la cizalla desnaturalización. Añadir 250 l de la solución de DNasa al vial que contiene la papaína, resultando en una concentración final de aproximadamente 20 unidades / ml de papaína y 0,005% de DNasa. Guardar el saldo de la DNasa vial para su uso posterior.
- Coloque la rata picada o tejido humano en la solución de papaína como se ha preparado en el paso 4.4 anteriormente. Para el aislamiento de tejido humano, dividir el tejido picado por igual entre dosviales de papaína (aproximadamente 0,2 g / vial).
- Incubar a 37 ° C con agitación constante en una plataforma basculante para disociar el tejido en la solución de papaína activada. Incubar el tejido de rata durante 45 min a 1 hr, y el tejido humano durante 1 a 2 horas, dependiendo de la cantidad de tejido picado, sobre desde 0,2 hasta 0,4 g respectivamente.
- Se tritura la mezcla con una pipeta de 10 ml para disociar cualquier piezas de tejido restantes para producir una suspensión de células nublado. Transferir la suspensión celular (no incluyen piezas de tejido no disociado) en un tubo cónico de 15 ml estéril y se centrifuga a 300 g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
- Resuspender las células sedimentadas en medio que contiene ovomucoide, un inhibidor de la papaína.
- Preparar la solución de ovomucoide mediante la mezcla de 2,7 ml EBSS (vial 1) con 300 l de la solución de inhibidor-albúmina ovomucoide reconstituido (vial 4) en un tubo cónico de 15 ml. Añadir 150 l de solución de DNasa (vial 3) guardados en el paso 4.4 anterior.
- Descartar el sobrenadante delas células sedimentadas y de inmediato volver a suspender el sedimento celular en la mezcla de albúmina-inhibidor de ADNasa diluida.
- Células intactas separados de las membranas celulares por centrifugación a través de un gradiente de densidad discontinuo solo paso.
- Prepare el gradiente de densidad discontinuo mediante la adición de 5 ml de solución de albúmina-inhibidor (vial 4) a un tubo de 15 ml, y usando una pipeta de 5 ml, con suavidad y la capa lentamente la suspensión de células (preparado como se describe anteriormente en la etapa 4.8) en la parte superior de la solución de albúmina-inhibidor.
- Centrifugar a 70 xg durante 6 min a TA.
- Nota: La interfaz entre las dos capas de la gradiente debe ser claramente visible, aunque mezcla mínima en este límite no afecta el resultado. Fragmentos de membrana permanecen en la interfase y células disociadas de pellets en la parte inferior del tubo.
- Para células de rata, descartar el sobrenadante y resuspender el sedimento de células en 1 ml de rata medio EFH (pre-calentado a 37 ° C).Contar densidad de células vivas con un hemocitómetro y la placa de las células en un matraz de cultivo T25 a una densidad de 10 células / l en EFH. El rendimiento típico de las células a partir de tejido de rata es de aproximadamente 2 x 10 6 células con aproximadamente el 80% viability.If cultivos clonales se desea, las células de semillas a una densidad de menos de 10 células / mL. Incubar los matraces a 37 ° C en 5% de CO 2 y permiten que los cultivos crezcan en reposo durante 1 semana para evitar la agregación de las esferas.
- Para células humanas, desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 10 ml de medio de EFH humano (pre-calentado a 37 ° C). Se filtra la suspensión celular a través de un filtro de células de 40 micras nylon siguió con 30 ml de EFH para eliminar los fragmentos de mielina y de la membrana celular. Centrifugar a 300 xg durante 5 minutos y resuspender el sedimento celular en 1 ml de medio de EFH.
- Contar densidad de células vivas con un hemocitómetro y la placa de las células humanas en placas de cultivo de 6 pocillos a una densidad de 10 5 células / pocillo en un volumen totalde 5 ml EFH / pocillo. El rendimiento típico de las células de tejido humano es de aproximadamente 1 x 10 6 células con aproximadamente el 70% de viabilidad. Pozos pre-capa con un sustrato adherente como Matrigel (ver nota abajo). Diluir en una proporción de 40 l Matrigel: 1 ml SFM.
- Nota: Como alternativa, se pueden utilizar otros sustratos adherentes tales como poli-D-lisina / laminina, fibronectina, o colágeno.
- Incubar las placas a 37 ° C en 5% de CO 2 y permitir que los cultivos crezcan en reposo durante 1 semana.
5. pases de rata adulta y NSPCs médula espinal humanos
- NSPCs Rat formarán pequeños neuroesferas aproximadamente 70 micras de diámetro dentro de 1 semana de siembra inicial; NSPCs rata pasaje semanales mediante la recopilación de la suspensión celular, centrifugación a 300 xg durante 5 min, y triturando mecánicamente el sedimento de células para disociar las neuroesferas.
- Semilla las células disociadas en matraces T25 que contienen rata fresca medio EFH. Alternativamente,utilizar 50% de medio acondicionado de rata para los pases. El rendimiento típico de NSPCs rata en pases es de unos 5 x 10 6 células que aumenta exponencialmente con el número de pases.
- Para los cultivos humanos, una semana después del recubrimiento inicial, reemplace la mitad del medio de cultivo fresco con EFH dos veces por semana para permitir que las células se adhieran al sustrato. Generalmente, 1 - 2 semanas más tarde una vez que las células se han unido al sustrato, reemplazar todo el volumen de medio de cultivo dos veces a la semana con EFH fresco.
- Células subcultura antes de llegar a la confluencia entre 4-8 semanas.
- Células de subcultivo separando las células del sustrato enzimáticamente (véase la Tabla de Materiales) con 2 ml de enzima por pocillo se incubó durante aproximadamente 10 min a 37 ° C. Recoger suspensión de células, centrifugar a 300 xg durante 5 min, y resuspender suavemente el sedimento celular en 1 ml de medio de EFH recién hecho.
- Contar las células vivas con un hemocitómetro y placa las células en placas de cultivo de 6 pocillos (pre-coado como anteriormente en la etapa 4.12) a una densidad de 10 5 células / pocillo en un volumen total de 5 ml de HEP / pocillo. El rendimiento típico de NSPCs humanos en pases es de aproximadamente 2 x 10 6 células y en general este será el doble con el pasaje. En general, mantener los cultivos con 50% de medio acondicionado EFH 2 - 3 veces por semana entre pases.
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Representative Results
Las células de la médula espinal de ratas adultas cultivadas en cultivo en suspensión en un medio EFH formarán pequeños neuroesferas (colonias de células indiferenciadas) dentro de 1 semana de chapado inicial. En cultivos primarios, la mayoría de las células sembradas morirán y las células madre de factor de respuesta de crecimiento se proliferan y se seleccionan en el medio EFH. Por el paso 3, habrá numerosos neuroesferas que flotan libremente alrededor de 100 micras de diámetro (Figura 2A). Neuroesferas son redondos y de fase brillante, y bajo alta ampliación, microspikes-cilios como se ven sobresaliendo de las células en el exterior de las esferas que son característicos de neuroesferas a diferencia de grupos de restos de células (Figura 2B). El rendimiento típico de las células a partir de tejido de rata es de aproximadamente 2 x 10 6 células con aproximadamente el 80% de viabilidad. Las neuroesferas no deben ser sembradas a una densidad demasiado alta para evitar la agregación de grupos de células. Además, grandes neuroesferas se vuelven difíciles de disociar y las células se convertiránnecrótico en el centro de la esfera. Esto también ocurrirá si los cultivos se dejan demasiado tiempo antes de pases. En la cultura EFH, de rata adulta NSPCs médula espinal proliferan (Figura 2C) y expresan nestina (Figura 2D) un marcador para las células precursoras, y bajos niveles de marcadores neuronales maduros (datos no mostrados).
Culturas CPSN Adulto médula espinal humana no crecen tan rápido como culturas CPSN rata. Si las células de la médula espinal humanos se cultivaron inicialmente en suspensión, formarán agregados y grupos irregulares de pequeños números de células combinados con los desechos (Figura 3A). Pases posteriores de estas culturas no promueve el enriquecimiento de la población CPSN. Sin embargo, cuando las células humanas se sembraron en EFH en una monocapa adherente, las NSPCs-factor de respuesta de crecimiento se adhieren al sustrato (Figura 3B) y la sustitución de medios posterior elimina la mielina y restos de células (Figura 3C). El rendimiento típico de canas de tejido humano es de aproximadamente 1 x 10 6 células con aproximadamente el 70% de viabilidad. Cuando los cultivos CPSN humanos establecido bien como una monocapa adherente, las NSPCs pueden entonces también se sembraron en cultivos en suspensión para formar neuroesferas que flotan libremente. En la cultura EFH, NSPCs médula espinal humanas adultas proliferan (figura 3D) y expresan nestina (Figura 3E) y Sox2 (Figura 3F), un factor de transcripción demostrado ser expresado por las células madre neurales, y niveles muy bajos de marcadores neuronales maduras (de datos no mostrada).
Figura 1. laminectomía de médula espinal de ratas y la disección de la región periventricular. (A) en el extremo caudal expuesta de la médula espinal, rongeurs se insertan extradurally en el aspecto lateral del canal espinal. (B) pequeños cortes se hacen en la lámina en cada SIde de las vértebras y la lámina es cuidadosamente pelado para exponer la médula espinal. (C) La médula espinal cervical expuesta después de la laminectomía. (D) Esquema de sección transversal vertebral que muestra la médula espinal torácica y la ubicación de cortes realizados para laminectomía (representado con líneas de puntos rojos). Se quitan las láminas y apófisis espinosa (región sombreada). (E) La médula espinal se corta transversalmente en segmentos de 1 cm. (F) Las meninges que recubren, la materia blanca, y la mayoría de la materia gris se retira cuidadosamente usando microtijeras. (G ) tejido periventricular picada. (H) Transversal sección de médula espinal de rata teñido con luxol rápido hematoxilina y eosina azul y con el contorno de puntos que muestra la región periventricular diseccionado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. rata adulto NSPCs médula espinal. (A) por el paso 3, numerosos neuroesferas se ven cuando la rata NSPCs médula espinal se cultivan en cultivo en suspensión libre flotación. (B) neuroesferas son fases luminosas y microspikes que sobresalen de las neuroesferas (flechas ) son evidentes en la alta ampliación. (C) disociada neuroesferas (paso 3, día 4) se colocan en pocillos recubiertos con Matrigel en un medio de EFH, fijos, y immunostained y counterstained con Hoechst para visualizar los núcleos (azul). En condiciones de EFH, rata adulta NSPCs médula espinal proliferan (como se muestra con Ki67 inmunoticción), y (D) nestina principalmente expresa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 3. Adultos humanos NSPCs médula espinal. (A) Cuando inicialmente chapada en frascos de cultivo, adultos NSPCs médula espinal humanos no crecen bien. Los cultivos primarios que flotan libremente en medio EFH (13 días después de la siembra) muestran agregados de células y escombros. (B) En cambio, en cultivos adherentes primarias en EFH, NSPCs han unido al sustrato Matrigel (flechas), que se muestra a los 17 días después chapado, y (C) a los 41 días in vitro. (D) en medio EFH, adultos NSPCs de la médula espinal humanos proliferan, como se muestra con Ki67 inmunotinción (26 días in vitro mostrados), y principalmente expreso (E) nestina (26 días en vitro presentados) y (F) Sox2 (66 días in vitro presentados). Los núcleos se counterstained con Hoechst (azul)./ftp_upload/52732/52732fig3large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Durante la disección de la médula espinal de ratas cuidado el tejido se debe tomar para no dañar la médula espinal en el desempeño de la laminectomía. Es más fácil de aislar el tejido periventricular cuando los segmentos de la médula espinal están intactos. Los segmentos de tejido deben sumergirse plenamente en el tampón de disección y las meninges que recubren y la materia blanca se pueden cortar a medida que tiras longitudinales con micro tijeras. Alternativamente, fórceps de tejidos finos se pueden utilizar para pelar la materia blanca de distancia.
Para el procedimiento de aislamiento para NSPCs, se utilizó un método de disociación de papaína-EDTA combinado con trituración mecánica para disociar la rata y el tejido de la médula espinal humana. En comparación con otras proteasas, la papaína es menos perjudicial, pero eficaz, como se muestra anteriormente con la disociación de rata postnatal neuronas corticales 11. Encontramos que la disociación con solamente trituración mecánica, a menudo utilizado con el tejido fetal, no es tan eficaz con el tejido del adulto. Después ªe disociación enzimática, trituración mecánica es importante para romper los fragmentos de tejido restantes. La trituración con dispersión celular repetitivo con una pipeta se debe realizar lo que no hay fragmentos de tejido intactas restantes resultantes en una suspensión de células nublado. Sin embargo, la trituración no se debe realizar con demasiada fuerza para evitar el burbujeo de la suspensión celular y la muerte celular resultante.
Para los pases, neuroesferas de rata se disocian en una sola suspensión celular a través de la trituración mecánica, tal como se describió originalmente 2. Sin embargo, neuroesferas también pueden disociarse usando métodos enzimáticos tales como la tripsina-EDTA que no dañará los receptores de la superficie celular o interferir con la formación de esfera mientras dure la exposición enzimática es breve 12.
Hay una serie de ventajas en el uso del ensayo de neurosphere a la cultura NSPCs. Es relativamente simple, reproducible, y permite la rápida expansión de cel madre neuralesls 2,12. Sin embargo, neuroesferas son heterogéneos compuesto principalmente de células progenitoras que son más restringido y sólo un pequeño número de células madre. Varios factores tales como la densidad celular y la técnica de pases pueden afectar el fenotipo de las culturas, y neuroesferas pueden formar también a partir de células progenitoras 13. Neuroesferas son muy móviles y pueden fusionar incluso en condiciones de baja densidad celular 14. Por lo tanto, el número de neuroesferas en la cultura no representa el número de células madre. Para discriminar las células madre neurales a partir de células progenitoras, se debe utilizar el ensayo de formación de células 15,16 neuronal-colonia.
Rata adulta NSPCs médula espinal crezcan así como neuroesferas en cultivo en suspensión en EFH complementados medio y son fácilmente ampliable. En contraste, hemos encontrado que NSPCs de la médula espinal humanos adultos crecen mejor como una monocapa adherente 10. Las células madre neurales derivados de cerebro humano puede sostenerse a largo plazo en el culto monocapaure en un medio químicamente definido en presencia de mitógenos que promueven su capacidad proliferativa 17,18. Como se describe en este protocolo, NSPCs se pueden aislar de la médula espinal adulta humana de donantes de trasplantes de órganos y se pasaron y se expandieron como una monocapa adherente en presencia de EGF, bFGF y heparina 10. Es más fácil de aislar NSPCs de menores de donantes mayores que las células se expanden más rápido, aunque NSPCs aún podrían ser aislados de los donantes hasta nuestra edad máxima de 60 años 10. Hemos examinado una variedad de sustratos adherentes tales como Matrigel, fibronectina, colágeno tipo I, y poli-D-lisina / laminina, y encontrado los para ser eficaz para la adhesión de médula espinal adulta humana NSPCs 10. Inicialmente tanto neuroesfera y cultivos adherentes contienen agregados celulares, escombros, y las células muertas. Sin embargo estos desechos se elimina progresivamente con el subcultivo y el crecimiento medio neurobasal factor enriquecido selecciona para los NSPCs proliferantes. También los desechos y la contaminación de la mielina se pueden reducir con una cuidadosa disección y la eliminación de la materia blanca a partir de los segmentos de tejido de la médula espinal. Filtrado de la suspensión de células resultante a través de un colador antes de chapado también elimina la mielina.
Tenemos adultos NSPCs médula espinal humanas cultivadas como monocapas adherentes durante al menos 9 meses que involucran aproximadamente 10 pasajes, aunque en las culturas de más edad existe un mayor riesgo de anomalías del cariotipo. Se realizó el análisis de cariotipo en NSPCs humanas cultivadas durante 4 meses y encontramos un cariotipo diploide normal sin anomalías cromosómicas (datos no mostrados). También se encontró que la proliferación celular y la capacidad de diferenciarse en oligodendrocitos disminuyó con el aumento del tiempo en cultivo. Por ejemplo, el porcentaje relativo de células O4 positivas se redujo de 1,3% a 1 mes en cultivo para 0,01% a los 4 meses en cultivo 10. Tanto rata y NSPCs humanos son susceptibles de criopreservación utilizando congelación estándar se reuniócapachos y no muestran diferencias significativas en el perfil fenotípico.
El aislamiento y la expansión de NSPCs multipotentes en la cultura permite varias aplicaciones in vitro, incluido el examen de varios factores sobre adultos neuronal diferenciación de células madre. Aumento del número de NSPCs pueden ser generados in vitro y trasplantadas en modelos animales tales como lesión de la médula espinal, apoplejía, y enfermedad neurodegenerativa para examinar la respuesta reparativa de estas células madre neurales in vivo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | Life Technologies | #10010023 | Dissection buffer |
| 1x HBSS | Life Technologies | #14175095 | Dissection buffer |
| D-glucose | Sigma | # G-6152 | Prepare 30% glucose stock solution for dissection buffer and hormone mix |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | #15140-148 | Dissection buffer and culture medium |
| Neurobasal-A | Life Technologies | #10888-022 | Culture medium |
| L-glutamine, 200 mM | Life Technologies | #25030-081 | Culture medium |
| B27 | Life Technologies | #12587010 | Culture medium |
| DMEM | Life Technologies | #11885084 | Hormone mix |
| F12 | Life Technologies | #21700-075 | Hormone mix |
| NaHCO3 | Sigma | # S-5761 | Prepare 7.5% NaHCO3 stock solution for hormone mix |
| HEPES | Sigma | #H9136 | Prepare 1M HEPES stock solution for hormone mix |
| Insulin | Sigma | #I-5500 | Hormone mix |
| Apo-transferrin | Sigma | #T-2252 | Hormone mix |
| Putrescine | Sigma | # P7505 | Hormone mix |
| Selenium | Sigma | #S-9133 | Hormone mix |
| Progesterone | Sigma | #P-6149 | Hormone mix |
| EGF, mouse | Sigma | #E4127 | Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium |
| EGF, human recombinant | Sigma | #E9644 | Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium |
| bFGF, human recombinant | Sigma | #F0291 | Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium |
| Heparin, 10,000 U | Sigma | #H3149 | Prepare 27.3 mg/ml stocks in hormone mix and aliquot; EFH medium |
| Papain dissociation kit | Worthington Biochemicals | #LK003150 | Contains EBSS, papain, DNase, ovomucoid protease inhibitor with BSA |
| Sodium Pentobarbital | Bimeda – MTC Animal Health Inc | DIN 00141704 | |
| Tissue Forceps: Addisons | Fine Science Tools | #11006-12 | Serrated standard tip; micro-tip also available |
| Fine Forceps: Dumont #4 | Fine Science Tools | #11241-30 | |
| Microscissors | Fine Science Tools | #15024-10 | Round-handled Vannas |
| Rongeurs | Bausch & Lomb | N1430 | |
| 10 mm Petri dishes | Nunc | 1501 | |
| T25 Culture flasks | Nunc | 156367 | |
| 40 μm nylon cell strainer | VWR | CA21008-949 | |
| 6 well plates | Nunc | CA73520-906 | |
| Matrigel, growth factor reduced (100x) | Corning | 354230 | Thaw according to directions and freeze aliquots; use diluted at a ratio of 40 μl Matrigel: 1 ml SFM |
References
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- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
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- Weiss, S., et al. Multipotent CNS stem cells are present in the adult mammalian spinal cord and ventricular neuroaxis. J Neurosci. 16, 7599-7609 (1996).
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