Abstract
الفئران البالغين والحبل الشوكي الخلايا العصبية الجذعية البشرية / السلف (NSPCs) مثقف في النمو التخصيب عامل المتوسطة يسمح لانتشار متعدد القدرات، تجديد الذات، والخلايا الجذعية العصبية قابلة للتوسيع. في ظروف المصل، وهذه NSPCs متعدد القدرات تفرق، وتوليد الخلايا العصبية، الخلايا النجمية، و oligodendrocytes. وفصل الأنسجة التي تحصد إنزيمي في محلول غراء-EDTA ثم فصلها ميكانيكيا وفصل من خلال التدرج الكثافة متقطع لتسفر عن تعليق خلية واحدة وهي مطلية في المتوسط neurobasal تستكمل مع عامل نمو البشرة (EGF)، عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF )، والهيبارين. الفئران الكبار NSPCs الحبل الشوكي هي مثقف كما neurospheres التعويم الحر والكبار NSPCs الحبل الشوكي وكما نمت الثقافات ملتصقة. في ظل هذه الظروف، NSPCs الحبل الشوكي الكبار تتكاثر، علامات صريحة من خلايا السلائف، ويمكن توسيعها باستمرار على المرور. هذه الخلايا يمكن به درس في المختبر استجابة لمؤثرات المختلفة، ويمكن أن تستخدم العوامل الخارجية لتعزيز تقييد النسب لدراسة العصبية تمايز الخلايا الجذعية. متعددة القدرات NSPCs وذريتهم كما يمكن زرعها في مختلف النماذج الحيوانية لتقييم إصلاح التجديدي.
Introduction
NSPCs هي خلايا متعددة القدرات ملتزمة النسب العصبية التي يمكن أن النفس تجديد وتوسيع بسهولة في المختبر. نشير إلى هذه الخلايا كما يسكنها خليط من الخلايا الجذعية / السلف العصبية لأنها عرض خصائص الخلايا الجذعية متعددة القدرات تجديد الذات والأسلاف أكثر تقييدا. تم العثور على NSPCs في كل من دماغ الجنين والكبار والحبل الشوكي 1،2. في البالغين، NSPCs عادة ما تكون هادئة ويقيمون في قطاعات محددة بما في ذلك منطقة subventricular بطانة البطينات الجانبية 2-4، والمنطقة المحيطة بالبطين المحيطة القناة الوسطى من 5،6 الحبل الشوكي.
عادة، NSPCs يتم تربيتها كما neurospheres التعويم الحر أو الطبقات الوحيدة ملتصقة كما هو الحال في المصل خالية المتوسطة تستكمل مع EGF bFGF و، mitogens الذي حدد للسكان الخلايا الجذعية / السلف. مقايسة neurosphere ضعت أصلا من قبل رينولدز وفايس 2، هو الأكثر شيوعا في الثقافة وتوسيع الخلايا الجذعية العصبية. عرض NSPCs multipotency عندما ومطلي انهم في النمو خالية من عامل مصل، التفريق إلى الخلايا العصبية، الخلايا النجمية، و oligodendrocytes. متعددة القدرات، NSPCs تجديد الذات يمكن أن تكون معزولة ومثقف من القوارض الكبار الحبل الشوكي عندما يتضمن الأنسجة مثقف مناطق القناة المركزية 6،7. وهناك ميزة محتملة في استخدام NSPCs المتولدة من الحبل الشوكي الكبار بدلا من توليد خلايا من مناطق أخرى هي أن هذه الخلايا الأنسجة محددة تشبه بشكل وثيق خلايا في النخاع الشوكي التي فقدت أو تضررت بسبب الإصابة أو المرض.
وأظهرت الأعمال السابقة التي neurospheres المستمدة من الكبار الحبل الشوكي البشري لا يمكن نشر على المدى الطويل أو passaged لتوليد عدد كاف من الخلايا 8،9. ومع ذلك، مع بعض التعديلات في ظروف زراعة، أبلغنا توسيع وزرع NSPCs الحبل الشوكي المستمدة الإنسان البالغ، مما يدل على تجديد الذاتوNSPCs متعدد القدرات يمكن عزلها عن الكبار الحبل الشوكي البشري من الجهات المانحة زرع الأعضاء 10. في المقام الأول، وإزالة معظم المادة البيضاء خلال تشريح وزراعة هذه الخلايا على الركيزة ملتصقة في النمو التخصيب عامل الوسيطة المحددة لتكاثر الكبار NSPCs الحبل الشوكي. في هذا البروتوكول وصفنا حصاد الحبل الشوكي من الفئران الكبار والجهات المانحة زرع الأعضاء البشرية، تشريح الأنسجة المحيطة بالبطين، والعزلة، والثقافة، وتوسيع NSPCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من لجنة رعاية الحيوان لشبكة الصحة جامعة، تورونتو ON كندا، وفقا للسياسات التي أنشئت في دليل لرعاية واستخدام حيوانات التجارب من قبل المجلس الكندي للرعاية الحيوان مستعدة. لحصاد الأنسجة النخاع الشوكي الإنسان، تم الحصول على موافقة من البحوث الأخلاق مجلس شبكة الصحة جامعة ومن تريليوم-هدية من مؤسسة الحياة التي تشرف على التبرع بالأعضاء في أونتاريو، كندا.
1. إعداد تشريح المخازن والثقافة وسائل الإعلام
- لعزل الفئران الحبل الشوكي، وإعداد 100 مل العازلة تشريح (1X PBS + 0.6٪ جلوكوز + 2٪ البنسلين، الستربتومايسين) وبردت. لالحبل الشوكي البشري إعداد 100 مل العازلة تشريح (1X HBSS + 0.6٪ جلوكوز + 2٪ البنسلين، الستربتومايسين) وبردت.
- إعداد 100 مل مصل خالية المتوسطة (SFM) ودافئة في 37 ° C. لإعداد SFM، إضافة 2 ملي الجلوتامين L-100 ميكروغرام / مل البنسلين، الستربتومايسين، 2٪ B27، و 10٪ هرمون مزيج لNeurobasal-A المتوسطة. لإعداد هرمون المزيج، وجعل 1: 1 DMEM / F12 المتوسط تحتوي على 0.6٪ جلوكوز، 3 ملي NaHCO 3، 5 ملي HEPES، 25 ميكروغرام / مل الأنسولين، 100 ميكروغرام / مل APO-ترانسفيرين، 10 ميكرومتر بوتريسين، 30 نانومتر السيلينيوم، و20 نانومتر البروجسترون.
- إعداد التخصيب عامل النمو EFH وسائل الإعلام الطلاء (SFM إلى إضافة 20 نانوغرام / مل EGF، 20 نانوغرام / مل bFGF، و 2 ميكروغرام / مل الهيبارين) وحارا في 37 ° C. ضمان EFH البشري يحتوي على عوامل النمو المؤتلف الإنسان (انظر جدول المواد).
2. الحصاد وتشريح الكبار الجرذ المحيطة بالبطين نسيج الحبل الشوكي
- تعقيم الأدوات تشريح في الإيثانول وشطف في المياه المالحة عقيمة، أو أدوات الأوتوكلاف مقدما. إعطاء الفئران (6-8 أسابيع من العمر) حقنة قاتلة من بنتوباربيتال الصوديوم (1 سم عند 65 ملغ / مل) أو جرعة زائدة من مخدر (أي 4٪ isofluorane) وفقا لمؤسسة واحدة قد وافق بروتوكول الحيوان. د[أوس] الجزء الخلفي من الفئران مع 70٪ من الإيثانول وإزالة الجلد على السطح الظهري مع مقص تشريح كبيرة.
- عقد مقص عمودي على السطح الظهري، قطع مستعرض العمود الفقري فوق hindlimbs. استخدام مقص أصغر لقطع طولي ظهري العضلات التي تغمر العمود الفقري في اتجاه منقاري لفضح العمليات الشائكة.
- ابتداء من نهاية الذيلية المكشوفة، وإدراج رينجرز أو حادة صك قطع العظام الصغيرة الجافيه إلى الجانب الوحشي من القناة الشوكية في الفضاء بين النخاع الشوكي والعمود الفقري. إجراء تخفيضات صغيرة في الصفيحة (الأقواس العظمية اليسار واليمين من العمليات الشائكة على كل جانب من فقرات) وقشر بعناية بعيدا عن الصفيحة لفضح الحبل الشوكي (الشكل 1A-D). ضمان زاوية من ريش ضحلة وموازية لسلك حتى لا تلف الحبل الشوكي الأساسي.
- تواصل الثقب في الاتجاه منقاري الى معارضالبريد الحبل الشوكي الصدري وعنق الرحم.
- استئصال بلطف الحبل الشوكي من العمود الفقري مع ملقط الأنسجة حادة وmicroscissors استخدامها لقطع بعناية جذور للافراج عن الحبل. وضع الحبل الشوكي رفعه في طبق بتري تحتوي على 4 ° C الفئران العقيمة العازلة تشريح (المذكورة أعلاه في 1.1). شطف الأنسجة في طازجة 4 ° C عازلة تشريح وقطع باستخدام مقص الحبل الشوكي بالعرض إلى شرائح 1 سم (الشكل 1E).
- لكل جزء من الأنسجة، استخدم يدا واحدة لعقد النسيج مع ملقط غرامة. مع جهة أخرى، استخدم microscissors لإزالة السحايا المغطي، المادة البيضاء، ومعظم المادة الرمادية بعناية بمساعدة نطاق تشريح. بدلا من ذلك، استخدم ملقط غرامة (دومون 4 #) لقشر بعيدا أكثر من المادة الرمادية والبيضاء، ولم يتبق سوى المنطقة المحيطة بالبطين من الحبل الشوكي والذي يتضمن ependyma وكمية صغيرة من المحيط الرمادية المسألة (الشكل 1F-H).
- تجمع الأنسجة المحيطة بالبطين تشريح في طبق بتري 10 سم العقيمة التي تحتوي على البارد الفئران عازلة تشريح.
3. الحصاد وتشريح الكبار المحيطة بالبطين الإنسان نسيج الحبل الشوكي
ملاحظة: يتم حصاد الأنسجة النخاع الشوكي الإنسان من الجهات المانحة زرع الأعضاء الكبار (تراوحت المانحين في سن 2-60 سنة من العمر) بعد أن تم إزالة الأجهزة الأخرى لزرع الأعضاء. وتريليوم-هدية من برنامج الحياة يحصل على موافقة لإزالة الأنسجة لأغراض البحث من عائلة المريض ويشعر فريق الحصاد لدينا في الوقت المناسب بحيث كنا قادرين على حصد الحبال في غضون 2 ساعة من الأبهر عبر لقط. وتقبل المانحين الكبار من الذكور والإناث مع الأمصال سلبي ولا إصابات.
- حصاد الأنسجة بطريقة معقمة في غرفة العمليات من خلال نهج الأمامي باستخدام نفس التعرض الأمامي تشريح بالفعل لإزالة الجهاز من قبل TRANSP الجهازفريق الحصاد LANT.
- كشف العمود الفقري الأمامي من خلال التراجع مع رش ضلع كبير والكامشات مجداف كبيرة من الأنسجة والأعضاء المتبقية، بما فيها الأوعية الدموية الكبيرة.
- استخدام منشار القصية شنت بشفرة طويلة لقطع طريق الأقراص الفقرية في نهايات منقاري والذيلية للطول المطلوب من العمود الفقري إلى أن مقطوعة. زاوية المنشار حوالي 45 ° إعلامي لخفض حوض الثلاثي من الجزء الجانبي من الهيئات الفقري وقف قصيرة فقط من القناة الشوكية.
- إزالة ككل الجوانب وسطي من الهيئات الفقري للقطاعات المطلوبة مع المعونة من osteotomes المنحنية ومطرقة مع الحرص على تجنب قطع طريق الجافية. ثم رفع بلطف الجافية مغطاة الحبل الشوكي مع ملقط مسنن وشق بحدة نهايات منقاري والذيلية من الحبل. استخدام مقص طويلة وملقط لالمسح الشامل على المستوى الثنائي جذور الفردية.
- ضع شريحة رفعه من الحبل الشوكي في 4 درجات؛ C العازلة العقيمة (1X HBSS + 0.6٪ جلوكوز + 2٪ البنسلين ستربتومايسين) في أنبوب اختبار كبير للنقل إلى غرفة زراعة الأنسجة.
- ملاحظة: عموما، 3 - قطعة 6 سم من الحبل الشوكي من الصدر العلوي و / أو منتصف إلى انخفاض مستوى الصدري إزالة في غرفة العمليات تحت ظروف معقمة في أقرب وقت ممكن بعد وقف الدورة الدموية وضعها في المخزن المعقم البارد . الوقت المنقضي بين وقف الدورة الدموية وإزالة الحبل الشوكي يختلف مع الوقت اللازم لحصاد الأجهزة المستهدفة للتبرع، وتراوحت بين 45 دقيقة إلى 2 ساعة. إذا تم إزالة القلب والرئتين، وتشريح يمكن أن تؤخذ بعيدا rostrally لجني جزء من الحبل عنق الرحم أقل أيضا.
- تشريح الأنسجة النخاع الشوكي الإنسان في أقرب وقت ممكن بعد الحصاد، عموما في غضون 3 ساعات. إزالة الجافية والسحايا أخرى بالملقط. شطف الأنسجة الحبل الشوكي في تقدم طازجة 4 ° C عازلة تشريح وقطع مستعرض إلى 1 سم القطاعات.
- مع المعونة من نطاق تشريح، استئصال السحايا المغطي، المادة البيضاء، ومعظم المادة الرمادية باستخدام ملقط الأنسجة، ملقط غرامة وmicroscissors لكل قطاع النسيج. تجمع الأنسجة المحيطة بالبطين تشريح، والذي يتضمن ependyma وكمية صغيرة من المادة الرمادية المحيطة، في طبق بتري 10 سم العقيمة التي تحتوي على البارد عازلة تشريح البشري.
4. عزل والتثقيف من الكبار الفئران وNSPCs الحبل الشوكي الإنسان
- قم بالخطوات التالية جو معقم و مطهر في غطاء تدفق الصفحي.
- تخطر على الفئران تشريح الأنسجة المحيطة بالبطين أو الإنسان إلى 1 مم 3 قطع مع microscissors.
- إنزيمي فصل الأنسجة المفروم مع الإنزيمات المحللة للبروتين استخدام عدة التفكك غراء كما هو مبين في الجدول المواد / الكواشف. ملاحظة: تشمل مكونات كاشف 4 قوارير. قارورة 1: محلول الملح ايرل المتوازن (EBSS)، فيال 2: containin غراءز L-السيستين وEDTA، فيال 3: ديوكسي ريبونيوكلياز I (الدناز)، فيال 4: مخاطاني البيض مثبط البروتياز مع ألبومين المصل البقري (BSA).
ملاحظة: ملاحظة: غراء هو الأنزيم البروتيني سلفهيدريل التي لديها خصوصية كبيرة للركائز البروتين. غراء هنا مشتق من مادة اللاتكس من نبات البابايا CARICA ويحط معظم ركائز البروتين على نطاق أوسع من البروتياز البنكرياس. أثناء عملية التفكك هناك بعض DNA تسبب تلف الخلايا التي ستصدر في المتوسط التفكك والتي سوف تزيد اللزوجة وجعل pipetting لصعوبة. وبالتالي، يتم تضمين الدناز في إجراء العزل خلية لهضم الحمض النووي دون الإضرار خلايا سليمة. Ovomucoids وبروتين سكري مثبطات الأنزيم البروتيني تستخدم لتثبيط النشاط غراء بعد خطوة التفكك.
- في أول استخدام، إعادة تشكيل خليط الزلال مخاطاني البيض المانع (قارورة 4) مع 32 مل من EBSS (قارورة 1)، ومن ثم تخزينها في 4 درجات مئوية، وتستخدم لالعزلة اللاحقة.ملاحظة: هذا ينتج حلا على تركيز فعالة من 10 ملغ من المانع مخاطاني البيض و 10 ملغ من الزلال لكل مل.
- إضافة 5 مل من EBSS (قارورة 1) إلى قارورة غراء (قارورة 2)، مما أسفر عن حل في 20 وحدة من غراء / مل في 1 ملي L-السيستين مع 0.5 ملي EDTA. تحقق من أن الحل غراء يبدو واضحا عندما يذوب تماما، ضع خلاف ذلك القارورة في 37 ° C حمام الماء لمدة عشر دقائق حتى يذوب تماما غراء لضمان النشاط الكامل للإنزيم.
- إضافة 500 ميكرولتر من EBSS (قارورة 1) إلى قارورة الدناز (قنينة 3) وتخلط بلطف كما الدناز حساسة للتمسخ القص. إضافة 250 ميكرولتر من محلول الدناز إلى القارورة التي تحتوي على غراء، مما أدى إلى تركيز النهائي من حوالي 20 وحدة / مل غراء و 0.005٪ الدناز. حفظ ما تبقى من قنينة الدناز لاستخدامها لاحقا.
- وضع الفئران مفروم أو الأنسجة البشرية في حل غراء كما أعدت في الخطوة 4.4 أعلاه. لعزل الأنسجة البشرية، وتقسيم الأنسجة المفروم بالتساوي بين اثنينقارورة غراء (حوالي 0.2 غرام / القارورة).
- احتضان عند 37 درجة مئوية مع الإثارة مستمرة على منصة الروك لفصل الأنسجة في حل غراء تفعيلها. احتضان الأنسجة الفئران لمدة 45 دقيقة إلى 1 ساعة، والأنسجة البشرية ل1-2 ساعات اعتمادا على كمية من النسيج مفروم، حوالي 0،2-0،4 غرام على التوالي.
- يسحن الخليط مع ماصة 10 مل إلى فصل أي قطعة نسيج المتبقية لتسفر عن التعليق الخلية غائم. نقل تعليق الخلية (لا تشمل أي قطعة من النسيج undissociated) في العقيمة 15 مل أنبوب مخروطي وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق على RT.
- resuspend الخلايا مكعبات في المتوسط تحتوي على مخاطاني البيض، مثبط غراء.
- إعداد الحل مخاطاني البيض عن طريق خلط 2.7 مل EBSS (قارورة 1) مع 300 ميكرولتر من إعادة تشكيل الألبومين مخاطاني البيض المانع الحل (قارورة 4) في 15 مل أنبوب مخروطي الشكل. إضافة 150 ميكرولتر من الدناز الحل (قارورة 3) المحفوظة في خطوة 4.4 أعلاه.
- تجاهل طاف منالخلايا مكعبات وعلى الفور resuspend الكرية خلية في الدناز المخفف خليط الألبومين المانع.
- خلايا سليمة منفصلة من أغشية الخلايا بواسطة الطرد المركزي من خلال خطوة واحدة كثافة متقطع التدرج.
- إعداد التدرج الكثافة متقطعة عن طريق إضافة 5 مل من محلول الزلال-المانع (قنينة 4) لأنبوب 15 مل، وباستخدام ماصة 5 مل، برفق وببطء طبقة تعليق خلية (أعد كما هو موضح أعلاه في الخطوة 4.8) على رأس الحل الألبومين المانع.
- أجهزة الطرد المركزي في 70 x ج لمدة 6 دقائق في RT.
- ملاحظة: يجب أن يكون واجهة بين طبقتين من التدرج واضحة للعيان، على الرغم من أن الحد الأدنى من الخلط في هذه الحدود لا يؤثر على النتيجة. لا تزال شظايا غشاء في واجهة والخلايا نأت بيليه في الجزء السفلي من الأنبوب.
- لخلايا الفئران، التخلص من طاف و resuspend بيليه خلية في 1 مل من الفئران EFH المتوسطة (قبل تحسنت عند 37 درجة مئوية).عد كثافة الخلية الحية مع haemocytometer ولوحة الخلايا في قارورة ثقافة T25 في مناطق ذات كثافة من 10 خلية / ميكرولتر في EFH. العائد نموذجي من الخلايا من أنسجة الفئران حوالي 2 × 10 6 خلايا مع والمطلوب حوالي 80٪ viability.If الثقافات نسيلي، وخلايا البذور في مناطق ذات كثافة أقل من 10 خلية / ميكرولتر. احتضان القوارير في 37 درجة مئوية في CO 2 5٪ والسماح للثقافات أن ينمو دون عائق ل1 أسبوع لتجنب تجميع المجالات.
- للخلايا البشرية، ونبذ طاف و resuspend بيليه خلية في 10 مل من البشر المتوسطة EFH (قبل تحسنت عند 37 درجة مئوية). تصفية تعليق الخلية من خلال الخلية 40 ميكرومتر النايلون مصفاة يتبع مع 30 مل من EFH لإزالة المايلين وغشاء الخلية شظايا. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق و resuspend بيليه خلية في 1 مل من EFH المتوسطة.
- عد كثافة الخلية الحية مع haemocytometer ولوحة الخلايا البشرية في لوحات ثقافة 6 جيدا في مناطق ذات كثافة من 10 5 خلية / جيدا في الحجم الكلي5 مل EFH / جيد. العائد نموذجي من الخلايا من الأنسجة البشرية هو حوالي 1 × 10 6 خلايا مع حوالي 70٪ جدوى. الآبار قبل معطف مع الركيزة ملتصقة مثل Matrigel (انظر الملاحظة أدناه). تمييع بنسبة 40 ميكرولتر Matrigel: 1 مل SFM.
- ملاحظة: بدلا من ذلك، ركائز ملتصقة أخرى مثل بولي-D-يسين / laminin، فبرونيكتين، أو الكولاجين ويمكن استخدام.
- احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية في CO 2 5٪ والسماح للثقافات أن ينمو دون عائق لمدة 1 أسبوع.
5. الركض من الفئران الكبار وNSPCs الحبل الشوكي الإنسان
- سوف NSPCs الفئران تشكيل neurospheres صغير حوالي 70 ميكرون في القطر ضمن 1 أسبوع من بذر الأولي. NSPCs الفئران مرور أسبوعيا من خلال جمع تعليق خلية، الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق، والطحن ميكانيكيا بيليه الخلية إلى الفصل بين neurospheres.
- البذور الخلايا فصل في قوارير T25 التي تحتوي على الفئران الطازجة EFH المتوسطة. بدلا من ذلك،استخدام 50٪ مكيفة المتوسطة الفئران في الركض. العائد نموذجي من NSPCs الفئران في الركض حوالي 5 × 10 6 خلايا مما يزيد أضعافا مضاعفة مع عدد مرور.
- لالثقافات الإنسانية، بعد أسبوع واحد من الطلاء الأولي، استبدال نصف مستنبت مع EFH الطازج مرتين في الأسبوع للسماح للخلايا على الانضمام إلى الركيزة. عموما، 1 - 2 بعد أسابيع مرة واحدة وقد أرفقت الخلايا إلى الركيزة، استبدال وحدة التخزين بالكامل من مستنبت مرتين في الأسبوع مع EFH الطازجة.
- خلايا فرعية قبل الوصول إلى نقطة التقاء بين 4-8 أسابيع.
- خلايا فرعية من قبل فصل الخلايا من الركيزة إنزيمي (انظر جدول المواد) مع 2 مل انزيم في المحتضنة جيدا لحوالي 10 دقيقة عند 37 ° C. جمع تعليق خلية، الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق، و resuspend بلطف بيليه خلية في 1 مل من تقدم طازجة EFH المتوسطة.
- عد الخلايا الحية مع haemocytometer ولوحة الخلايا في لوحات ثقافة 6 جيدا (قبل المشتركATED على النحو الوارد أعلاه في الخطوة 4.12) في مناطق ذات كثافة من 10 5 خلية / جيدا في إجمالي حجم 5 مل EFH / جيد. العائد نموذجي من NSPCs الإنسان في الركض حوالي 2 × 10 6 خلايا وعموما هذا سوف يتضاعف مع مرور. عموما، والحفاظ على الثقافات مع 50٪ مكيفة المتوسطة EFH 2-3 مرات في الأسبوع بين الركض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
سوف الفئران الكبار خلايا النخاع الشوكي نمت في الثقافة تعليق في EFH المتوسطة تشكل neurospheres صغير (مستعمرات الخلايا غير المتمايزة) ضمن 1 أسبوع من الطلاء الأولي. في الثقافات الأولية، فإن معظم الخلايا مطلي يموت ونمو الخلايا الجذعية عامل تستجيب سوف تتكاثر ويتم اختيار لفي المتوسط EFH. قبل مرور 3، وسوف يكون هناك العديد من neurospheres التعويم الحر حوالي 100 ميكرون في القطر (الشكل 2A). Neurospheres مستديرة ومرحلة مشرقة، وتحت التكبير عالية، وتعتبر microspikes مثل أهداب جاحظ من الخلايا على السطح الخارجي للمجالات التي هي سمة من neurospheres عكس كتل من الحطام الخلية (الشكل 2B). العائد نموذجي من الخلايا من أنسجة الفئران حوالي 2 × 10 6 خلايا مع حوالي 80٪ جدوى. لا ينبغي أن المصنف في neurospheres في عالية جدا كثافة لتجنب تجميع مجموعات الخلايا. أيضا، أصبحت neurospheres كبير من الصعب فصل والخلايا ستصبحنخرية في وسط الميدان. ويحدث هذا أيضا إذا تركت الثقافات وقتا طويلا قبل الركض. في الثقافة EFH، الفئران الكبار NSPCs الحبل الشوكي تتكاثر (الشكل 2C) والتعبير عن nestin (الشكل 2D) علامة للخلايا السلائف، ومستويات منخفضة من علامات العصبية الناضجة (لا تظهر البيانات).
الكبار الحبل الشوكي البشري الثقافات NSPC لا تنمو بالسرعة الثقافات NSPC الفئران. إذا يتم استزراع خلايا النخاع الشوكي الإنسان في البداية في التعليق، وأنها ستشكل وحدات العمل ومجموعات غير منتظمة من أعداد صغيرة من الخلايا جنبا إلى جنب مع الحطام (الشكل 3A). الركض لاحق من هذه الثقافات لا تشجع إثراء السكان NSPC. ومع ذلك، عندما يتم مطلي الخلايا البشرية في بيت التمويل الأوروبي على أحادي الطبقة ملتصقة، عامل استجابة نمو NSPCs التمسك الركيزة (الشكل 3B) واستبدال وسائل الاعلام لاحق يزيل المايلين والحطام الخلية (الشكل 3C). العائد نموذجي جملتعلمي اللغة اإلنكليزية من الأنسجة البشرية حوالي 1 × 10 6 خلايا مع حوالي 70٪ جدوى. عندما الثقافات NSPC الإنسان أن تصبح راسخة باعتباره أحادي الطبقة ملتصقة، وNSPCs يمكن بعد ذلك أيضا أن مطلي في الثقافات تعليق لتشكيل neurospheres التعويم الحر. في الثقافة EFH، NSPCs الحبل الشوكي الإنسان البالغ تتكاثر (الشكل 3D) والتعبير عن nestin (الشكل 3E) وSox2 (الشكل 3F)، وهو عامل النسخ يظهر أن أعرب من قبل خلايا الجذعية العصبية، ومستويات منخفضة جدا من علامات العصبية الناضجة (بيانات لا يظهر).
الشكل 1. استئصال الصفيحه من الفئران الحبل الشوكي وتشريح المنطقة المحيطة بالبطين. (A) في نهاية الذيلية المكشوفة من الحبل الشوكي، يتم إدراجها رينجرز الجافيه إلى الجانب الوحشي من القناة الشوكية. مصنوعة (B) تخفيضات صغيرة في الصفيحة على كل سي دي من الفقرات والصفيحة ومقشر بعناية بعيدا لفضح الحبل الشوكي. (C) والحبل الشوكي العنقي يتعرض بعد الثقب (D) رسم تخطيطي للالصدري الفقري المقطع العرضي يظهر الحبل الشوكي، والمكان من التخفيضات التي أجريت على الثقب (كما هو مبين مع الخطوط المنقطة الحمراء). تتم إزالة الصفائح والعملية الشائكة (المنطقة المظللة). (E) يتم قطع الحبل الشوكي بالعرض إلى شرائح 1 سم. (F) السحايا المغطي، المادة البيضاء، ويتم إزالة معظم المادة الرمادية بعناية باستخدام microscissors. (G ) مفروم الأنسجة المحيطة بالبطين. (H) مستعرض قسم من الفئران الحبل الشوكي ملطخة luxol بسرعة hemotoxylin الأزرق ويوزين ومع مخطط منقط تبين تشريح المنطقة المحيطة بالبطين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
: المحافظة على together.within صفحة = "دائما"> 
الشكل 2. الفئران الكبار NSPCs الحبل الشوكي. (A) حسب مرور 3، وينظر العديد من neurospheres عندما تزرع الفئران NSPCs الحبل الشوكي في التعويم الحر ثقافة تعليق. (B) Neurospheres هي المرحلة مشرقة وmicrospikes جاحظ من neurospheres (الأسهم ) واضحة في تضخم عالية. (C) فصل neurospheres (مرور 3، يوم 4) ومطلي على الآبار Matrigel المغلفة في EFH المتوسطة، ثابتة، وimmunostained و counterstained مع هويشت لتصور النوى (الأزرق). في ظروف EFH، الفئران الكبار NSPCs الحبل الشوكي تتكاثر (كما هو موضح مع Ki67 المناعية)، و (D) nestin صريح في المقام الأول. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
FO: المحافظة على together.within صفحة = "دائما"> 
الشكل 3. الكبار NSPCs الإنسان النخاع الشوكي. (A) عندما مطلي في البداية في قوارير ثقافة وتعليم الكبار NSPCs الحبل الشوكي الإنسان لا تنمو جيدا. في الثقافات تمسكا الابتدائية في EFH، يوليان الثقافات الأولية التعويم الحر في EFH المتوسطة (13 يوما بعد الطلاء) تظهر مجاميع من الخلايا والحطام. (B) وعلى النقيض NSPCs إلى الركيزة Matrigel (الأسهم)، كما هو موضح في 17 يوما بعد والطلاء، و(C) في 41 يوما في المختبر. (D) في EFH المتوسطة، والكبار NSPCs الحبل الشوكي الإنسان تتكاثر، كما هو موضح مع Ki67 المناعية (26 يوما في المختبر أظهرت)، وصريح في المقام الأول (E) nestin (26 يوما في معمليا معروضة) و (F) Sox2 (66 يوما في المختبر معروضة). وcounterstained النوى مع هويشت (الأزرق)./ftp_upload/52732/52732fig3large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
خلال تشريح الفئران الحبل الشوكي الرعاية الأنسجة ينبغي أن تؤخذ على عدم الإضرار الحبل الشوكي أثناء أداء الثقب. فمن الأسهل لعزل الأنسجة المحيطة بالبطين عندما شرائح النخاع الشوكي سليمة. شرائح الأنسجة ينبغي أن تكون مغمورة تماما في المخزن تشريح والسحايا المغطي والمادة البيضاء ويمكن خفض بعيدا عن شرائط طولية مع microscissors. بدلا من ذلك، ملقط الأنسجة الدقيقة يمكن أن تستخدم لقشر المادة البيضاء بعيدا.
لإجراء العزل لNSPCs، استخدمنا طريقة التفكك-غراء إدتا جنبا إلى جنب مع سحن الميكانيكية لفصل الفئران وأنسجة الحبل الشوكي الإنسان. مقارنة البروتياز الأخرى، غراء هو أقل ضررا ولكنه فعال، كما هو موضح سابقا مع تفكك الفئران بعد الولادة العصبونات القشرية 11. وجدنا أن تفارق مع سحن الميكانيكية الوحيد، الذي يستخدم عادة مع أنسجة الجنين، ليست فعالة كما هو الحال مع الأنسجة من الكبار. بعد عشرالبريد تفارق الأنزيمية، سحن الميكانيكية مهم لتفريق شظايا الأنسجة المتبقية. سحن مع تشتت خلية المتكررة مع ماصة يجب أن يتم تنفيذ ذلك لا توجد المتبقية شظايا أنسجة سليمة مما أدى إلى تعليق خلية غائم. ومع ذلك، لا ينبغي أن يؤديها سحن بقوة أيضا لتجنب محتدما لتعليق الخلية وموت الخلايا الناتجة.
لالركض، وفصلها neurospheres الفئران إلى تعليق خلية واحدة عبر سحن الميكانيكية، كما وصفت في الأصل 2. ومع ذلك، neurospheres كما يمكن فصلها باستخدام أساليب الأنزيمية مثل التربسين-EDTA التي لن تضر مستقبلات سطح الخلية أو تتداخل مع تشكيل المجال طالما التعرض الأنزيمية وجيزة 12.
هناك عدد من المزايا في استخدام مقايسة neurosphere للثقافة NSPCs. أنها بسيطة نسبيا، قابلة للتكرار، ويسمح للتوسع السريع للسل الجذعية العصبيةليرة سورية 2،12. ومع ذلك، neurospheres هم غير متجانسة تتألف أساسا من الخلايا الاصلية التي هي أكثر تشددا وسوى عدد قليل من الخلايا الجذعية. عدة عوامل مثل كثافة الخلايا وتقنية الركض قد يؤثر على النمط الظاهري للثقافات، ويمكن أن تشكل neurospheres أيضا من الخلايا الاصلية 13. Neurospheres ومتحركة للغاية ويمكن أن تلتحم حتى في ظل ظروف انخفاض كثافة الخلية 14. وبالتالي، فإن عدد neurospheres في الثقافة لا تمثل العدد من الخلايا الجذعية. للتمييز الخلايا الجذعية العصبية من الخلايا الاصلية، ينبغي للمرء أن استخدام مستعمرة العصبية تشكيل خلية مقايسة 15،16.
الفئران الكبار NSPCs الحبل الشوكي تنمو بشكل جيد كما neurospheres في الثقافة تعليق في EFH تستكمل المتوسطة وتكون قابلة للتوسيع بسهولة. في المقابل، وجدنا أن NSPCs الحبل الشوكي الإنسان البالغ تنمو على نحو أفضل باعتباره أحادي الطبقة ملتصقة 10. الخلايا الجذعية العصبية المشتقة من الدماغ البشري لا يمكن أن يستمر على المدى الطويل في أحادي الطبقة عبادةلدى عودتهم في المتوسط محددة الصفات كيميائيا في وجود mitogens التي تعزز قدرة التكاثري على 17،18. كما هو موضح في هذا البروتوكول، NSPCs يمكن عزله عن الكبار الحبل الشوكي البشري من الجهات المانحة زرع الأعضاء وpassaged وتوسيع باعتباره أحادي الطبقة ملتصقة في وجود EGF، bFGF، والهيبارين 10. فمن الأسهل لعزل NSPCs من تقل أعمارهم عن الجهات المانحة القديمة مع توسع الخلايا بشكل أسرع، على الرغم من NSPCs لا يزال من الممكن عزل من الجهات المانحة في موقعنا أقصى سن 60 عاما 10. لقد قمنا بفحص مجموعة متنوعة من ركائز ملتصقة مثل Matrigel، فبرونيكتين، نوع الكولاجين الأول، وبولي-D-يسين / laminin، وجدت هذه أن تكون فعالة لالتزام الكبار الحبل الشوكي البشري NSPCs 10. في البداية كل من neurosphere والثقافات ملتصقة تحتوي على المجاميع الخلوية، والحطام، والخلايا الميتة. ولكن هذا الحطام تتم إزالة تدريجيا مع subculturing ونمو التخصيب عامل neurobasal المتوسطة يختار لNSPCs المتكاثرة. كما الانقاض وتلوث المايلين يمكن تخفيض مع تشريح دقيق وإزالة المادة البيضاء من شرائح الأنسجة الحبل الشوكي. تصفية تعليق الخلية الناتجة من خلال مصفاة قبل الطلاء كما يزيل المايلين.
لدينا مثقف الكبار NSPCs الحبل الشوكي كما الطبقات الوحيدة ملتصقة لمدة 9 أشهر على الأقل تنطوي على ما يقرب من 10 الممرات، على الرغم من الثقافات القديمة هناك خطر متزايد للتشوهات النمط النووي. أجرينا تحليل النمط النووي على NSPCs الإنسان تربيتها لمدة 4 أشهر، والعثور على النمط النووي مضاعفا العادي مع عدم وجود شذوذ الكروموسومات (لا تظهر البيانات). كما وجدنا أن تكاثر الخلايا والقدرة على التمايز إلى قليلة التغصن انخفضت مع زيادة الوقت في الثقافة. على سبيل المثال، انخفضت نسبة النسبية للخلايا إيجابية O4 من 1.3٪ في الشهر 1 في الثقافة إلى 0.01٪ في 4 أشهر في الثقافة 10. كل من الفئران وNSPCs البشرية قابلة للالحفظ بالتبريد باستخدام التقى تجميد القياسيةhods وتبين عدم وجود فروق كبيرة في التشكيل المظهري.
العزلة وتوسيع NSPCs متعدد القدرات في ثقافة تسمح لعدة تطبيقات في المختبر بما في ذلك دراسة العوامل المختلفة على الكبار العصبية تمايز الخلايا الجذعية. يمكن أن تتولد زيادة أعداد NSPCs في المختبر وزرعها في النماذج الحيوانية مثل إصابات الحبل الشوكي، والسكتة الدماغية، والأمراض العصبية التنكسية لدراسة استجابة تعويضية من هذه الخلايا الجذعية العصبية في الجسم الحي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | Life Technologies | #10010023 | Dissection buffer |
| 1x HBSS | Life Technologies | #14175095 | Dissection buffer |
| D-glucose | Sigma | # G-6152 | Prepare 30% glucose stock solution for dissection buffer and hormone mix |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | #15140-148 | Dissection buffer and culture medium |
| Neurobasal-A | Life Technologies | #10888-022 | Culture medium |
| L-glutamine, 200 mM | Life Technologies | #25030-081 | Culture medium |
| B27 | Life Technologies | #12587010 | Culture medium |
| DMEM | Life Technologies | #11885084 | Hormone mix |
| F12 | Life Technologies | #21700-075 | Hormone mix |
| NaHCO3 | Sigma | # S-5761 | Prepare 7.5% NaHCO3 stock solution for hormone mix |
| HEPES | Sigma | #H9136 | Prepare 1M HEPES stock solution for hormone mix |
| Insulin | Sigma | #I-5500 | Hormone mix |
| Apo-transferrin | Sigma | #T-2252 | Hormone mix |
| Putrescine | Sigma | # P7505 | Hormone mix |
| Selenium | Sigma | #S-9133 | Hormone mix |
| Progesterone | Sigma | #P-6149 | Hormone mix |
| EGF, mouse | Sigma | #E4127 | Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium |
| EGF, human recombinant | Sigma | #E9644 | Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium |
| bFGF, human recombinant | Sigma | #F0291 | Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium |
| Heparin, 10,000 U | Sigma | #H3149 | Prepare 27.3 mg/ml stocks in hormone mix and aliquot; EFH medium |
| Papain dissociation kit | Worthington Biochemicals | #LK003150 | Contains EBSS, papain, DNase, ovomucoid protease inhibitor with BSA |
| Sodium Pentobarbital | Bimeda – MTC Animal Health Inc | DIN 00141704 | |
| Tissue Forceps: Addisons | Fine Science Tools | #11006-12 | Serrated standard tip; micro-tip also available |
| Fine Forceps: Dumont #4 | Fine Science Tools | #11241-30 | |
| Microscissors | Fine Science Tools | #15024-10 | Round-handled Vannas |
| Rongeurs | Bausch & Lomb | N1430 | |
| 10 mm Petri dishes | Nunc | 1501 | |
| T25 Culture flasks | Nunc | 156367 | |
| 40 μm nylon cell strainer | VWR | CA21008-949 | |
| 6 well plates | Nunc | CA73520-906 | |
| Matrigel, growth factor reduced (100x) | Corning | 354230 | Thaw according to directions and freeze aliquots; use diluted at a ratio of 40 μl Matrigel: 1 ml SFM |
References
- Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287, 1433-1438 (2000).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Gritti, A., et al. Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. J Neurosci. 16, 1091-1100 (1996).
- Morshead, C. M., et al. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
- Weiss, S., et al. Multipotent CNS stem cells are present in the adult mammalian spinal cord and ventricular neuroaxis. J Neurosci. 16, 7599-7609 (1996).
- Martens, D. J., Seaberg, R. M., van der Kooy, D. In vivo infusions of exogenous growth factors into the fourth ventricle of the adult mouse brain increase the proliferation of neural progenitors around the fourth ventricle and the central canal of the spinal cord. Eur J Neurosci. 16, 1045-1057 (2002).
- Kulbatski, I., et al. Oligodendrocytes and radial glia derived from adult rat spinal cord progenitors: morphological and immunocytochemical characterization. J Histochem Cytochem. 55, 209-222 (2007).
- Akesson, E., et al. Long-term culture and neuronal survival after intraspinal transplantation of human spinal cord-derived neurospheres. Physiol Behav. 92, 60-66 (2007).
- Dromard, C., et al. Adult human spinal cord harbors neural precursor cells that generate neurons and glial cells in vitro. J Neurosci Res. 86, 1916-1926 (2008).
- Mothe, A. J., Zahir, T., Santaguida, C., Cook, D., Tator, C. H. Neural stem/progenitor cells from the adult human spinal cord are multipotent and self-renewing and differentiate after transplantation. PLoS One. 6, e27079 (2011).
- Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. J Neurosci. 6, 3044-3060 (1986).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. , (2010).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nat Methods. 3, 801-806 (2006).
- Louis, S. A., Azari, H., Sharififar, S., Vedam-Mai, V., Reynolds, B. A. Neural-colony forming cell assay: an assay to discriminate bona fide neural stem cells from neural progenitor cells. J Vis Exp. , (2011).
- Louis, S. A., et al. Enumeration of neural stem and progenitor cells in the neural colony-forming cell assay. Stem Cells. 26, 988-996 (2008).
- Conti, L., et al. Niche-independent symmetrical self-renewal of a mammalian tissue stem cell. PLoS Biol. 3, e10 (2005).
- Pollard, S. M., Conti, L., Sun, Y., Goffredo, D., Smith, A. Adherent neural stem (NS) cells from fetal and adult forebrain. Cereb Cortex. 16, Suppl 1. i112-i120 (2006).
