Abstract
Yetişkin sıçan ve büyüme faktörü bakımından zenginleştirilmiş bir ortam içinde kültürlenmiş insan omurilik sinir kök / progenitör hücreleri (NSPCs) kendini yenileyen ve genişletilebilir nöral kök hücre multipotent çoğalması için izin verir. Serum koşullarda, bu multipotent NSPCs nöronlar, astrositler ve oligodendrositleri üreten, ayırt edecektir. Hasat doku bFGF (enzimatik olarak papain EDTA çözeltisi içinde çözülmüş ve daha sonra mekanik olarak, epidermal büyüme faktörü (EGF) ile desteklenmiş Neurobasal orta, temel fibroblast büyüme faktörü olduğu için kaplama, tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için ayrılmış ve kesintili bir yoğunluk gradyanı ile ayrıştırılır ) ve heparin. Yetişkin sıçan omurilik NSPCs yapışkan kültürler olarak büyütülür serbest yüzen neurospheres ve yetişkin insan omurilik NSPCs olarak kültürlenir. Bu koşullar altında, yetişkin omurilik NSPCs ön-madde hücreleri ifade belirteçleri, çoğalırlar ve sürekli geçmesi üzerine genişletilebilir. Bu hücreler olabilir bE, çeşitli uyaranlara karşı yanıt olarak, in vitro incelenmiştir ve dış faktörlerin nöral kök hücre farklılaşması incelemek için soy kısıtlama teşvik etmek için kullanılabilir. Multipotent NSPCs veya onların soyu rejeneratif onarım değerlendirmek için çeşitli hayvan modellerinde transplante edilebilir.
Introduction
NSPCs kendini yenilemek ve kolayca in vitro genişletebilirsiniz sinir soyu taahhüt multipotent hücrelerdir. Onlar kendini sürekli yenileyen multipotent kök hücreleri ve daha kısıtlı atalarıdır özelliklerini görüntülemek beri nöral kök / progenitör hücrelerin karışık bir nüfus olarak bu hücrelerin bakın. NSPCs fetus ve erişkin beyin ve omurilik 1,2 hem de bulunabilir. Yetişkin olarak, NSPCs normalde sakin ve yan ventriküller 2-4 astar subventriküler bölge ve spinal kord 5,6 merkez kanal çevreleyen periventriküler bölge de dahil olmak üzere belirli niş içinde bulunur.
Tipik haliyle, NSPCs EGF ve bFGF ile takviye edilmiş serumsuz ortam içinde serbest yüzen neurospheres ya da yapışık mono tabakaları, kök / progenitör hücre popülasyonları için seçin Mitojenler gibi kültürlenmiştir. Başlangıçta Reynolds ve Weiss 2 tarafından geliştirilen neurosphere deneyi, en yaygın olarak kültürlemek için kullanılan vesinir kök hücreleri genişletin. Bunlar büyüme faktörü içermeyen ortam serum içeren kaplama olduğunda NSPCs nöronlar, astrositler ve oligodendrosit ayırma yöntemi, multipotency göstermektedir. Kültürlü doku, merkezi kanal 6,7 bölgeleri içerdiğinde Multipotent, kendini yenileyen NSPCs yetişkin kemirgenden omurilik izole edilmiş ve kültürlenmiş edilebilir. Diğer bölgelerden gelen hücrelerin üretilmesi aksine yetişkin omurilikten kaynaklanan NSPCs kullanarak potansiyel avantajı, bu dokuya spesifik hücrelerin en yakın yaralanma ya da hastalık şu kayıp ya da hasarlı olan omurilik hücreleri benzer olmasıdır.
Önceki çalışma yetişkin insan omurilik türetilmiş neurospheres uzun vadeli yayılır veya hücre 8,9 yeterli sayıda üretmek için geçişli olamazdı gösterdi. Ancak, kültür koşullarında değişikliklerle, biz göstererek, yetişkin insan omurilik kökenli NSPCs genişletilmesi ve nakli bildirdi kendini sürekli yenileyenve multipotent NSPCs, organ nakli donörlerinin 10 yetişkin insan omurilik izole edilebilir. Öncelikle, büyüme faktörü açısından zenginleştirilmiş bir ortam içinde bir alt-tabaka üzerine yapışık diseksiyon ve bu hücrelerin kültür içinde beyaz bir maddenin en çıkarılması, yetişkin insan omurilik NSPCs çoğalan için seçildi. Bu protokolde, yetişkin sıçan ve insan organ nakli donör, periventriküler doku diseksiyonu ve NSPCs izolasyonu, kültür ve genişlemesi omurilik hasat açıklar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bütün hayvan prosedürleri Hayvan Bakımı Kanada Konseyi tarafından hazırlanan Deney Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Kılavuzu kurulan politikalarına uygun olarak, ON Canada Hayvan Bakım Üniversitesi Sağlık Ağı Komitesi, Toronto tarafından onaylanmıştır. İnsan omurilik dokusu hasat için onay Üniversitesi Sağlık Ağı Araştırma Etik Kurulu ve Ontario, Kanada'da organ bağışı denetleyen Hayat Vakfı Trillium-Hediyelik elde edilmiştir.
Diseksiyon Tamponlar ve Kültür Medya 1. Hazırlık
- Sıçan omur iliği izolasyonu için, 100 mi diseksiyon tamponu (1 x PBS +% 0.6 glikoz + 2,% penisilin-streptomisin) ile buzdolabında hazırlar. Insan omurilik için 100 mi diseksiyon tamponu (1 x HBSS +% 0.6 glikoz + 2,% penisilin-streptomisin) ile buzdolabında hazırlar.
- 37 ° C'de 100 mi, serum-içermeyen ortam (SFM) ve sıcak hazırlayın. SFM hazırlamak için, 2 mM L-glutamin ilave, 100 ug / mNeurobasal-A ortama l streptomisin penisilin,% 2 B27, ve% 10 hormonu karışımı. Hormon karışımı hazırlamak için, 1 olmak:% 0.6 glikoz ihtiva eden 1 DMEM / F12 ortamı, 3 mM NaHCO 3, 5 mM HEPES, 25 ng / ml insülin, 100 ug / ml apo-transferin, 10 uM putresin, 30 nM selenyum, ve 20 nM progesteron.
- EFH büyüme faktörü bakımından zenginleştirilmiş kaplama ortamı hazırlanması 37 ° C de ve sıcak (SFM 20 ng / ml, EGF, 20 ng / ml bFGF, 2 ug / ml heparin ekleme). İnsan EFH insan rekombinant büyüme faktörleri (Malzeme Tabloya bakınız) içerdiğinden emin olun.
2. Hasat ve Yetişkin Rat Periventriküler Omurilik Doku diseksiyonu
- Etanol diseksiyon aletleri sterilize ve önceden steril tuzlu su veya otoklav aletleri durulayın. Sıçan ver - Kişinin kuruma göre (6 8 haftalık) sodyum pentobarbital (65 mg / ml 1 cc) ya da anestezi (yani,% 4 isofluorane) doz aşımı ölümcül enjeksiyon hayvan protokolü onayladı. D% 70 etanol ile sıçan arka OUSE ve geniş diseksiyon makas ile dorsal yüzeyinde deri kaldırmak.
- Dorsal yüzeyine dik makas Holding, enine arka ayaklarında üstünde vertebra sütun kesti. Uzunlamasına spinöz süreçleri ortaya çıkarmak için bir Rostral yönde vertebra sütun örten dorsal kas kesmek için küçük makas kullanın.
- Maruz kuyruk ucunda başlayarak, omurilik ve omurga arasındaki boşlukta spinal kanal lateral içine ekstradural rongeurs ya da küçük bir künt kemik kesme aleti takın. Lamina içine küçük kesikler (sol kemik kemerler ve omurları her tarafında spinöz proses hakkı) yapın ve dikkatlice omuriliği (Şekil 1A-D) maruz lamina uzakta soyun. Kanatlarının açısı sığ olduğundan emin olun ve altta yatan omurilik hasarlı olup böylece kordon paralel.
- Tanitima rostralinde yönde laminektomi Devamtorakal ve servikal omurilik e.
- Yavaşça dikkatle kabloyu serbest bırakmak için kökleri koparmaya künt doku forseps ve kullanım microscissors omurga gelen omurilik tüketim. (1,1 yukarıda tarif edilen), 4 ° C, steril sıçan diseksiyon tampon içeren bir Petri kabındaki eksize omurilik yerleştirin. Taze hazırlanmış, 4 ° C kesme tamponu içerisinde doku durulayın kullanarak makas 1 cm uzunluğundaki parçalara (Şekil 1E) içine enine omurilik kesti.
- Doku her segment için, ince forseps ile doku tutmak için bir elinizi kullanın. Diğer elinizle, özenle diseksiyon kapsamı yardımıyla örten meninksler, beyaz cevher ve gri maddenin en kaldırmak için Microscissors kullanın. Alternatif olarak, ependima ve gri madde (Şekil 1F-H) çevreleyen küçük bir miktar içeren omurilik sadece periventriküler bölgeyi terk, beyaz ve gri maddenin en uzak soymak ince forseps (4 Dumont #) kullanın.
- Soğuk sıçan diseksiyonu tampon içeren bir 10 cm steril Petri kabı içine disseke periventriküler doku Havuz.
3. Hasat ve Yetişkin İnsan Periventriküler Omurilik Doku diseksiyonu
Not: diğer organlar organ nakli için kaldırılmıştır sonra İnsan omurilik dokusu yetişkin organ nakli vericilerden hasat edilir (donörler yaş 2 ile 60 yaşları arasında değişiyordu). Hayat Programı Trillium-Hediyelik hastanın ailesi araştırma amaçlı dokusunun çıkarılması için onay alır ve biz aortik kros-klemp 2 saat içinde halatlar hasat mümkün olmuştur, öyle ki zamanında bizim hasat ekibi bildirir. Erkek ve kadın yetişkin serolojisi negatif olan donörler ve hiçbir enfeksiyon kabul edilir.
- Aynı anterior poz kullanarak anterior yaklaşımla ameliyathanede steril bir şekilde Hasat doku zaten Organ Şeffaf tarafından organ için dissekelant hasat ekibi.
- Büyük kaburga serpme ve büyük kan damarları dahil geri kalan doku ve organların büyük kürek Retraktörler ile geri çekilmesi yoluyla ön omuriliğe Açığa.
- Rezeke edilecek omurganın istenilen uzunlukta rostral ve kaudal ucunda intervertebral diskler yoluyla kesmek için uzun bir bıçak ile monte edilmiş bir sternum testeresi kullanın. Açı testere yaklaşık 45 ° medial spinal kanal sadece kısa durdurma omurların yan kısmından üçgen çukur kesmek için.
- En blok dura ile kesme önlemek için özen kavisli keskisi ve çekiç yardımı ile istenen kesimlerin vertebralarda medial yönlerini çıkarın. Sonra yavaşça dişli forseps ile dura kaplı omurilik kaldırın ve keskin kordon rostral ve kaudal uçları insizyon. Bilateral bireysel kökleri transect uzun makas ve forseps kullanın.
- 4 ° spinal kord eksize segmenti yerleştirinC, steril tampon maddesi (1x HBSS +% 0.6 glikoz + 2,% penisilin-streptomisin) doku kültürü oda taşınması için büyük bir test tüpü içinde.
- Not: Genellikle, 3 - Üst torasik spinal kord 6 cm kısmın ve / veya orta-düşük torasik seviyesi mümkün olduğu kadar çabuk dolaşımda kesilmesinden sonra steril koşullar altında ameliyathanede çıkarıldı ve soğuk steril tampon yerleştirilir . dolaşımın kesilmesi ve omurilik çıkarılması arasında geçen süre bağışı için hedeflenen organlarını toplamak için gereken zamanla değişir ve 45 dakika ile 2 saat arasında değişmektedir. Kalp ve akciğerler de kaldırıldı varsa, diseksiyon yanı sıra alt servikal kord bir kısmını hasat için çok rostrally alınabilir.
- 3 saat içinde genellikle hasattan sonra en kısa sürede insan omurilik dokusu parçalara ayır. Forseps ile dura ve diğer meninksler çıkarın. Taze yapılmış 4 ° C diseksiyon tamponunda omurilik dokusu durulayın ve1 cm'lik bölümler halinde enine kesilmiş.
- Diseksiyon kapsamı yardımıyla, her doku kesimi için doku forseps, ince forseps ve microscissors kullanarak gri maddenin en örten meninksler, beyaz cevher tüketim ve. Soğuk insan diseksiyon tampon içeren 10 cm'lik bir steril Petri kabı içine ependima ve çevresindeki gri madde küçük bir miktar içerir parçalara periventriküler doku, havuz.
4. İzolasyon ve Kültürleme Yetişkin Rat ve İnsan Omurilik NSPCs arasında
- Laminer akış kaputu aseptik aşağıdaki adımları uygulayın.
- Microscissors 1 mm 3 parçaya disseke sıçan ya da insan periventriküler doku kıyma.
- Enzimatik malzemeler / reaktiflerin tabloda gösterildiği gibi papain ayrışma kiti kullanılarak proteolitik enzimlerle kıyılmış doku ayırmak. Not: Reaktif bileşenler 4 flakon içerir; Flakon 1: Earle Dengeli Tuz Çözeltisi (EBSS) Flakon 2: Papain containing L-sistein ve EDTA, Flakon 3: Deoksiribonükleaz I (DNase) Flakon 4: Sığır serum albümini (BSA) ile ovomukoid proteaz inhibitörü.
Not: Not: Papain protein yüzeyler için geniş özgüllüğe sahip bir sülfhidril proteazdır. papain Burada Carica papaya bitkisinden elde edilen lateks ve çok protein alt tabakaları daha kapsamlı daha pankreas proteazlar parçalayan bir. Ayrışma işlemi sırasında viskozitesini arttırır ve zor bir pipetleme yapacak ayrışma ortamı içinde serbest bazı hücre hasarının neden DNA bulunmaktadır. Bu nedenle, DNaz sağlam hücrelere zarar vermeden DNA sindirimi hücre izolasyon prosedürü dahil edilir. Ovomukaidler ayrışma aşamasından sonra papain aktivitesini inhibe etmek için kullanılan proteaz inhibitörleri glikoprotein edilir.
- İlk kullanımda, EBSS'ye (şişe 1) 32 ml 'si ile, albümin ovomukoid inhibitörü karışımı (şişe 4) tekrar oluşturmak ve daha sonra 4 ° C de saklamak ve daha sonra izolasyonların için kullanımı.Not: Bu ovomukoid inhibitörü 10 mg, ml başına albümin 10 mg etkin bir konsantrasyonda bir çözelti elde edilir.
- 0.5 mM EDTA, 1 mM L-sistein papain / ml 20 birim bir çözelti elde edildi, Papain şişe (şişe 2) ila EBSS'ye (şişe 1) 5 ml ilave edilir. Papain tam enzimin tam aktivite sağlamak için eritilir gelinceye kadar on dakika için 37 ° C su banyosu içinde şişe yerleştirin tamamen çözündüğünde papain çözelti berrak görünen kontrol edin.
- (3 şişe), bir DNase flakon EBSS'ye (flakon 1) 500 ul ekleyin ve DNaz denatürasyonunu kesme duyarlı olarak hafifçe karıştırın. Yaklaşık 20 birim / ml papain ve% 0.005 DNase bir nihai konsantrasyonu elde papain ihtiva eden şişeye DNaz çözeltisi 250 ul ekle. Daha sonra kullanmak üzere DNaz flakonun dengesini kaydedin.
- Yukarıda adım 4.4 gibi hazırlanan papain çözeltisi içinde kıyılmış sıçan veya insan dokusu yerleştirin. Insan dokusu izolasyonu için, ikisi arasında eşit olarak kıyılmış doku bölmekpapain küçük şişeler (yaklaşık 0.2 g / şişe).
- Aktif papain çözeltisi içinde doku ayırmak ve bir rocker platformunda sabit bir ajitasyon ile 37 ° C'de inkübe edilir. 0.4 gr, sırasıyla - yaklaşık 0.2 kıyılmış doku miktarına bağlı olarak 1-2 st için 45 1 saat dakikadır ve insan doku için, sıçan dokusu inkübe edin.
- Bulanık bir hücre süspansiyonu elde etmek üzere geri kalan doku parçaları ayırmak için 10 ml'lik bir pipet ile karışım toz haline getirin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'de bir steril 15 ml konik tüp ve santrifüj içine hücre süspansiyonu (çözünmemiş dokusunun herhangi parçaları dahil değildir) aktarın.
- Orta içeren ovomukoid bir papain inhibitörü pelet hücreleri tekrar süspansiyon.
- 15 ml konik bir tüp içinde yeniden albümin ovomukoid inhibitör çözeltisi (şişe 4) 300 | il 2.7 mi EBSS (şişe 1) karıştırılarak ovomukoid çözeltisi hazırlayın. Yukarıdaki adım 4.4 olarak kaydedildi (3 şişe) DNaz çözeltisi 150 ul ekleyin.
- Süpernatant atıntanelenmiş hücreler hemen seyreltildi DNaz albümin inhibitör karışımı içinde hücre pelletini.
- Tek bir adım kesintili yoğunluk gradyan boyunca santrifüj hücre zarlarından ayrı sağlam hücreler.
- En yavaşça, 15 ml bir tüp (4 şişe), albümin-inhibitör çözeltisi 5 ml eklenmesi ve 5 ml'lik bir pipet kullanılarak, aralıklı yoğunluk gradyan hazırlamak ve yavaş hücre süspansiyonu tabaka (adım 4.8 olarak yukarıda tarif edildiği gibi hazırlanmıştır), albümin inhibitör çözeltisi.
- Oda sıcaklığında 6 dakika için 70 x g'de santrifüjleyin.
- Not: Bu sınır en az bir karıştırma sonucu etkilemeyecektir gradyanın iki tabaka arasındaki ara yüz, açıkça görülmelidir. Membran fragmanları, ara yüzeyde kalır ve ayrışmış hücrelerinin, tüpün alt pelet.
- Fare hücreleri için, süpernatan atılır ve sıçan EFH ortamı, 1 ml hücre pelletini (37 ° C'de önceden ısıtılmış).Bir haemositometre ile canlı hücre yoğunluğunu sayın ve EFH bölgesindeki / ul 10 hücre yoğunluğunda bir T25 kültür şişesi içine hücreleri plaka. Sıçan dokudan hücrelerin tipik verim / ml den az 10 hücre yoğunluğunda arzu edilir yaklaşık% 80 viability.If klonal kültürleri, tohum hücreleri ile yaklaşık 2 x 10 6 hücre olup. % 5 CO2 içinde 37 ° C'de şişeler inkübe ve 1 hafta kürelerin bir araya toplanmasının engellenmesi için kültürler rahatsız büyümeye izin verir.
- İnsan hücreleri için, süpernatan atılır ve insan EFH ortamı 10 ml hücre pelletini (37 ° C'de önceden ısıtılmış). 40 mikron naylon hücre süzgecinden hücre süspansiyonu filtre miyelin ve hücre zarı parçalarını almak için EFH 30 ml izledi. 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ve EFH ortamı, 1 ml hücre pelletini.
- Bir haemositometre ile canlı hücre yoğunluğunu sayın ve toplam hacim içinde / oyuk 10 5 hücre yoğunluğunda 6 oyuklu kültür plakaları, insan hücreleri plaka5 ml EFH / oyuk. İnsan dokusundan gelen hücrelerin tipik bir verimi, yaklaşık% 70 canlılık ile yaklaşık 1 x 10 6 hücre olup. Böyle Matrigel gibi yapışık alt tabaka ile Ön-ceket kuyuları (aşağıya Not bakınız). 1 mi SFM: 40 ul Matrigel bir oranda seyreltilir.
- Not: Alternatif olarak, poli-D-lisin / laminin, fibronektin ya da kollajen gibi diğer yapışık alt tabakalar kullanılabilir.
- % 5 CO2 içinde 37 ° C'de inkübe edin ve kültürler 1 hafta için rahatsız büyümeye izin verir.
Yetişkin sıçan ve insan omurilik NSPCs 5. Pasajlanması
- Sıçan NSPCs küçük neurospheres ilk tohumlama 1 hafta içinde çapı yaklaşık 70 mikron oluşturacaktır; , hücre süspansiyonu toplamak 5 dakika boyunca 300 xg'de santrifüj ve mekanik neurospheres ayırmak için hücre pelet öğütülerek haftalık geçiş sıçan NSPCs.
- Taze sıçan EFH ortamı içeren T25 şişeler içine ayrışmış hücreleri Tohum. Seçenek olarak ise,Pasajlanması% 50 şartına sıçan orta kullanın. Pasajlanması de sıçan NSPCs tipik verim geçişi numarası ile katlanarak artar yaklaşık 5 x 10 6 hücre olduğunu.
- İnsan kültürler, bir hafta sonra ilk kaplama, hücreler, alt-tabakaya yapışma sağlamak için haftada iki kez, taze EFH kültür ortamının yarısı değiştirin. Genel olarak, 1-2 hafta sonra hücreler, alt-tabakaya bağlanmış olan, bir kez taze EFH ile haftada iki kez kültür ortamının tüm hacmi değiştirin.
- - 8 hafta 4 ila izdiham ulaşmadan Alt kültür hücreleri.
- De 37 ° C 'de yaklaşık olarak 10 dakika süre ile inkübe başına enzimatik substrat hücreleri ayırarak Alt kültür hücreleri, enzim 2 ml (Malzeme Tablo). 5 dakika boyunca 300 x g'de hücre süspansiyonu, santrifüj toplamak ve yavaşça taze yapılmış EFH ortamı, 1 ml hücre pelletini.
- Bir haemositometre ile canlı hücre sayımı ve 6 oyuklu kültür plakaları içine hücreleri plaka (ön-koYukarıdaki adım 4.12), 10 5 hücre yoğunluğunda / kuyuda / oyuk 5 mi EFH bir toplam hacimde konsantre edilir. Pasajlanması insan NSPCs tipik verim yaklaşık 2 x 10 6 hücre ve genellikle bu pasajda ile iki katına çıkacak. Pasajlanması arasında haftada 3 kez - Genellikle% 50 şartına EFH orta 2 kültürleri korumak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
EFH ortam içinde süspansiyon kültürü içinde çoğaltıldığında Yetişkin sıçan omurilik hücreleri ilk kaplama 1 hafta içinde, küçük neurospheres (farklılaşmamış hücrelerin koloni) oluşturacaktır. Birincil kültürde kaplama, hücrelerin en ölür ve büyüme faktöre cevap veren bir kök hücreleri çoğalır ve EFH ortamında seçilir. Geçit 3 ile, bir çok serbest yüzen neurospheres yaklaşık 100 mikron çapında (Şekil 2A) 'de olacaktır. Neurospheres yuvarlak ve faz parlak, yüksek büyütme altında, sil gibi microspikes Hücre artığının aynlmasının (Şekil 2B) kümeleri farklı neurospheres karakteristiği olan kürelerin dış hücrelerden çıkıntı görülür. Sıçan dokudan hücrelerin tipik bir verimi, yaklaşık% 80 canlılık ile yaklaşık 2 x 10 6 hücre olup. Neurospheres hücre kümelerinin toplanmasını önlemek için çok yüksek bir yoğunlukta tohumlanmıştır olmamalıdır. Ayrıca, büyük neurospheres ayırmak zorlaşır ve hücreler olacakKürenin merkezinde nekrotik. Kültürler Pasajlanması önce çok uzun süre bırakılırsa bu da ortaya çıkar. EFH kültüründe yetişkin fare omurilik NSPCs (Şekil 2C) çoğalmakta ve ön-madde hücreleri için Nestin (Şekil 2B), bir işaretleyici ifade ve olgun nöral belirteçlerin düşük seviyelerde (veriler gösterilmemiştir).
Yetişkin insan omurilik NSPC kültürleri fare NSPC kültürleri gibi hızlı bir şekilde büyümez. Insan omurilik hücreleri başlangıçta süspansiyon içinde kültürlenir, bunlar agrega ve döküntü (Şekil 3A) ile bir araya hücrelerin az sayıda düzensiz kümeleri oluşturacaktır. Bu kültürlerin sonradan Pasajlanması NSPC nüfusunun zenginleşmesini teşvik etmez. İnsan hücreleri yapışık bir tek tabaka EFH içinde plakalanır Ancak, büyüme faktörü-duyarlı NSPCs alt-tabaka (Şekil 3B) ve daha sonra ortam değiştirme uygun miyelin ve hücre artıkları (Şekil 3C) kaldırır. c tipik verimİnsan dokusundan arşın yaklaşık% 70 canlılığı yaklaşık 1 x 10 6 hücre olup. İnsan NSPC kültürleri de bir yapışık tek tabaka olarak kurulan hale zaman NSPCs sonra da serbest yüzen neurospheres oluşturmak için süspansiyon kültürlerinde kaplama yapılabilir. EFH kültüründe, yetişkinler için insan omurilik NSPCs (Şekil 3D), çoğalmak ve Nestin (Şekil 3E) ve Sox2 (Şekil 3F) ifade gösterilen bir transkripsiyon faktörü nöral kök hücre ve olgun nöral belirteçleri çok düşük seviyelerde (veriler ile ifade edilmesi gösterilmemiş).
Sıçan omurilik ve periventriküler bölgede diseksiyon 1. laminektomi Şekil. (A) omuriliğin açık kuyruk sonunda, rongeurs spinal kanalın lateral içine ekstradural yerleştirilir. (B) Küçük kesikler, her si üzerindeki tabakanın içine yapılıromurların ve lamina de dikkatle omurilik maruz uzağa soyulur. (C) laminektomi sonrası açığa servikal spinal kord. torakal vertebra kesitli (D) şematik omurilik ve laminektomi yapılan kesimler yerini gösteren (tasvir ) kırmızı noktalı çizgiler ile. laminalar ve spinöz proses (gölgeli bölge) çıkarılır. (E) omurilik 1 cm kesimleri içine enine kesilir. (F) örten zarları, beyaz cevher ve gri madde çoğu dikkatlice microscissors kullanarak çıkarılır. (G ) Kıyılmış periventriküler doku. (disseke periventriküler bölge gösteren noktalı anahat ile luxol hızlı mavi hemotoksilen ve eozin ile boyandı sıçan omurilik H) enine kesit. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Fare omurilik NSPCs serbest bir süspansiyon kültürü içinde yetiştirilen Şekil 2. Yetişkin fare omurilik NSPCs. (A), geçit 3 ile, bir çok neurospheres görülür. (B) Neurospheres faz parlak ve neurospheres çıkıntı yapan microspikes (oklar ) yüksek büyütme belirgindir. (C) ayrışmış neurospheres (geçit 3 gün 4), EFH ortamında Matrigel kaplı kuyulara üzerine kaplama sabit ve boyanmış ve çekirdekleri (mavi) görselleştirmek için Hoechst ile zıt olan. (Ki67 immün ile gösterildiği gibi) ve (D) öncelikle ekspres Nestin. EFH koşullarda, yetişkin sıçan omurilik NSPCs çoğalırlar bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
fo: keep-together.within-page = "always"> 
Şekil 3. Yetişkin insan omurilik NSPCs. (A) başlangıçta kültür şişelerinde kaplama, yetişkin insan omurilik NSPCs iyi büyümek değil. Hücre ve döküntü göster agrega (13 gün sonra kaplama) EFH ortam içinde Birincil serbest yüzen kültürler. (B) Buna karşılık, EFH birincil yapışkan kültürler, NSPCs sonrasında 17 gün sonra gösterilen, Matrigel alt-tabaka (oklar) eklenmiş 26 gün içinde ((in vitro 26 gün gösterilmektedir) Ki67 immün ile gösterildiği gibi, in vitro olarak 41 gün sonra kaplama, ve (C). (D) EFH ortamı olarak, yetişkin insan omurilik NSPCs, çoğalırlar ve esas olarak ekspres (E) Nestin vitro), in vitro olarak 66 gün gösterilir () ve (F) Sox2. Çekirdekler Hoechst (mavi) ile zıt olan./ftp_upload/52732/52732fig3large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sıçan omurilik dokusu bakım diseksiyonu sırasında laminektomi yaparken omurilik zarar vermemek için dikkat edilmelidir. Bu omurilik segmentleri sağlam olduğunda periventriküler doku izole etmek daha kolaydır. Doku parçaları tam olarak tahlil tamponuna daldırılmalıdır ve örten zarları ve beyaz madde microscissors boyuna şeritler gibi kesilebilir. Alternatif olarak, ince doku forseps uzakta beyaz cevher soymak için kullanılabilir.
NSPCs için izolasyon prosedürü için, sıçan ve insan omurilik dokusu ayırmak mekanik toz haline getirildikten ile birlikte papain-EDTA ayrışma yöntemi kullanılır. Daha önce doğum sonrası sıçan kortikal nöronların 11 ayrışması ile gösterildiği gibi, diğer proteazlar ile karşılaştırıldığında, papain, daha az zararlı ama etkilidir. Biz sık sık fetal doku ile birlikte kullanıldığında sadece mekanik öğütüldükten o ayrışma, yetişkin doku gibi etkili değildir bulundu. Th sonrae enzimatik ayrılma, mekanik öğütme kalan doku parçaları kırmak için önemlidir. Bulanık bir hücre süspansiyonu elde edilen herhangi bir geri kalan sağlam doku parçaları vardır, böylece bir pipet ile tekrar hücre dispersiyonu ile toz haline getirilmesi, yapılmalıdır. Bununla birlikte, toz haline getirme, hücre süspansiyonu ve elde edilen hücre ölümünün kabarcık oluşumunu önlemek için çok güçlü bir performans olmamalıdır.
Başlangıçta tarif edildiği gibi 2 geçirilmesi için, sıçan neurospheres mekanik ezilerek tek bir hücre süspansiyonu içine ayrışmış. Bununla birlikte, Neurospheres ayrıca örneğin hücre yüzeyi reseptörleri zarar verebilir veya sürece enzimatik maruz 12 kısa olduğu gibi küre oluşumuna engel olmaz tripsin-EDTA gibi enzimatik yöntemler kullanılarak ayrılabilirler.
Kültür NSPCs için neurosphere tahlili kullanılarak olarak bir çok avantaj vardır. Nispeten basit, tekrarlanabilir ve nöral kök cel hızlı büyümenin sağlarls 2,12. Bununla birlikte, esas olarak daha kısıtlı Neurospheres kök hücrelerin sadece az sayıda projenitör hücrelerin meydana heterojendir. Bu tür hücre yoğunluğu ve pasajlama tekniği gibi çeşitli faktörler kültürler fenotipini etkileyebilir ve neurospheres de projenitör hücrelerin 13 arasında meydana gelebilir. Neurospheres son derece hareketli ve daha düşük hücre yoğunluğunda 14 koşulları altında kaynaştırılabilmektedir. Bu nedenle, kültür neurospheres sayısı kök hücrelerin sayısını temsil etmez. Progenitör hücrelerden sinir kök hücreleri ayırt etmek için, bir hücre deneyi 15,16 oluşturan nöral-koloni kullanmalısınız.
Yetişkin sıçan spinal kord NSPCs EFH süspansiyon kültüründe neurospheres orta takviye yanı büyür ve kolayca genişletilebilir. Bunun aksine, erişkin insan omurilik NSPCs yapışık bir tek tabaka 10 daha iyi büyümesi bulmuşlardır. İnsan beyin kaynaklı nöral kök hücreler tek tabaka kült uzun vadeli sağlanabileceğineçoğalma kapasitesi 17,18 teşvik mitojenlerin mevcudiyetinde bir kimyasal olarak tanımlanmış ortam içinde ure. Bu protokolde tarif edildiği gibi, NSPCs organ nakli vericilerden yetişkin insan omurilik izole edilmiş ve geçirildi ve yapışkan bir EGF, bFGF mevcudiyetinde tek tabakalı ve heparin 10 olarak genişletilebilir. Hücreler daha hızlı genişletmek olarak NSPCs hala 60 yıl 10 bizim maksimum yaşına kadar donörlerden izole edilebilir olsa da, yaşlı vericilerden daha genç dan NSPCs izole etmek kolaydır. Biz Matrigel, fibronektin, kolajen tip I ve poli-D-lisin / laminin gibi yapışkan çeşitli substratlar incelenmiş ve yetişkin insan omurilik yapışması NSPCs 10 etkili olduğu bu bulduk. Başlangıçta neurosphere ve yapışık kültürler hem hücresel agrega, enkaz ve ölü hücreleri içerir. Ancak bu enkaz giderek alt kültür ve çoğalan NSPCs faktör zenginleştirilmiş neurobasal orta seçer büyüme ile çıkarılır. Ayrıca enkaz ve miyelin kirlenme dikkatli diseksiyon ve omurilik dokusu segmentlerden beyaz cevher çıkarılması ile azaltılabilir. Ayrıca miyelin kaldırır önce kaplama bir süzgeç vasıtasıyla sonuçtaki hücre süspansiyonu Filtreleme.
Başka kültürlerde var karyotipik anormallikleri riski artar, ancak biz, yaklaşık 10 pasajlar içeren en az 9 ay boyunca yapışık tek katmanlar olarak kültür yetişkin insan omurilik NSPCs sahiptir. Biz 4 ay boyunca kültürlenmiş insan NSPCs ilgili karyotipik analizi yapıldı ve kromozomal anomaliler ile normal diploid karyotipine bulundu (veriler gösterilmemiştir). Biz de hücre çoğalması ve oligodendrositlerde içine ayırt etmek için kapasite kültüründe artan zamanla azaldığı bulunmuştur. Örneğin, O4 pozitif hücrelerin göreceli yüzdesi kültüründe 10 4 ayda% 0.01 kültüründe 1 ayda% 1.3 düşmüştür. Sıçan ve insan NSPCs hem standart dondurma tanıştı kullanarak dondurulması için uygun olanmetotların ve fenotipik profilinde önemli farklılıklar göstermektedir.
Kültür multipotent NSPCs izolasyonu ve genleşme yetişkin nöral kök hücre farklılaşması üzerinde çeşitli faktörlerin incelenmesi de dahil olmak üzere bir çok in vitro uygulamalar için izin verir. NSPCs artan sayıda in vitro üretilen ve spinal kord yaralanması, inme, ve in vivo olarak, bu nöral kök hücre onarım tepkisini incelemek için nörodejeneratif hastalık gibi hayvan modellerinde transplante edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | Life Technologies | #10010023 | Dissection buffer |
| 1x HBSS | Life Technologies | #14175095 | Dissection buffer |
| D-glucose | Sigma | # G-6152 | Prepare 30% glucose stock solution for dissection buffer and hormone mix |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | #15140-148 | Dissection buffer and culture medium |
| Neurobasal-A | Life Technologies | #10888-022 | Culture medium |
| L-glutamine, 200 mM | Life Technologies | #25030-081 | Culture medium |
| B27 | Life Technologies | #12587010 | Culture medium |
| DMEM | Life Technologies | #11885084 | Hormone mix |
| F12 | Life Technologies | #21700-075 | Hormone mix |
| NaHCO3 | Sigma | # S-5761 | Prepare 7.5% NaHCO3 stock solution for hormone mix |
| HEPES | Sigma | #H9136 | Prepare 1M HEPES stock solution for hormone mix |
| Insulin | Sigma | #I-5500 | Hormone mix |
| Apo-transferrin | Sigma | #T-2252 | Hormone mix |
| Putrescine | Sigma | # P7505 | Hormone mix |
| Selenium | Sigma | #S-9133 | Hormone mix |
| Progesterone | Sigma | #P-6149 | Hormone mix |
| EGF, mouse | Sigma | #E4127 | Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium |
| EGF, human recombinant | Sigma | #E9644 | Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium |
| bFGF, human recombinant | Sigma | #F0291 | Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium |
| Heparin, 10,000 U | Sigma | #H3149 | Prepare 27.3 mg/ml stocks in hormone mix and aliquot; EFH medium |
| Papain dissociation kit | Worthington Biochemicals | #LK003150 | Contains EBSS, papain, DNase, ovomucoid protease inhibitor with BSA |
| Sodium Pentobarbital | Bimeda – MTC Animal Health Inc | DIN 00141704 | |
| Tissue Forceps: Addisons | Fine Science Tools | #11006-12 | Serrated standard tip; micro-tip also available |
| Fine Forceps: Dumont #4 | Fine Science Tools | #11241-30 | |
| Microscissors | Fine Science Tools | #15024-10 | Round-handled Vannas |
| Rongeurs | Bausch & Lomb | N1430 | |
| 10 mm Petri dishes | Nunc | 1501 | |
| T25 Culture flasks | Nunc | 156367 | |
| 40 μm nylon cell strainer | VWR | CA21008-949 | |
| 6 well plates | Nunc | CA73520-906 | |
| Matrigel, growth factor reduced (100x) | Corning | 354230 | Thaw according to directions and freeze aliquots; use diluted at a ratio of 40 μl Matrigel: 1 ml SFM |
References
- Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287, 1433-1438 (2000).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Gritti, A., et al. Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. J Neurosci. 16, 1091-1100 (1996).
- Morshead, C. M., et al. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
- Weiss, S., et al. Multipotent CNS stem cells are present in the adult mammalian spinal cord and ventricular neuroaxis. J Neurosci. 16, 7599-7609 (1996).
- Martens, D. J., Seaberg, R. M., van der Kooy, D. In vivo infusions of exogenous growth factors into the fourth ventricle of the adult mouse brain increase the proliferation of neural progenitors around the fourth ventricle and the central canal of the spinal cord. Eur J Neurosci. 16, 1045-1057 (2002).
- Kulbatski, I., et al. Oligodendrocytes and radial glia derived from adult rat spinal cord progenitors: morphological and immunocytochemical characterization. J Histochem Cytochem. 55, 209-222 (2007).
- Akesson, E., et al. Long-term culture and neuronal survival after intraspinal transplantation of human spinal cord-derived neurospheres. Physiol Behav. 92, 60-66 (2007).
- Dromard, C., et al. Adult human spinal cord harbors neural precursor cells that generate neurons and glial cells in vitro. J Neurosci Res. 86, 1916-1926 (2008).
- Mothe, A. J., Zahir, T., Santaguida, C., Cook, D., Tator, C. H. Neural stem/progenitor cells from the adult human spinal cord are multipotent and self-renewing and differentiate after transplantation. PLoS One. 6, e27079 (2011).
- Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. J Neurosci. 6, 3044-3060 (1986).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. , (2010).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nat Methods. 3, 801-806 (2006).
- Louis, S. A., Azari, H., Sharififar, S., Vedam-Mai, V., Reynolds, B. A. Neural-colony forming cell assay: an assay to discriminate bona fide neural stem cells from neural progenitor cells. J Vis Exp. , (2011).
- Louis, S. A., et al. Enumeration of neural stem and progenitor cells in the neural colony-forming cell assay. Stem Cells. 26, 988-996 (2008).
- Conti, L., et al. Niche-independent symmetrical self-renewal of a mammalian tissue stem cell. PLoS Biol. 3, e10 (2005).
- Pollard, S. M., Conti, L., Sun, Y., Goffredo, D., Smith, A. Adherent neural stem (NS) cells from fetal and adult forebrain. Cereb Cortex. 16, Suppl 1. i112-i120 (2006).
