Abstract
Voksen rotte og menneske ryggmarg nevrale stilk / stamceller (NSPCs) dyrket i vekstfaktor-beriket medium muliggjør spredning av multipotent, selvfornyende og utvid nevrale stamceller. I serum forhold, vil disse multipotente NSPCs differensiere, genererer nevroner, astrocytter og oligodendrocytter. Den høstet vev er enzymatisk dissosiert i et papain-EDTA-oppløsning og deretter mekanisk dissosiert og separeres gjennom en diskontinuerlig densitetsgradient for å gi en enkeltcelle-suspensjon som er belagt i Neurobasal medium supplert med epidermal vekstfaktor (EGF), basisk fibroblast vekstfaktor (bFGF ), og heparin. Voksen rotte ryggmargs NSPCs dyrkes som frittflytende neurosfærer og voksen menneskeryggmargs NSPCs dyrkes som tilhenger kulturer. Under disse forholdene, voksne ryggmargs NSPCs spre seg, uttrykke markører for forløperceller, og kan kontinuerlig utvides ved passering. Disse cellene kan be studert in vitro i respons til forskjellige stimuli, og eksogene faktorer kan anvendes for å fremme avstamning begrensning for å undersøke neurale stamcelledifferensiering. Multipotent NSPCs eller deres avkom kan også bli transplantert inn i ulike dyremodeller for å vurdere regenerativ reparasjon.
Introduction
NSPCs er multipotente celler forpliktet til nevrale avstamning som kan selv fornye og lett utvide in vitro. Vi viser til disse cellene som en blandet befolkning av nevrale stilk / stamceller siden de vise egenskaper av selvfornyende multipotente stamceller og mer begrenset stamfedre. NSPCs finnes i både fosterets og voksen hjerne og ryggmarg 1,2. I voksen, NSPCs er normalt sovende og ligge innenfor bestemte nisjer inkludert subventricular sonen fôr sideventriklene 2-4, og periventricular regionen rundt sentralkanalen i ryggmargen 5,6.
Vanligvis NSPCs dyrkes som frittflytende neurosfærer eller som tilhenger monolag i serumfritt medium supplert med EGF og bFGF, mitogener som selekterer for stammen / stamcellepopulasjoner. Neurosfærene analysen opprinnelig utviklet av Reynolds og Weiss 2, er mest brukt til kultur ogutvide nevrale stamceller. NSPCs viser multipotency når de er belagt i vekstfaktor-fritt medium inneholdende serum, å differensiere til neuroner, astrocytter og oligodendrocytter. Multipotent, kan selvfornyende NSPCs isoleres og dyrkes fra den voksne gnager ryggmargen når dyrkede vevet omfatter områder av sentralkanalen 6,7. En potensiell fordel i å bruke NSPCs generert fra den voksne ryggmargen i motsetning til å generere celler fra andre regioner er at disse vevsspesifikke celler ligne celler i ryggmargen som er tapt eller skadet etter skade eller sykdom tettest.
Tidligere arbeid har vist at neurosfærer avledet fra den humane ryggmargen ikke kunne forplante seg langvarig eller passert for å generere tilstrekkelig antall celler 8,9. Men med modifikasjoner i dyrkningsforhold, rapporterte vi utvidelse og transplantasjon av voksne mennesker ryggmargs-avledet NSPCs, viser at selvfornyendeog multipotente NSPCs kan isoleres fra voksent menneske ryggmargen av organtransplanterte givere 10. Primært, fjerning av det meste av hvit substans under disseksjonen og dyrkning av disse cellene på en adherent substrat i vekstfaktor-anriket medium valgt for prolifererende voksent menneske ryggmarg NSPCs. I denne protokollen beskriver vi høsting av ryggmargen fra voksen rotte og fra menneskelige organtransplanterte givere, disseksjon av periventricular vev, og isolasjon, kultur og utvidelse av NSPCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr prosedyrer godkjent av Animal Care komité for University Health Network, Toronto ON Canada, i samsvar med retningslinjer fastsatt i Guide til omsorg og bruk av forsøksdyr utarbeidet av den kanadiske Council on Animal Care. For innhøsting av menneskelig ryggmargen vev, ble godkjenning hentet fra University Health Network forskningsetikk styret og fra Trillium-Gift of Life Foundation som overvåker organdonasjon i Ontario, Canada.
1. Utarbeidelse av Dissection buffere og Kultur Media
- For isolering av rotte ryggmarg, fremstille 100 ml disseksjon buffer (1 x PBS + 0,6% glukose + 2% penicillin-streptomycin) og avkjøl. For menneske ryggmarg forberede 100 ml disseksjon buffer (1x HBSS + 0,6% glukose + 2% penicillin-streptomycin) og avkjøl.
- Forbered 100 ml serum-free medium (SFM) og varm ved 37 ° C. For å forberede SFM, tilsett 2 mM L-glutamin, 100 ug / ml penicillin-streptomycin, 2% B27, og 10% hormonblanding til Neurobasal-A-medium. For å fremstille hormonblanding, lage en 1: 1 DMEM / F12 medium inneholdende 0,6% glukose, 3 mM NaHCO3, 5 mM HEPES, 25 ug / ml insulin, 100 pg / ml apo-transferrin, 10 pM putrescin, 30 nM selen, og 20 nM progesteron.
- Klargjør EFH vekstfaktor-beriket plating media (til SFM legge til 20 ng / ml EGF, 20 ng / ml bFGF, og 2 mikrogram / ml heparin) og varm ved 37 ° C. Sikre at menneskelig EFH inneholder humane rekombinante vekstfaktorer (se tabell for material).
2. Høsting og Dissection of Adult Rat periventricular Spinal Cord Tissue
- Sterilisere dissekere instrumenter i etanol og skyll i sterilt saltvann, eller autoklav instrumenter på forhånd. Gi rat (6 - 8 uker gamle) en dødelig injeksjon av natriumpentobarbital (1 cc ved 65 mg / ml) eller overdose av bedøvelse (dvs. 4% isofluorane) i henhold til en institusjon godkjente dyr protokollen. DOuse baksiden av rotte med 70% etanol og fjerne huden på den dorsale overflaten med store disseksjon saks.
- Å holde saksen vinkelrett på ryggflaten, på tvers kutte virvelsøylen ovenfor bakbena. Bruk mindre saks til langs kutte ryggmuskelen liggende i en rostralt retning virvelsøylen for å avsløre spinous prosesser.
- Starter på den eksponerte caudal slutten, setter Rongeurs eller en liten stump bone-cutting instrument extradurally inn i side aspekt av spinalkanalen i rommet mellom ryggmargen og ryggsøylen. Lag små kutt i lamina (benete buene til venstre og høyre for spinous prosesser på hver side av ryggvirvlene) og nøye skrelle bort lamina å eksponere ryggmargen (figur 1A-D). Sørg for at vinkelen på bladene er grunt og parallelt med ledningen så den underliggende ryggmargen ikke er skadet.
- Fortsett laminectomy i rostral retning expose thorax og cervical ryggmargen.
- Forsiktig eksisere ryggmargen fra ryggsøylen med butt vev tang og bruke microscissors å nøye kutte røttene å slippe ledningen. Plasser det utskårede ryggmarg i en petriskål inneholdende 4 ° C steril rat disseksjon buffer (beskrevet ovenfor i 1.1). Skyll vevet i nyfremstilt 4 ° C dissekere buffer og ved hjelp av saks skjæres ryggmargen på tvers i 1 cm segmenter (figur 1E).
- For hvert segment av vev, bruk en hånd å holde vevet med fine tang. Med den andre hånden, bruker microscissors å forsiktig fjerne de overliggende hjernehinnene, hvit substans, og det meste av grå materie ved hjelp av en dissekere omfang. Alternativt kan du bruke fine tang (Dumont # 4) å skrelle bort det meste av grå og hvit substans, slik at bare periventricular regionen i ryggmargen som inkluderer ependyma og en liten mengde rundt grå substans (figur 1F-H).
- Pool dissekert periventricular vevet inn i en 10 cm sterile petriskål med kaldt rotte disseksjon buffer.
3. Høsting og Dissection of voksent menneske periventricular Spinal Cord Tissue
Merk: Human ryggmargen vev er høstet fra voksne organtransplanterte givere (givere varierte i alder 2-60 år) etter at de andre organer er fjernet for organtransplantasjon. Trillium-Gift of Life Program innhenter samtykke til fjerning av vev for forskningsformål fra pasientens familie og varsler vår høsting team i tide slik at vi har kunnet høste ledningene innen 2 timer med aortic kryssklem. Mannlige og kvinnelige voksne givere med negativ serologi og ingen infeksjoner er akseptert.
- Innhøsting vev i et sterilt mote i operasjonssalen gjennom en anterior tilnærming ved hjelp av samme anterior eksponering allerede dissekert for orgel fjerning av orgelet transplant høsting team.
- Utsett anterior ryggsøylen gjennom tilbaketrekking med store rib spredere og store padle Saker av de gjenværende vev og organer, inkludert de store blodårene.
- Bruk en sternal sag montert med en lang kniv for å skjære gjennom mellomvirvelskiver på rostral og caudal ender av ønsket lengde på virvelsøylen skal resected. Vinkel sagen ca 45 ° medialt å kutte en trekantet trau fra den laterale delen av ryggvirvel organer stopper bare kort av spinalkanalen.
- Fjern en bloc de mediale aspekter av ryggvirvel organer de ønskede segmenter med hjelp av buede osteotomes og klubbe ta vare for å unngå å skjære gjennom dura. Deretter løfter forsiktig dura dekket ryggmargen med tann pinsett og kraftig innsnittet rostral og caudal endene av ledningen. Bruk lange saks og pinsett til bilateralt transekt de enkelte røtter.
- Plasser skåret segment av ryggmargen i 4 °; C steril buffer (1 x HBSS + 0,6% glukose + 2% penicillin-streptomycin) i et stort reagensrør for transport til vevskultur rommet.
- Merk: Vanligvis 3 - 6 cm segment av ryggmargen fra øvre thorax og / eller midt-til-lavt nivå thorax fjernes i operasjonsrommet under sterile betingelser så snart som mulig etter opphør av sirkulasjon og plassert i kald steril buffer . Den tid som har gått mellom opphør av sirkulasjon og fjerning av ryggmargen varierer med tiden som kreves for å høste de målrettede organer for donasjon og har variert fra 45 min til 2 timer. Dersom hjertet og lungene har også blitt fjernet, kan disseksjon tas langt rostrally å høste en del av den nedre cervical ledningen også.
- Dissekere den menneskelige ryggmargen vev så snart som mulig etter høsting, vanligvis i løpet av 3 timer. Fjern dura og andre hjernehinnene med pinsett. Skyll ryggmargen vev i ferske 4 ° C disseksjon buffer ogkuttet på tvers i 1 cm segmenter.
- Ved hjelp av en dissekere omfang, skjære de overliggende hjernehinnene, hvit substans, og det meste av grå materie ved hjelp av vev tang, fin pinsett og microscissors for hvert vev segment. Pool dissekert periventricular vev, som inkluderer ependyma og en liten mengde rundt grå materie, i en 10 cm sterile petriskål med kaldt menneske disseksjon buffer.
4. Isolering og dyrking av Adult Rat og menneske ryggmarg NSPCs
- Utfør følgende trinn aseptisk i en laminær hette.
- Finhakk dissekert rotte eller menneskelig periventricular vevet inn en mm 3 stykker med microscissors.
- Enzymatisk distansere den hakket vev med proteolytiske enzymer ved hjelp av papain dissosiasjon kit som vist i tabellen over materialer / reagenser. Merk: Reagent komponenter består av 4 ampuller; Vial 1: Earle balanserte saltoppløsning (EBSS), Vial 2: Papain som ing L-cystein og EDTA, Vial 3: deoksyribonuklease I (DNase), Vial 4: Ovomucoid proteaseinhibitor med bovint serumalbumin (BSA).
Merk: Merk: Papain er et sulfhydryl protease som har bred spesifisitet for proteinsubstrater. Den papain her er hentet fra latex fra Carica papaya anlegg og forringer fleste proteinsubstrater i større grad enn i bukspyttkjertelen proteaser. Under dissosiasjon prosessen er det noen celleskade som forårsaker DNA som skal slippes ut i dissosiasjonen medium som vil øke viskositeten og gjøre pipettering vanskelig. Dermed er DNase med i cellen isoleringsprosedyren til å fordøye DNA uten å skade de intakte celler. Ovomucoids er glykoprotein proteasehemmere som brukes for å hemme papain aktivitet etter dissosiasjon trinn.
- Ved første gangs bruk, rekonstituere albumin ovomucoid inhibitor blanding (hetteglass 4) med 32 ml EBSS (hetteglass 1), og deretter lagre ved 4 ° C og bruk for senere isoleringer.Merk: Dette gir en oppløsning med en effektiv konsentrasjon av 10 mg av ovomucoid inhibitor og 10 mg albumin pr ml.
- Tilsett 5 ml EBSS (ampullen 1) til en papain ampulle (ampulle 2), hvilket gav en oppløsning med 20 enheter av papain / ml i 1 mM L-cystein med 0,5 mM EDTA. Kontroller at papain løsning synes klart når de er fullstendig oppløst, ellers plassere beholderen i et 37 ° C vannbad i ti minutter før papain er fullstendig oppløst for å sikre full aktivitet av enzymet.
- Legg 500 ul EBSS (ampullen 1) til en DNase ampulle (hetteglass 3) og bland forsiktig DNase som er følsom for skjær denaturering. Tilsett 250 ul av DNase-løsning til ampullen som inneholder papain, noe som resulterer i en sluttkonsentrasjon på omtrent 20 enheter / ml papain og 0,005% DNase. Lagre balansen av DNase ampullen for senere bruk.
- Plasser hakket rotte eller humant vev i papain oppløsning som fremstilt i trinn 4.4 over. For den menneskelige vev isolasjon, dele hakket vev likt mellom topapain ampuller (ca. 0,2 g / ampulle).
- Inkuber ved 37 ° C med konstant røring på en vippeplattform for å dissosiere vevet i den aktiverte løsningen papain. Inkuber rotte vev i 45 min til 1 time, og humant vev i 1 til 2 timer, avhengig av mengden av hakket vev, ca. 0,2 - henholdsvis 0,4 g.
- Triturer blanding med en 10 ml pipette for å dissosiere eventuelle gjenværende vev stykker for å gi en uklar cellesuspensjon. Overfør cellesuspensjonen (ikke inneholder noen biter av ikke-dissosiert vev) i et sterilt 15 ml konisk rør og sentrifuger ved 300 xg i 5 minutter ved romtemperatur.
- Resuspender de pelleterte celler i medium innehold ovomucoid, et papain-inhibitor.
- Forbered ovomucoid løsning ved å blande 2,7 ml EBSS (hetteglass 1) med 300 mL av den rekonstituerte albumin-ovomucoid inhibitor løsning (hetteglass 4) i en 15 ml konisk tube. Legg 150 mL av DNase løsning (hetteglass 3) lagret i trinn 4.4 ovenfor.
- Kast supernatanten frade pelleterte celler og umiddelbart cellepelleten suspenderes i fortynnet DNase albumin-inhibitor blanding.
- Separate intakte celler fra cellemembraner ved sentrifugering gjennom et enkelt trinn usammenhengende tettshetsgradient.
- Klargjør diskontinuerlig densitetsgradient ved å tilsette 5 ml av albumin-inhibitor oppløsning (hetteglass 4) til et 15 ml rør, og ved hjelp av en 5 ml pipette, forsiktig og langsomt lag cellesuspensjonen (fremstilt som beskrevet ovenfor i trinn 4,8) oppå albumin-inhibitor løsning.
- Sentrifuger ved 70 x g i 6 minutter ved romtemperatur.
- Merk: Grensesnittet mellom de to lagene i gradient bør være godt synlig, selv om minimal miksing på denne grensen ikke påvirker resultatet. Membranfragmenter forblir ved grenseflaten og dissosierte celler pellet på bunnen av røret.
- For rotteceller, kast supernatant og cellepelleten suspenderes i 1 ml rotte EFH medium (forvarmet ved 37 ° C).Antall levende celletetthet med et hemocytometer og plate av cellene i en T25 kulturflaske med en tetthet på 10 celler / mL i EFH. Den typiske Utbyttet av celler fra rotte-vev er ca. 2 x 10 6 celler med omtrent 80% viability.If klonale kulturer er ønsket, frø-celler ved en tetthet på mindre enn 10 celler / mL. Inkuber kolber ved 37 ° C i 5% CO2 og la kulturen å vokse uforstyrret i en uke for å unngå aggregering av kuler.
- For humane celler, kast supernatant og cellepelleten suspenderes i 10 ml av human EFH medium (forvarmet ved 37 ° C). Filtrer cellesuspensjonen gjennom et 40 mikrometer nylon celle sil fulgt med 30 ml EFH å fjerne myelin og cellemembran-fragmenter. Sentrifuger ved 300 xg i 5 minutter og cellepelleten suspenderes i 1 ml EFH medium.
- Antall levende celletetthet med et hemocytometer og plate de humane celler i 6-brønners kulturplater med en tetthet på 10 5 celler / brønn i et totalvolumav 5 ml EFH / brønn. Den typiske Utbyttet av celler fra humant vev er ca 1 x 10 6 celler med omtrent 70% levedyktighet. Pre-frakk brønner med en tilhenger substrat som Matrigel (se merknad nedenfor). Fortynn i et forhold på 40 ul Matrigel: 1 ml SFM.
- Merk: Alternativt kan andre klebende substrater så som poly-D-lysin / laminin, fibronektin, eller kollagen anvendes.
- Inkuber platene ved 37 ° C i 5% CO2 og la kulturen å vokse i ro i en uke.
5. aging av Adult rotte og menneskeryggmargs NSPCs
- Rotte NSPCs vil danne små neurosfærer ca 70 mikrometer i diameter innen 1 uke innledende seeding; passasje rotte NSPCs ukentlig ved å samle cellesuspensjonen, sentrifugering ved 300 xg i 5 min, og mekanisk triturering cellepelleten å dissosiere neurosfærene.
- Seed dissosiert cellene inn T25 kolber som inneholder fersk rotte EFH medium. Alternativtbruker 50% betinget rotte medium for aging. Den typiske utbyttet av rotte NSPCs på aging er ca 5 x 10 6 celler som øker eksponentielt med passering nummer.
- For de menneskelige kulturer, en uke etter den første plating, erstatte halvparten av kulturmedium med frisk EFH to ganger i uken for å la cellene til å følge underlaget. Generelt, 1 - 2 uker senere når cellene er festet til substratet, erstatte hele volumet av kulturmedium to ganger i uken med frisk EFH.
- Subkultur celler før de når samløpet mellom 4 - 8 uker.
- Subkultur celler ved å løsne cellene fra substratet enzymatisk (se tabell of Materials) med 2 ml av enzymet per brønn ble inkubert i ca. 10 minutter ved 37 ° C. Samle cellesuspensjon, sentrifuger ved 300 xg i 5 minutter og forsiktig cellepelleten suspenderes i 1 ml rykende EFH medium.
- Count levende celler med en hemocytometer og plate cellene i 6-brønners kulturplater (pre-korerte som ovenfor i trinn 4.12) ved en tetthet på 10 5 celler / brønn i et totalt volum på 5 ml EFH / brønn. Den typiske utbytte av menneskelige NSPCs på aging er ca 2 x 10 6 celler og generelt dette vil dobles med passering. Vanligvis opprettholde kulturer med 50% kondisjonerte EFH medium 2-3 ganger per uke mellom aging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voksen rotte ryggmargs celler dyrket i suspensjon kultur i EFH medium vil danne små neurosfærer (kolonier av udifferensierte celler) innen en uke etter første platekledning. I primærkulturer, vil de fleste av cellene belagt dø og vekstfaktor-responsive stamceller vil spre seg og er valgt for i EFH medium. Ved passasje 3, vil det være en rekke frittflytende neurosfærer omtrent 100 mikrometer i diameter (figur 2A). Neurosfærer er runde og fase-lys, og under høy forstørrelse, er cilia-lignende microspikes sett stikker ut fra celler på utsiden av kuler som er karakteristisk for neurosfærer i motsetning til klumper av cellerester (figur 2B). Den typiske Utbyttet av celler fra rotte-vev er ca. 2 x 10 6 celler med omtrent 80% levedyktighet. Neurosfærene bør ikke bli sådd ut ved en for høy tetthet for å unngå aggregering av cellegrupper. Også store neurosfærer bli vanskelig å distansere og cellene vil blinekrotisk i midten av kulen. Dette vil også skje hvis kulturer blir liggende for lenge før aging. I EFH kultur, voksen rotte ryggmargs NSPCs sprer (figur 2C) og uttrykke nestin (figur 2D) en markør for forløperceller, og lave nivåer av modne nevrale markører (data ikke vist).
Voksent menneske ryggmargs NSPC kulturer vokser ikke like raskt som rotte NSPC kulturer. Hvis humane ryggmargsceller blir først dyrket i suspensjon, vil de danne aggregater og uregelmessige klynger av små antall celler kombinert med rester (figur 3A). Påfølgende aging av disse kulturene ikke fremme anrikning av NSPC befolkningen. Imidlertid, når de humane cellene blir sådd ut i EFH på en tilhenger monolag, vekstfaktor-responsive NSPCs holder seg til substratet (figur 3B) og påfølgende utskifting media fjerner myelin og celleavfall (figur 3C). Den typiske utbyttet av calen fra menneskelig vev er ca 1 x 10 6 celler med ca 70% levedyktighet. Når den menneskelige NSPC kulturer blir godt etablert som en tilhenger enkeltlag, de NSPCs kan du da også belagt i suspensjonskulturer for å danne frittflytende neurosfærer. I EFH kultur, voksent menneske ryggmargs NSPCs proliferere (figur 3D) og uttrykker nestin (figur 3E) og Sox2 (figur 3F), en transkripsjonsfaktor vist å bli uttrykt av nevrale stamceller og meget lave nivåer av modne neurale markører (data ikke vist).
Figur 1. laminectomy av rotte ryggmarg og disseksjon av periventricular regionen. (A) på det eksponerte kaudal enden av ryggmargen, er Rongeurs innsatt extradurally inn i den laterale del av spinalkanalen. (B) Små kutt er gjort i arket på hver side av ryggvirvlene, og arket er nøye skrelles vekk for å eksponere ryggmargen. (C) Det eksponerte cervical ryggmargen etter laminektomi. (D) Skjematisk fremstilling av brystvirvel tverrsnitt som viser ryggmargen og plassering av kutt er gjort for laminektomi (avbildet med røde stiplede linjer). Lamellene og spinous prosess (skravert område) er fjernet. (E) Ryggmargen er kuttet tvers i 1 cm segmenter. (F) den overliggende hjernehinnene, hvit substans, og det meste av grå materie er nøye fjernes ved hjelp microscissors. (G ) Hakket periventricular vev. (H) tverrsnitt av rotte ryggmarg farget med Luxol rask blå og hemotoxylin og eosin med stiplet linje viser dissekert periventricular region. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Voksen rotteryggmargs NSPCs. (A) ved passering 3, er mange neurosfærer sett når rotteryggmargs NSPCs dyrkes i frittflytende suspensjon kultur. (B) Neurosfærer er fase-lys og microspikes stikker fra neurosfærene (piler ) er åpenbar ved høy forstørrelse. (C) dissosiert neurosfærer (passasje 3, dag 4) er belagt på Matrigel-belagte brønner i EFH medium, fast og immunostained og motfarget med Hoechst å visual kjerner (blå). I EFH forhold, voksen rotte ryggmargs NSPCs sprer (som vist med Ki67 farging), og (D) primært express nestin. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
fo: keep-together.within-side = "always"> 
Figur 3. voksent menneske ryggmargs NSPCs. (A) Når først belagt i kulturflasker, trenger voksne mennesker ryggmargs NSPCs ikke vokser godt. Primære frittflytende kulturer i EFH medium (13 dager etter plating) viser aggregater av celler og rester. (B) I motsetning til dette i primær adherente kulturer i EFH har NSPCs festet til substratet Matrigel (piler), vist ved 17 dager etter plating, og (C) på 41 dager in vitro. (D) I EFH medium, voksent menneske ryggmargs NSPCs spre seg, som vist med Ki67 immunofarging (26 dager in vitro vist), og primært express (E) nestin (26 dager i vitro vist) og (F) Sox2 (66 dager in vitro vist). Kjernene er motfarget med Hoechst (blå)./ftp_upload/52732/52732fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Under disseksjon av rotte ryggmarg vev forsiktighet bør utvises for ikke å skade ryggmargen mens du utfører laminektomi. Det er lettere å isolere periventricular vevet når ryggmargssegmenter er intakte. Vevet segmentene bør være fullt nedsenket i disseksjon buffer og de overliggende hjernehinnene og hvit substans kan bli kuttet bort som langsgående striper med microscissors. Alternativt kan fint vev tang brukes til å skrelle hvit substans unna.
For isoleringsprosedyren for NSPCs det benyttet en papain-EDTA dissosiasjon metode kombinert med mekanisk finfordeling å dissosiere rotte og human ryggmarg vev. Sammenlignet med andre proteaser, papain er mindre skadelig, men effektiv, som tidligere vist med dissosiering av postnatal rotte kortikale nevroner 11. Vi fant at dissosiasjon med bare mekanisk finmaling, ofte brukt sammen med føtalt vev, er ikke så effektiv med vev fra voksne. Etter the enzymatisk dissosiasjon, mekanisk finfordeling er viktig for å bryte opp de gjenværende vev fragmenter. Utgnidning med repeterende celle dispersjon med en pipette bør utføres slik at det ikke er noen gjenværende intakte vevfragmenter som resulterer i en uklar cellesuspensjon. Imidlertid bør triturering ikke utføres for sterkt for å unngå bobling av cellesuspensjonen og den resulterende celledød.
For aging, er rotte neurosfærer dissosiert til en enkelt cellesuspensjon via mekanisk finmaling, som opprinnelig ble beskrevet to. Imidlertid kan neurosfærer også bli dissosiert ved hjelp av enzymatiske fremgangsmåter så som trypsin-EDTA som ikke vil skade celleoverflatereseptorer eller forstyrre sfære dannelse så lenge enzymatisk eksponering er kort 12.
Det er en rekke fordeler ved bruk av neurosfærene assay for kulturen NSPCs. Det er relativt enkelt, reproduserbart, og gir mulighet for rask utbygging av nevrale stamceller cells 2,12. Imidlertid neurosfærer er heterogene består hovedsakelig av stamceller som er mer begrenset og bare et lite antall stamceller. Flere faktorer som for eksempel celletetthet og aging teknikk kan påvirke fenotypen av kulturene, og neurosfærer kan også dannes fra stamceller 13. Neurosfærer er meget bevegelige og kan smelte sammen selv under betingelser med lav celletetthet 14. Således antall neurosfærer i kulturen ikke representerer antall stamceller. Å diskriminere nevrale stamceller fra stamceller, bør man bruke det nevrale-kolonidannende celleanalyse 15,16.
Voksen rotte ryggmargs NSPCs vokse samt neurosfærer i suspensjon kultur i EFH supplert medium og er lett utvides. I kontrast, har vi funnet ut at voksne mennesker ryggmargs NSPCs vokse bedre som en tilhenger enkeltlag 10. Menneskelige hjerne-avledet nevrale stamceller kan opprettholdes på lang sikt i enkeltlag kulture i et kjemisk definert medium i nærvær av mitogener som fremmer deres proliferative kapasitet 17,18. Som beskrevet i denne protokollen, kan NSPCs isoleres fra voksent menneske ryggmargen fra organtransplanterte givere og passaged og utvidet som en tilhenger enkeltlag i nærvær av EGF, bFGF, og heparin 10. Det er lettere å isolere NSPCs fra yngre enn eldre givere som cellene utvide raskere, selv om NSPCs kan fortsatt bli isolert fra givere til vårt maksimale alder av 60 år 10. Vi har undersøkt en rekke tilfestede substrater som Matrigel, fibronektin, kollagen type I, og poly-D-lysin / laminin, og funnet at disse er effektive for tilslutning av voksne mennesker ryggmarg NSPCs 10. Utgangspunktet både neurosfære og tilhenger kulturer inneholde cellulære aggregater, rusk og døde celler. Men dette rusk blir gradvis fjernet med subdyrking og vekstfaktor-beriket Neurobasal medium velger for prolifererende NSPCs. Også rusk og myelin forurensning kan bli redusert med forsiktig disseksjon og fjerning av hvit substans fra ryggmargen vev segmenter. Filtrere resulterende cellesuspensjonen gjennom en sil før plating fjerner også myelin.
Vi har dyrkede voksent menneske ryggmargs NSPCs som adherente monosjikt i minst 9 måneder med omkring 10 passasjer, selv om det i eldre kulturer er det økt risiko for karyotypic abnormaliteter. Vi utførte karyotype analyse på menneske NSPCs dyrket i fire måneder og fant en normal diploid karyotype uten kromosomavvik (data ikke vist). Vi har også funnet at celleproliferasjon og evne til å differensiere til oligodendrocytter ble redusert med økt tid i kultur. For eksempel, den relative prosentandelen av O4 positive celler ble redusert fra 1,3% i en måned i kultur til 0,01% ved 4 måneder i kultur 10. Både rotte og menneske NSPCs er mottagelig for nedfrysing bruker standard frysing møtthods og viser ingen signifikante forskjeller i fenotypiske profil.
Isolasjon og utvidelse av multipotente NSPCs i kultur åpner for flere in vitro applikasjoner, inkludert undersøkelse av ulike faktorer på voksen nevrale stamceller differensiering. Økt antall NSPCs kan genereres in vitro og transplantert inn i dyremodeller, for eksempel ryggmargskade, slag, neurodegenerative sykdommer og for å undersøke reparative responsen av disse neural stamceller in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | Life Technologies | #10010023 | Dissection buffer |
| 1x HBSS | Life Technologies | #14175095 | Dissection buffer |
| D-glucose | Sigma | # G-6152 | Prepare 30% glucose stock solution for dissection buffer and hormone mix |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | #15140-148 | Dissection buffer and culture medium |
| Neurobasal-A | Life Technologies | #10888-022 | Culture medium |
| L-glutamine, 200 mM | Life Technologies | #25030-081 | Culture medium |
| B27 | Life Technologies | #12587010 | Culture medium |
| DMEM | Life Technologies | #11885084 | Hormone mix |
| F12 | Life Technologies | #21700-075 | Hormone mix |
| NaHCO3 | Sigma | # S-5761 | Prepare 7.5% NaHCO3 stock solution for hormone mix |
| HEPES | Sigma | #H9136 | Prepare 1M HEPES stock solution for hormone mix |
| Insulin | Sigma | #I-5500 | Hormone mix |
| Apo-transferrin | Sigma | #T-2252 | Hormone mix |
| Putrescine | Sigma | # P7505 | Hormone mix |
| Selenium | Sigma | #S-9133 | Hormone mix |
| Progesterone | Sigma | #P-6149 | Hormone mix |
| EGF, mouse | Sigma | #E4127 | Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium |
| EGF, human recombinant | Sigma | #E9644 | Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium |
| bFGF, human recombinant | Sigma | #F0291 | Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium |
| Heparin, 10,000 U | Sigma | #H3149 | Prepare 27.3 mg/ml stocks in hormone mix and aliquot; EFH medium |
| Papain dissociation kit | Worthington Biochemicals | #LK003150 | Contains EBSS, papain, DNase, ovomucoid protease inhibitor with BSA |
| Sodium Pentobarbital | Bimeda – MTC Animal Health Inc | DIN 00141704 | |
| Tissue Forceps: Addisons | Fine Science Tools | #11006-12 | Serrated standard tip; micro-tip also available |
| Fine Forceps: Dumont #4 | Fine Science Tools | #11241-30 | |
| Microscissors | Fine Science Tools | #15024-10 | Round-handled Vannas |
| Rongeurs | Bausch & Lomb | N1430 | |
| 10 mm Petri dishes | Nunc | 1501 | |
| T25 Culture flasks | Nunc | 156367 | |
| 40 μm nylon cell strainer | VWR | CA21008-949 | |
| 6 well plates | Nunc | CA73520-906 | |
| Matrigel, growth factor reduced (100x) | Corning | 354230 | Thaw according to directions and freeze aliquots; use diluted at a ratio of 40 μl Matrigel: 1 ml SFM |
References
- Gage, F. H.
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Gritti, A., et al. Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. J Neurosci. 16, 1091-1100 (1996).
- Morshead, C. M., et al. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
- Weiss, S., et al. Multipotent CNS stem cells are present in the adult mammalian spinal cord and ventricular neuroaxis. J Neurosci. 16, 7599-7609 (1996).
- Martens, D. J., Seaberg, R. M., van der Kooy, D. In vivo infusions of exogenous growth factors into the fourth ventricle of the adult mouse brain increase the proliferation of neural progenitors around the fourth ventricle and the central canal of the spinal cord. Eur J Neurosci. 16, 1045-1057 (2002).
- Kulbatski, I., et al. Oligodendrocytes and radial glia derived from adult rat spinal cord progenitors: morphological and immunocytochemical characterization. J Histochem Cytochem. 55, 209-222 (2007).
- Akesson, E., et al. Long-term culture and neuronal survival after intraspinal transplantation of human spinal cord-derived neurospheres. Physiol Behav. 92, 60-66 (2007).
- Dromard, C., et al. Adult human spinal cord harbors neural precursor cells that generate neurons and glial cells in vitro. J Neurosci Res. 86, 1916-1926 (2008).
- Mothe, A. J., Zahir, T., Santaguida, C., Cook, D., Tator, C. H. Neural stem/progenitor cells from the adult human spinal cord are multipotent and self-renewing and differentiate after transplantation. PLoS One. 6, e27079 (2011).
- Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. J Neurosci. 6, 3044-3060 (1986).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. , (2010).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nat Methods. 3, 801-806 (2006).
- Louis, S. A., Azari, H., Sharififar, S., Vedam-Mai, V., Reynolds, B. A. Neural-colony forming cell assay: an assay to discriminate bona fide neural stem cells from neural progenitor cells. J Vis Exp. , (2011).
- Louis, S. A., et al. Enumeration of neural stem and progenitor cells in the neural colony-forming cell assay. Stem Cells. 26, 988-996 (2008).
- Conti, L., et al. Niche-independent symmetrical self-renewal of a mammalian tissue stem cell. PLoS Biol. 3, e10 (2005).
- Pollard, S. M., Conti, L., Sun, Y., Goffredo, D., Smith, A. Adherent neural stem (NS) cells from fetal and adult forebrain. Cereb Cortex. 16, Suppl 1. i112-i120 (2006).
