Isolering av neurala stamceller / progenitorceller från periventrikulär regionen vuxen råtta och humant ryggmärgs
Summary
The adult mammalian spinal cord contains neural stem/progenitor cells (NSPCs) that can be isolated and expanded in culture. This protocol describes the harvesting, isolation, culture, and passaging of NSPCs generated from the periventricular region of the adult spinal cord from the rat and from human organ transplant donors.
Abstract
Vuxen råtta och människa ryggmärgen neurala stam / progenitorceller (NSPCs) odlade i tillväxtfaktor berikade mediet tillåter spridningen av multipotenta, självförnyande och expander neurala stamceller. I serumbetingelser, kommer dessa multipotenta NSPCs differentiera, att alstra neuroner, astrocyter och oligodendrocyter. Den skördade vävnaden enzymatiskt dissocierade i en papain-EDTA-lösning och därefter dissocierades mekaniskt och separeras genom en diskontinuerlig densitetsgradient för att ge en enkelcellsuspension som pläteras i Neurobasal-medium kompletterat med epidermal tillväxtfaktor (EGF), basisk fibroblasttillväxtfaktor (bFGF ), och heparin. Vuxen råttryggmärgs NSPCs odlas som fritt flytande neurosfärer och vuxna mänskliga ryggmärgen NSPCs odlas som vidhäftande kulturer. Under dessa förhållanden, vuxna ryggmärgen NSPCs föröka, express markörer av prekursorceller, och kan kontinuerligt utökas vid passage. Dessa celler kan be studeras in vitro som svar på olika stimuli, och exogena faktorer kan användas för att främja härstamning restriktion för att undersöka neurala stamcellsdifferentiering. Multi NSPCs eller deras avkomma kan också transplanteras till olika djurmodeller för att bedöma regenerativ reparation.
Introduction
NSPCs är multipotenta celler åtagit sig att den neurala härstamning som kan själv förnya och lätt expandera in vitro. Vi hänvisar till dessa celler som en blandad population av neurala stam / progenitorceller eftersom de visar egenskaper hos självförnyande multipotenta stamceller och mer begränsade föregångare. NSPCs finns i både den fetala och vuxna hjärnan och ryggmärgen 1,2. I den vuxna, NSPCs är normalt vilande och uppehålla sig inom specifika nischer inklusive subventrikulära zonen kantar de laterala ventriklama 2-4, och den periventrikulära region som omger den centrala kanalen av ryggmärgen 5,6.
Typiskt NSPCs odlas som fritt flytande neurosfärer eller som vidhäftande monoskikt i serumfritt medium kompletterat med EGF och bFGF, mitogener vilka selekterar för de stam / stamfadercellpopulationer. Den neurosphere analysen som ursprungligen utvecklades av Reynolds och Weiss 2, används oftast för kultur ochexpandera neurala stamceller. NSPCs visar multipotens när de stryks ut i tillväxtfaktorfritt medium innehållande serum, differentiera till neuron, astrocyter och oligodendrocyter. Multi kan självförnyande NSPCs isoleras och odlas från vuxna gnagare ryggmärgen när den odlade vävnaden innefattar regioner i centrala kanalen 6,7. En potentiell fördel med att använda NSPCs genereras från den vuxna ryggmärgen i motsats till att skapa celler från andra regioner är att dessa vävnadsspecifika celler liknar närmast celler i ryggmärgen som går förlorade eller skadas efter skada eller sjukdom.
Tidigare arbete har visat att neurosfärer härrör från vuxen människa ryggmärgen inte kunde förökas långvarig eller passerades för att generera ett tillräckligt antal celler 8,9. Men med modifieringar i odlingsbetingelser, rapporterade vi expansion och transplantation av vuxna människor ryggmärgs härrörande NSPCs, visar att självförnyandeoch multi NSPCs kan isoleras från vuxen människa ryggmärgen hos organtransplanterade donatorer 10. Främst, avlägsnande av det mesta av den vita substansen under dissekering och odla dessa celler på en vidhäftande substrat i tillväxtfaktor-anrikade mediet ut för prolifererande adulta humana ryggmärgen NSPCs. I detta protokoll beskriver vi skörden av ryggmärgen från vuxna råttor och från humana organtransplanterade givare, dissektion av periventrikulär vävnad och isolering, kultur och utbyggnad av NSPCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Under dissektion av råttans ryggmärg försiktighet bör iakttas att inte skada ryggmärgen när de utför laminektomi. Det är lättare att isolera periventrikulär vävnaden när ryggmärgssegmenten är intakta. De vävnadssegment bör vara helt nedsänkt i dissektion buffert och överliggande hjärnhinnor och vit substans kan skäras bort som längsgående remsor med microscissors. Alternativt kan fin vävnad pincett kan användas för att skala den vita substansen bort.
För isoleringsf…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge support from Spinal Cord Injury Ontario, the Ontario-China Research and Innovation Fund, the Toronto General and Western Hospital Foundation, and Physicians’ Services Incorporated Foundation. The authors thank Dr. Tasneem Zahir for expert advice in human spinal cord NSPC culture, and Drs. Cindi Morshead and Iris Kulbatski for their expert advice in rat spinal cord NSPC isolation.
Materials
| 1X PBS | Life Technologies | #10010023 | Dissection buffer |
| 1X HBSS | Life Technologies | #14175095 | Dissection buffer |
| D-glucose | Sigma | # G-6152 | Prepare 30% glucose stock solution for dissection buffer and hormone mix |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | #15140-148 | Dissection buffer and culture medium |
| Neurobasal-A | Life Technologies | #10888-022 | Culture medium |
| L-glutamine, 200mM | Life Technologies | #25030-081 | Culture medium |
| B27 | Life Technologies | #12587010 | Culture medium |
| DMEM | Life Technologies | #11885084 | Hormone mix |
| F12 | Life Technologies | #21700-075 | Hormone mix |
| NaHCO3 | Sigma | # S-5761 | Prepare 7.5% NaHCO3 stock solution for hormone mix |
| HEPES | Sigma | #H9136 | Prepare 1M HEPES stock solution for hormone mix |
| Insulin | Sigma | #I-5500 | Hormone mix |
| Apo-transferrin | Sigma | #T-2252 | Hormone mix |
| Putrescine | Sigma | # P7505 | Hormone mix |
| Selenium | Sigma | #S-9133 | Hormone mix |
| Progesterone | Sigma | #P-6149 | Hormone mix |
| EGF, mouse | Sigma | #E4127 | Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium |
| EGF, human recombinant | Sigma | #E9644 | Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium |
| bFGF, human recombinant | Sigma | #F0291 | Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium |
| Heparin, 10000U | Sigma | #H3149 | Prepare 27.3 mg/ml stocks in hormone mix and aliquot; EFH medium |
| Papain dissociation kit | Worthington Biochemicals | #LK003150 | Contains EBSS, papain, DNase, ovomucoid protease inhibitor with BSA |
| Sodium Pentobarbital | Bimeda – MTC Animal Health Inc | DIN 00141704 | |
| Tissue Forceps: Addisons | Fine Science Tools | #11006-12 | Serrated standard tip; micro-tip also available |
| Fine Forceps: Dumont #4 | Fine Science Tools | #11241-30 | |
| Microscissors | Fine Science Tools | #15024-10 | Round-handled Vannas |
| Rongeurs | Bausch & Lomb | N1430 | |
| 10mm Petri dishes | Nunc | 1501 | |
| T25 Culture flasks | Nunc | 156367 | |
| 40 μm nylon cell strainer | VWR | CA21008-949 | |
| 6 well plates | Nunc | CA73520-906 | |
| Matrigel, growth factor reduced (100X) | Corning | 354230 | Thaw according to directions and freeze aliquots; use diluted at a ratio of 40 μl Matrigel: 1 ml SFM |
References
- Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287, 1433-1438 (2000).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Gritti, A., et al. Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. J Neurosci. 16, 1091-1100 (1996).
- Morshead, C. M., et al. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
- Weiss, S., et al. Multipotent CNS stem cells are present in the adult mammalian spinal cord and ventricular neuroaxis. J Neurosci. 16, 7599-7609 (1996).
- Martens, D. J., Seaberg, R. M., van der Kooy, D. In vivo infusions of exogenous growth factors into the fourth ventricle of the adult mouse brain increase the proliferation of neural progenitors around the fourth ventricle and the central canal of the spinal cord. Eur J Neurosci. 16, 1045-1057 (2002).
- Kulbatski, I., et al. Oligodendrocytes and radial glia derived from adult rat spinal cord progenitors: morphological and immunocytochemical characterization. J Histochem Cytochem. 55, 209-222 (2007).
- Akesson, E., et al. Long-term culture and neuronal survival after intraspinal transplantation of human spinal cord-derived neurospheres. Physiol Behav. 92, 60-66 (2007).
- Dromard, C., et al. Adult human spinal cord harbors neural precursor cells that generate neurons and glial cells in vitro. J Neurosci Res. 86, 1916-1926 (2008).
- Mothe, A. J., Zahir, T., Santaguida, C., Cook, D., Tator, C. H. Neural stem/progenitor cells from the adult human spinal cord are multipotent and self-renewing and differentiate after transplantation. PLoS One. 6, e27079 (2011).
- Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. J Neurosci. 6, 3044-3060 (1986).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. , (2010).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres–re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nat Methods. 3, 801-806 (2006).
- Louis, S. A., Azari, H., Sharififar, S., Vedam-Mai, V., Reynolds, B. A. Neural-colony forming cell assay: an assay to discriminate bona fide neural stem cells from neural progenitor cells. J Vis Exp. , (2011).
- Louis, S. A., et al. Enumeration of neural stem and progenitor cells in the neural colony-forming cell assay. Stem Cells. 26, 988-996 (2008).
- Conti, L., et al. Niche-independent symmetrical self-renewal of a mammalian tissue stem cell. PLoS Biol. 3, e10 (2005).
- Pollard, S. M., Conti, L., Sun, Y., Goffredo, D., Smith, A. Adherent neural stem (NS) cells from fetal and adult forebrain. Cereb Cortex. 16, i112-i120 (2006).
