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Developmental Biology

DNA的特定染色甲基绿在胚胎的荧光标记的应用

doi: 10.3791/52769 Published: May 2, 2015

Protocol

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1.净化染料

  1. 通过将0.4g污点粉末在10ml蒸馏水制备甲基绿的4%水溶液。调匀,直至完全溶解它。
  2. 在通风罩,具有至少2份氯仿混合。事先检查管是否氯仿抗性是重要的。
  3. 调匀,离心1分钟,在2000 XG加速相分离。
  4. 离心后,上层水相用甲基绿,并用氯仿下​​部的有机相和通常的杂质结晶紫被获得。
  5. 恢复上相和,直到下阶段似乎完全没有结晶紫重复此步骤。
  6. 在结束时,上层相回收并用水稀释至2%甲基绿的最终浓度。此原液是稳定在工作台上数月,不需要避光。

  1. 固定在磷酸盐缓冲盐水(PBS)将胚过夜在4%甲醛(从多聚甲醛)。
    注意:这可能需要从几个小时至过夜取决于胚的厚度。在这个例子中,我们固定48小时后受精(HPF)斑马鱼的胚胎过夜。
  2. 在PBS-T(1%的Triton X-100的PBS)中5分钟洗胚胎三次。升高浓度的洗涤剂permeabilizes角质层。
  3. 制备1:5,000-1:于PBS-T的万溶液甲基绿的(从2%原液)。洗涤剂的温育过程中的存在对于厚的样品,如斑马鱼的胚胎和幼虫是有用的。
  4. 孵育至少6小时,溶液中的胚胎在4℃下,用温和的摇摆。再次,胚胎的厚度为保温时间校准参数。
  5. 洗胚胎3恬西文用PBS 30分钟以除去洗涤剂过量。当结合于DNA甲基绿荧光只有明显,与未结合的分子,因此背景是微不足道的。
  6. 在山出土的幻灯片或自制室安装液(75%甘油,0.1米的Tris·HCl的pH值为8)。
    注意:如果核染色免疫标记后进行,甲基绿可以合并到工作浓度的安装解决方案,而无需冲走。
  7. 店内冷藏或立即启动成像。用激光扫描共聚焦(或其它荧光)显微镜激发在设定为650-750毫微米考虑到甲基绿色发射在677毫微米达到其最大登记633纳米和发射滤光片进行摄像。
    注意:我们提供了甲基绿色发射轮廓的测量数据,也可以装载到采集软件,作为补充材料。

3.荧光核圣使用甲基绿全鸡胚癌宁

  1. 孵育受精鸡蛋到感兴趣的阶段。过夜在4%甲醛(从仲甲醛)的PBS固定的胚胎在4℃。在PBS-T 2小时洗胚胎3次。
  2. 制备1:5,000-1:于PBS-T的万溶液甲基绿的(从2%原液)。孵育在染色液胚胎过夜,在4℃。洗胚胎3次在PBS中,每1小时。安装在腔室用75%甘油,0.1M的Tris,pH为8。

4.成像荧光标记的细胞核中全安装胚胎

  1. 通过坚持电气胶带几层在显微镜载玻片,并仔细制备成像室切孔进入它用手术刀以放置胚胎内。这将防止胚胎成像过程中破碎。
  2. 小心地将胚胎室75%甘油,0.1M的Tris-HCl,pH值为8转移到成像室,并填写顶端到空洞形成气泡。
  3. 盖上#0盖玻片避免或消除介质四溢。指甲油密封。
  4. 获取标本的图像上搭载了633激发滤光片或激光线荧光显微镜。
    注:排放过滤器应涵盖677最大发射甲基绿的。

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Representative Results

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厚标本核染色。本文描述的协议允许实现深层结构整体胚胎均匀染色。显影透镜晶核形式48 HPF斑马鱼胚胎中均匀标记( 图1)。

甲基绿DNA染色允许的细胞周期依赖性的形态差异判别如核分裂或凋亡细胞核( 图2A)的鉴定。在高分辨率亚核结构也是明显所示为斑马鱼胚胎( 图2B)的表皮细胞核。

甲基绿是耐在高强度照射光漂白的时间延长周期。当用633纳米激光在同一强度照射,甲基绿核染色不漂白出来,因为它是另一种DNA特异性染色共享相似的光谱特征的情况下,TO-PRO-34。一个整体式的斑马鱼胚胎的视网膜的共焦面被选择并放大具有63×1.4NA物镜,以实现高的照射。缩小时,样品染色的TO-PRO-3表明60秒连续照射( 图3,上图)的范围内漂白,同时染色甲基绿的标本显示在相同条件下漂白甚至在120秒没有可见证据( 图3,下图)。在拉萨夫软件获取的图像进行进一步处理(亮度/对比度;三维重建;最大强度投影)斐济使用开放源码软件(http://fiji.sc/)。

图1
图1:用甲基绿深层结构的均匀核染色在Z投影物O开发一个48 HPF斑马鱼胚胎沾上甲基绿(MG)的镜头F 20飞机共聚焦。胚胎进行复为F-肌动蛋白与TRITC标记的鬼笔(蝴蝶兰)。比例尺:15微米。

图2
图2:核形态和甲基绿染色 A)在48 HPF斑马鱼胚胎的表皮不同形态的核亚核分辨率。 MG,甲基绿。标本进行复为F-肌动蛋白与TRITC - 鬼笔。箭头:有丝分裂细胞。 10架飞机共聚焦最大强度投影。 B)的鸡胚神经板标示以相同的方式,显示有丝分裂的细胞(箭头)和固缩核(箭头)。单焦面。 C)一个斑马鱼胚胎的表皮细胞核在高放大倍率,显示出亚核分辨率的高度三单共焦面。比例尺:A,15微米; B,5微米; C,1微米。


图3:连续激发下甲基绿的光稳定性的TO-PRO-3染色48 HPF斑马鱼视网膜细胞核进行漂白后60秒连续激发的在633nm处(上图)。在相同条件下,甲基绿染色的胚胎(MG)没有表现出可察觉的漂白,复制的曝光时间(下图)时也是如此。漂白和采集被扫描在单架飞机,在8000赫兹,30%的激光功率和线(×2)和框架(4个)平均。比例尺:30微米。

波长(nm) %的排放量
640 21.37
643 27.5
646 36.69
44.47
652 53.92
655 61.82
658 67.86
661 83.2
664 85.22
667 89.45
670 87.33
673 92.3
676 100
679 97.41
682 90.34
685 83.32
78.37
691 76.09
694 73.95
697 67.36
700 64.4
703 61.26
706 56.39
709 55.06
712 49.56
715 46.​​12
718 41.4
721 38.8
724 35.97
33.27
730 30.95
733 28.78
736 26.28
739 24.96
742 23.3
745 21.12
748 19.86
751 17.47
754 16.14
757 14.21
760 12.45
763 11.49
9.97
769 7.55
772 7.75
775 6.46
778 5.76
781 4.38
784 2.6
787 2.75
790 2.27
793 1.52
796 0

补充材料1:甲基绿核染色下633 nm激发发射光谱。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Methyl green Dr. G. Grübler Also tested Sigma-Aldrich 323829, which is crystal violet-free
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
Laser scanning confocal microscopy Leica TCS-SP5 Leica Microsystems
Phalloidin–Tetramethylrhodamine B isothiocyanate Sigma-Aldrich
P1951 
chloroform Sigma-Aldrich 372978
Centrifuge 5810 R eppendorf 5811 000.010  
microscope slides Deltalab D100004
cover slips Esco optics R525025

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References

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Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. Application of the DNA-Specific Stain Methyl Green in the Fluorescent Labeling of Embryos. J. Vis. Exp. (99), e52769, doi:10.3791/52769 (2015).More

Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. Application of the DNA-Specific Stain Methyl Green in the Fluorescent Labeling of Embryos. J. Vis. Exp. (99), e52769, doi:10.3791/52769 (2015).

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